2021, Vol. 28 
2. 云南农业大学动物科学技术学院, 云南省高校高原渔业资源保护与可持续利用重点实验室, 云南 昆明 650201
2. Animal Science and Technology College, Key Laboratory of Plateau Fishery Resources Protection and Sustainable Utilization of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650301, China
三倍体牡蛎性腺高度不育, 具有不同于二倍体牡蛎的能量再分配与利用方式, 因而生长优势显著[1]。此外, 由于三倍体牡蛎机体中糖原等物质含量较高[2], 具有较好的口感, 因此具有较好的市场销量。三倍体牡蛎因其较高的经济价值, 已成为重要的牡蛎养殖品种, 被大量养殖, 其中仅长牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体的养殖产量即占全球贝类养殖总产量的30%[3]。
牡蛎多倍化首先在美洲牡蛎(C. virginica)中实现, 通过细胞松弛素B (CB)抑制极体的排放, 诱导三倍体[4]。在长牡蛎中使用四倍体与二倍体杂交的方法生产三倍体, 避免了CB对牡蛎浮游幼体的毒害[5]。无论通过哪种方法生产牡蛎三倍体, 绝大多数三倍体个体的性腺只能发育至分化期或增殖期, 不能继续发育至成熟期, 性腺呈高度不育, 但仍有少部分三倍体个体性腺可发育至成熟期, 并可排出生殖细胞[6,7]。因此, 与二倍体相比, 三倍体繁育能力显著降低, 在诱导产生的长牡蛎三倍体中, 三倍体雌性个体具有较低的性腺成熟比例, 通常只有二倍体的2%~13%, 通过人工诱导产生的牡蛎三倍体具有一定的繁殖潜力[8,9]。
熊本牡蛎(C. sikamea)主要分布于我国沿海及东北亚的朝鲜半岛与日本沿海, 在国外已成为主要的牡蛎养殖种类[10,11,12,13]。我国熊本牡蛎野生资源丰富, 广泛分布于江苏以南沿海的海湾及河口区域, 具有较高的种质资源价值与经济价值[12]。目前, 国内学者已进行了熊本牡蛎的选择育种研究[14,15,16,17,18], 熊本牡蛎与香港牡蛎(C. hongkongensis)[19]、葡萄牙牡蛎(C. angulata)[20]、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)[20]、近江牡蛎(C.rivularis)[21]的杂交育种研究, 以及熊本牡蛎三倍体诱导研究[22], 但对熊本牡蛎三倍体性腺发育特征及其繁殖能力还未见研究报道。本研究通过观测CB诱导产生的熊本牡蛎三倍体的性腺发育特征及其繁殖潜力, 以期为熊本牡蛎三倍体的利用提供基础科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料在广西北海贝类养殖基地挑选2~3龄、体重大于50 g的无损伤熊本牡蛎100只作为亲贝, 按照雌 : 雄=4 : 1配对, 人工解剖获取精、卵。使用新鲜海水促熟卵子和激活精子后备用。
采用同一批次的精子和卵子制作二倍体与三倍体。使用CB诱导三倍体, 当受精卵排出40%~ 50%的第一极体(PBI)时, 立即加入CB溶液(终质量浓度为0.5 mg/L)持续诱导20 min, 并使用0.1%二甲基亚砜(DMSO)冲洗残留的CB, 置于孵化桶中孵化; 对照组不进行处理。实验重复3次。在室内进行浮游幼虫的培育。采用成吊的牡蛎壳作为附着基, 幼虫附着完毕后转移至自然海区吊养, 进行稚贝与成贝的培育。
1.2 实验材料收集在授精后60、90、120、150、180、210、270、360、450日龄随机收集处理组与对照组各120只个体, 解剖并取其性腺组织固定于Bouin’s液中, 24 h后转入70%乙醇溶液中保存。
1.3 倍性鉴定使用流式细胞仪(Partec II, Germany)逐个鉴定倍性, 解剖后取约1 mm3鳃组织于1.5 mL离心管中, 加入1 mL DAPI染色液(10 μg/mL; Sigma, USA), 轻微匀浆后制成细胞悬液, 使用流式细胞仪进行倍性检测与分析。以二倍体为对照, 检测峰值是二倍体峰值1.5倍则为三倍体。
1.4 石蜡切片制作二倍体与三倍体性腺组织分别做石蜡切片。将保存于70%乙醇溶液中的性腺组织取出, 依次进行脱水、透明、包埋, 并做连续切片, 切片厚度6~8 μm。将切片置于45 ℃恒温箱中烘干, 之后进行苏木精–伊红(HE)染色。
1.5 二倍体与三倍体性别鉴定及性腺发育周期观察使用光学显微镜(Olympus CX22, Tokyo, Japan)观察性腺切片进行性别鉴定, 根据生殖细胞类型及大小, 滤泡大小及结缔组织发育特征等, 并参考已报道的长牡蛎性腺发育阶段鉴别熊本牡蛎的性腺发育周期[23,24]。
1.6 三倍体与二倍体卵径测量根据已报道的方法测量牡蛎卵子的直径[25]。每个采样时间点随机取性成熟期的10个个体的性腺组织石蜡切片, 每个个体测量60个卵子的直径。
1.7 数据处理采用平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)的方式记录数据, 并采用卡方检验的方法检测雌雄个体比例是否符合期望值1 : 1。采用单因素方差分析(ANOVA)与Duncan’s test的方法进行不同数据间的比较。所有数据分析使用SPSS18.0软件进行, 显著性水平设为0.05。
