2021, Vol. 28 
日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称青虾、河虾、大眼贼，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)[1]，广泛分布于我国各淡水水体，是一种经济价值较高的经济虾类[2]。随着水产养殖业的快速发展，日本沼虾养殖群体逐渐面临种质资源退化、生长速率缓慢、抗病力下降、规格变小及性早熟等一系列问题；此外，由于过度开发利用及天然生境的变化等诸多因素的复合影响，野生日本沼虾种质资源也逐渐衰竭、多样性降低[3-4]。河南省地处中国南北交界处，境内分布有长江、黄河、淮河和海河等四大水系，水系丰富，地形复杂，日本沼虾资源较为丰富；此外，继黄河鲤(Cyprinus carpio)、淇河鲫(Carassius auratus, in Qihe River)国家级水产种质资源保护区在2007年建设后，日本沼虾资源比较丰富的信阳光山及漯河澧河也在2008年和2015年相继被列为国家级水产种质资源保护区，日本沼虾种质资源保护得到了越来越多的关注[5-6]。因此，种质资源研究对于河南境内日本沼虾种质资源的保护和合理开发利用具有十分重要的现实意义。
目前，通过DNA分子标记进行种群遗传多样性研究已经成为种质资源评价的主要手段之一。作为重要的经济虾类，日本沼虾的遗传多样性研究相对其他淡水虾类较为丰富，其中李新正等[7]首先对我国长臂虾总科的系统发育关系进行了系统研究调查，为后续日本沼虾相关研究奠定了基础，此后冯建彬等[8]、Yang等[9]利用线粒体细胞色素C氧化酶I (cytochromec oxidase subunit I, COI)基因对五大湖、长江与澜沧江水系的日本沼虾开展了群体遗传多样性研究。此外，基于随机扩增多态DNA (RAPD)技术及简单重复序列中间区域(ISSR)标记技术对日本沼虾进行群体遗传学分析也有报道[10-11]。我们对河南境内虾类资源调查的前期结果显示，相对于其他淡水虾类而言，日本沼虾在河南境内四大水系均有广泛分布，且数量较大，为显著优势物种，但是其遗传多样性研究尚未开展。此外，前人有关河南境内鱼类的种群遗传学研究显示，四大水系的种群表现出不同程度的遗传分化[12-13]，而河南境内的日本沼虾遗传多样性情况以及不同水系间是否存在分化尚未见报道。
目前线粒体COI基因已被普遍应用于日本沼虾种群遗传学研究[8-9]，本研究采集了河南境内18个野生日本沼虾群体，基于常用的线粒体分子标记COI基因研究其遗传多样性和种群结构，并评估河南境内日本沼虾种质资源现状，为其种质资源的健康可持续发展和开发利用提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料2012年至2020年，在进行河南境内虾类资源调查期间，采集了大量日本沼虾样品，选取其中18个地理群体135尾日本沼虾样本作为研究对象(表1)，样本覆盖河南境内长江、黄河、淮河和海河等四大水系(图1)。采集的日本沼虾直接浸泡于95%的乙醇溶液中带回实验室保存备用。
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表1 日本沼虾采样信息 Tab. 1 Sampling information of Macrobrachium nipponense |
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图1 河南境内水系日本沼虾采样点位示意图红色–长江水系；黄色–黄河水系；绿色–淮河水系；蓝色–海河水系. Fig. 1 Sampling locations of the Macrobrachium nipponense in Henan Provincered–the Yangtze River basin; yellow–the Yellow River basin; green–the Huaihe River basin; blue–the Haihe River basin. |
取约0.01 g日本沼虾腹部肌肉组织，采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA[14]。用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop微量紫外分光光度计分别检测基因组DNA的质量与浓度，并于–20 ℃保存备用。
扩增线粒体COI基因引物为LCO1490: 5′-GG- TCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′, HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[15]，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为30 µL，包含：2×Es Taq Master Mix 15 µL，正反向引物各1.5 µL, DNA模板1 µL (100 ng)，无菌双蒸水11 µL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 54 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 35个循环；72 ℃终延伸7 min, 4 ℃保存[8]。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工生物工程有限公司进行单向测序(引物：LCO1490)。
1.3 数据分析测序获得的DNA序列采用Lasergene v7.1软件包中的SeqMan[16]软件进行人工核查、校正及组装拼接。拼接完成的序列用BioEdit[17]软件进行多重比对，剪切掉冗余片段获得一致序列备用。用DnaSP 5.0[18]软件计算DNA序列的单倍型个数(haplotypes number, h)、单倍型多样性(haplotype diversity, Hd)和核苷酸多样性(nucleotide diversity, π)等遗传多样性参数。用MEGA 7.0[19]软件计算序列碱基组成、变异位点、简约信息位点及组内、组间遗传距离等参数；根据长臂虾科的系统发育关系，选取秀丽白虾(Palaemon modestus)为外类群[7]，设置bootstrap值为1000检验置信度，根据最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统进化树。
用Arlequin 3.5[20]进行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)以估算遗传变异在不同水系间的分布及遗传分化系数(F-statistics, FST)，进而评估不同水系日本沼虾群体的遗传分化程度；为探究其种群历史动态，进行Fu’s Fs和Tajima’s D中性检验(neutrality test)及错配分布分析(mismatch distribution analysis)，以评估其群体是否发生种群扩张。采用Network 5.0[21]软件中的Median-Joining法构建日本沼虾的单倍型网络图，以分析其单倍型演化关系。用BEAST v1.7.4[22]软件进行Bayesian Skyline Plot (BSP)分析估算日本沼虾种群历史动态的变化，采用1.4%的COI基因进化速率[23]，由Tracer v1.5[24]生成贝叶斯天际线点图(Bayesian skyline plot, BSP)。
2 结果与分析 2.1 COI基因序列特征本研究共测序获得135条COI序列，去除冗余片段后，得到长度613 bp的一致序列。经比对分析，日本沼虾线粒体COI基因共包含变异位点(V) 45个，占总位点数的7.3%，其中简约信息位点(Pi) 27个，单变异位点(S) 18个，转换与颠换的比值为4.34∶1；序列T、C、A、G碱基的平均含量分别为29.1%、22.6%、29.3%和19.0%，其中(A+T)%为58.4%, (G+C)%为41.6%，符合节肢动物门普遍AT含量较高的特点。
2.2 种群遗传多样性日本沼虾群体的遗传多样性参数见表2, 135尾日本沼虾样品共包含27个单倍型，其中20个单倍型为单个群体独享，7个单倍型为共享单倍型，其中单倍型Hap1是包含个体数最多的单倍型，被4个水系15个群体57个个体所共享，其次为单倍型Hap2，被4个水系7个群体20个个体所共享。日本沼虾各群体单倍型多样性范围在0.00000~0.93333，群体平均单倍型多样性为0.78574，其中A04、E14、G04群体单倍型多样性(Hd=0.00000)最低，各自均只有一个单倍型，B07群体单倍型多样性(Hd=0.93333)最高；核苷酸多样性范围在0.00000~0.01658，群体平均核苷酸多样性为0.01059，其中A04、E14、G04群体核苷酸多样性(π=0.00000)最低，R20群体核苷酸多样性(π=0.01658)最高(表2)。分析结果显示，A04、E14及G04群体无论单倍型多样性还是核苷酸多样性均最低，B07、R20、K08等群体则显示出相对较高的遗传多样性，且整体而言，长江水系显示出更高的遗传多样性，且其平均单倍型多样性(Hd=0.74823)及核苷酸多样性(π=0.01149)均远高于其他3个水系。
2.3 种群遗传结构通过MEGA 7.0软件对日本沼虾群体进行成对遗传距离的计算可知，日本沼虾群体内遗传距离为0.000~0.017，其中A04、E14、G04群体组内遗传距离最小，仅为0.000, R20群体组内遗传距离最大为0.017；两两群体间的遗传距离为0.000~ 0.029，其中E14与G04群体组间遗传距离最小，为0.000, A04与M08群体组间遗传距离最大为0.029。18个日本沼虾群体中，A04、E14、G04共3个群体的组内遗传距离(0.0000)最小，其中A04群体与其他群体之间的组间遗传距离均较大，除与R20和C36群体组间遗传小于0.02外，其与其他各组组间遗传距离均大于等于0.02；其次是C36群体，其与其他各群体的组间遗传距离也相对较大(表3)。
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表2 河南境内四水系日本沼虾群体的遗传多样性信息 Tab. 2 Genetic diversity of Macrobrachium nipponense populations from 4 river systems in Henan Province |
日本沼虾群体间的遗传分化系数FST (表3)为–0.167~1.000，对FST值进行差异显著性检验，结果显示，A04、C36、R17、R19、B07群体与其他多数群体都存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的遗传差异，其中A04群体与P16、S19群体外的所有群体均达高度遗传分化(FST>0.25)，且遗传分化均达到极显著水平(P<0.01)，而C36群体与R19、R20、B07、K08、S19和E10共6个群体外的其他群体均达高度遗传分化(FST>0.25)，且遗传分化均达到极显著水平(P<0.01)。遗传分化系数FST与成对遗传距离结果相一致，均显示A04和C36群体与其他群体间存在较大的遗传分化。
对河南境内4个水系日本沼虾群体进行分子方差分析(AMOVA)，结果显示(表4)日本沼虾的遗传变异主要来源于群体内个体间，占总变异的66.03%，群体间遗传变异占40.22%。
以秀丽白虾(Palaemon modestus) (GenBank登录号：MK412768)作为外类群，用MEGA 7.0软件构建日本沼虾18个群体的ML系统进化树(图2a)，结果显示日本沼虾不同群体间没有随地理和水系分布形成单独的分支，群体间系统进化关系呈交叉式嵌套，无明显水系和地理分化。
用Network5.0软件绘制单倍型网络图(图2b)，由图可知，日本沼虾群体各水系单倍型之间未形成明显的地理结构，不同水系和群体间均存在单倍型共享的情况。除Hap2、Hap6、Hap7、Hap14具有少量拓展单倍型外，单倍型Hap1拓展单倍型最多，推测单倍型Hap1可能为日本沼虾适应环境变化而形成的适应性较强、抵抗性较高的稳定群体。
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表3 河南境内四水系日本沼虾群体间遗传分化指数(FST，对角下方)、群体内遗传距离(对角线，粗体)和群体间遗传距离(对角上方) Tab. 3 Pairwise FST (below diagonal), genetic distance within populations (diagonal bold) and genetic distance (above diagonal) among Macrobrachium nipponense populations from 4 river systems in Henan Province |
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表4 河南境内四大水系日本沼虾群体AMOVA分析 Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) among Macrobrachium nipponense populations from 4 river systems in Henan Province |
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图2 基于COI基因构建的河南境内四水系日本沼虾的ML系统进化树(a)及单倍型网络图(b) Fig. 2 The ML maximum likelihood phylogenetic tree (a) and network of haplotype (b) of Macrobrachium nipponense from 4 river systems in Henan Province based on COI gene sequences |
研究采用中性检验、错配分布及BSP分析3种方法相结合，对河南境内不同水系日本沼虾的种群历史动态进行分析。中性检测结果(表2)显示，河南境内日本沼虾群体Tajima’s D检验为负值(Tajima’s D=–0.52984)，但无显著差异，Fu’s Fs检验为3.234，且呈现出显著差异(P<0.05)；错配分布显示日本沼虾不同水系群体及整体的错配分布曲线均呈多峰型(图3a~e)，故推测河南境内日本沼虾种群呈现相对稳定状态，近期未发生过种群扩张事件。为进一步估算日本沼虾群体的种群历史动态，用BEAST软件对其不同水系群体及整体进行BSP分析，结果显示日本沼虾不同水系种群和群体整体均保持稳定的趋势(图4a~e)。
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图3 河南境内四水系日本沼虾种群错配分布分析a：长江水系；b：黄河水系；c：淮河水系；d：海河水系；e：总体. Fig. 3 Mismatch distribution analysis of Macrobrachium nipponense populations from 4 river systems in Henan Provincea: Yangtze River; b: Yellow River; c: Huaihe River; d: Haihe River; e: total. |
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图4 河南境内四水系日本沼虾群体贝叶斯天际线点图a：长江水系；b：黄河水系；c：淮河水系；d：海河水系；e：总体. 黑线表示种群大小，蓝色线包含区域表示95%置信区间。 Fig. 4 BSP (Bayesian skyline plots) of Macrobrachium nipponense populations from 4 river systems in Henan Provincea: Yangtze River; b: Yellow River; c: Huaihe River; d: Haihe River; e: total. The black line represents population size, and the blue line covering areas represent 95% confidence intervals. |
遗传多样性是物种长期进化的产物，可以反映生物群体发展进化的潜力大小以及对环境变化适应能力的强弱[25]。作为遗传多样性的重要指标核苷酸多样性在一定程度上比单倍型多样性更能反映群体的遗传多性[26]。通过对河南境内4个水系18个地理群体日本沼虾135个样本的线粒体COI基因进行遗传多样性分析，结果显示河南境内日本沼虾群体共包含27个单倍型，其群体平均单倍型多样性(Hd=0.78574)及核苷酸多样性(π=0.01059)均低于我国五大湖(Hd=0.919, π=0.01253)、长江和澜沧江日本沼虾群体(Hd=0.878, π=0.01744)的平均值，且整体而言，河南境内日本沼虾群体表现出高Hd低π的特点，这与其他日本沼虾群体的遗传多样性研究结果相一致[8-9]。
日本沼虾18个群体27个单倍型中淮河水系A04群体、海河水系的E14及G04群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均为最低(Hd=0.00000, π=0.00000)，或因其生活环境为水库、人造湖、公园等半封闭式水体，与外界基因交流相对较少；长江水系R20群体(Hd=0.86667, π=0.01658)、黄河水系B07群体(Hd=0.93333, π=0.01361)及淮河水系K08群体(Hd=0.93333, π=0.01487)的单倍型数和单倍型多样性均处在群体较高水平；遗传多样性分析结果显示，长江水系日本沼虾群体平均遗传多样性最高(Hd=0.74823, π=0.01149)，表明长江水系日本沼虾群体目前还保持了比较高的遗传多样性，这与Yang等[9]和傅洪拓等[27]的研究结果相一致，黄河水系(Hd=0.64667, π=0.00663)和海河水系(Hd=0.64827, π=0.00662)次之，淮河水系日本沼虾群体遗传多样性最低(Hd=0.60826, π= 0.00617)，这可能与该地域以日本沼虾作为重要经济水产品和食用产品而进行人工捕捞及开发利用有一定关系，人为的干扰因素一定程度上导致了日本沼虾群体遗传多样性水平的衰退。
3.2 河南境内日本沼虾的遗传结构对河南境内日本沼虾群体进行成对遗传距离和遗传分化指数计算，结果显示，淮河水系A04群体、海河水系的E14及G04群体组内遗传距离为0.000。但是该群体与其他群体之间组间遗传距离相对较大。此外黄河水系C36群体和其他群体也存在较大遗传分化，推测可能由于生活环境较为封闭，与外界基因交流存在一定阻隔，导致日本沼虾遗传分化水平不高。FST值作为衡量群体遗传分化的重要指标显示，A04群体为遗传分化最显著的群体，达到高度遗传分化水平(FST>0.25)，其次是C36、E14、G04群体，其他各群体整体遗传分化水平不高。分子方差分析(AMOVA)结果表明，日本沼虾的遗传变异主要来源于种群内，群体内变异(66.03%)远大于群体间遗传变异(40.22%)，这与日本沼虾群体遗传分化系数FST相一致，当群体内变异大于群体间变异时遗传分化系数FST则会呈现负值。
单倍型网络显示，日本沼虾群体27个单倍型中Hap1和Hap2单倍型广泛分布于各个水系，出现频率也较高，分别为57次和20次，说明该单倍型可能相对稳定且对外界环境的适应能力较强，结果显示各单倍型在各个水系的分布亦无显著的地理和水系差别。河南境内日本沼虾群体COI基因的系统发育结果显示，4个水系日本沼虾群体呈交叉分布，无显著水系分化。单倍型网络显示出与系统发育树相似的结果，四大水系存在7个共享单倍型，表明河南境内4个水系日本沼虾群体间存在一定的基因交流。据史料记载，河南曾发生过黄河改道、水系变迁等地质事件，且长江、黄河、淮河等流域均爆发过洪泛灾害。此外，引黄济卫、南水北调等水系工程的建设和改造，也加强了各大水系之间的沟通连接[28-30]。因此，河南境内不同水系日本沼虾种群可能因水系之间相互连通而存在一定基因交流，从而未产生显著水系分化。此外，作为重要经济物种，人工养殖、引种驯化和人为因素等都会通过影响日本沼虾的生存环境、基因交流等方式间接影响到日本沼虾种群的遗传结构。
3.3 河南境内日本沼虾的种群历史动态中性检测结果显示，群体平均Fu’ Fs值和Tajima’s D值均为负值，且Fu’ Fs值达显著差异水平(P<0.05)；错配分布显示错配分布图为多峰；BSP分析结果显示日本沼虾群体整体上保持稳定增加的趋势。综合以上3种方法分析，结合其高单倍型多样性、低核苷酸多样性共存的特征，推测河南境内日本沼虾种群整体相对比较稳定，未经历过种群扩张。
综上所述，作为广泛分布于我国各淡水水体、经济价值较高的淡水虾，河南境内部分地区尤其是淮河水系日本沼虾群体的遗传多样性水平相对较低，日本沼虾种质资源的保护有待进一步加强。物种演化在生物体长期的进化历程中受基因突变、自然选择等多种遗传因素影响，此外地质变迁和气候波动等环境因素和人为因素对物种的遗传分化也会造成一定程度的影响[31-33]。近年来人工养殖、过度捕捞、水环境污染及水利水坝工程的建设均对日本沼虾的生存环境造成了很大影响，严重影响了日本沼虾的生存及演化。长江流域禁渔期制度及不断补充完善的禁捕措施的实施不仅为长江流域渔业资源的养护提供了保障，更为河南省渔业资源的养护提供了参考。根据本研究结果，建议除现有的两大国家级青虾保护区的设立外，还应当进一步完善并加强日本沼虾种质资源的选育和生存环境的保护。
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