2 结果与分析 2.1 三倍体性腺发育特征熊本牡蛎三倍体与二倍体性腺发育均可分为5个时期: 形成期、增殖期、成熟期、排放期、耗尽期, 三倍体与二倍体性腺发育的差异主要为三倍体性腺发育程度较低, 虽然部分三倍体性腺可发育至成熟期和排放期, 但性腺中滤泡体积较小, 结缔组织丰富, 单个个体产生的配子数量少于二倍体(表1, 图1)。
2.2 三倍体与二倍体群体性别比例熊本牡蛎二倍体雌雄比为0.95 : 1, 未显著偏离1 : 1的期望值(χ2=13.64; P=0.09), 而同时期三倍体的雌雄比为1.35 : 1, 显著偏离1 : 1的期望值(χ2=35.46; P=0.00)。在熊本牡蛎二倍体与三倍体中分别观测到1个和7个雌雄同体个体。处于性腺未分化期的二倍体与三倍体比例分别为24.35%与48.45%, 约50%的三倍体个体由于性腺未分化而无法鉴定性别(图2)。
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表1 熊本牡蛎三倍体与二倍体成熟期性腺发育比较 Tab. 1 The comparison of mature gonads between triploid and diploid Crassostrea sikamea |
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图1 熊本牡蛎三倍体与二倍体性腺发育分期I: 形成期; II: 增殖期; III: 成熟期; IV: 排放期; V: 耗尽期. Fig. 1 Gonadal development for triploids and diploids of Crassostrea sikameaI: early development stage; II: development stage; III: ripe stage; IV: spawning stage; V: spent stage. |
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图2 60–450日龄三倍体与二倍体熊本牡蛎性别比例的变化 Fig. 2 Percentage of male, female and indifferent individuals from the age of 60 d to 450 d in triploid and diploid Crassostrea sikamea |
熊本牡蛎三倍体与二倍体雌雄个体性腺发育呈周期性变化, 且在60日龄时即开始发育(图3)。60~450日龄(2016年8月至2017年10月) 22%的三倍体具有成熟期性腺, 78%的三倍体性腺虽可发育, 但无法发育至成熟期。三倍体雌雄个体均在210日龄(2017年1月)具有最多的未发育期性腺, 分别为81.8%和80%, 之后逐渐减少, 450日龄(2017年10月)未发育期性腺的比例又再次升高至较高水平(分别为54.5%与75%)。
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图3 60–450日龄熊本牡蛎三倍体和二倍体雌雄个体性腺发育比例 Fig. 3 Percentage of individuals observed at different stages from the age of 60 d to 450 d in female and male diploid and triploid Crassostrea sikamea |
性腺成熟期三倍体与二倍体卵子直径均值分别为(44.30±6.88) μm与(37.76±5.76) μm, 三倍体的卵径比二倍体增大17.33%, 差异显著(P<0.05)。180~450日龄, 性腺成熟期的二倍体卵径逐渐增大, 且卵径大小呈显著差异(P<0.05)。性腺成熟期的三倍体在180日龄具有最大的卵径(45.7 μm), 270日龄降低至最小(41.5 μm), 之后逐渐增大, 450日龄时恢复至最大值(45.7 μm, 图4)。
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图4 180–450日龄熊本牡蛎性腺成熟期的三倍体与二倍体卵径立柱上标不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 4 Diameter of the eggs of diploid and triploid Crassostrea sikamea at gonadal mature stageDifferent letters on the column indicate significant difference (P<0.05). |
可育的三倍体牡蛎具有较高的种质利用价值, 但三倍体牡蛎的可育性呈现多样性。在香港牡蛎[26]、美洲牡蛎[27]、长牡蛎[28]的三倍体中观察到可育个体, 并且长牡蛎三倍体成熟性腺中滤泡面积占比达50%, 呈现较高的可育性[7], 而在悉尼岩牡蛎(C. commereialis)三倍体中未观察到性腺可育现象[24]。本研究中22%的熊本牡蛎三倍体性腺可发育至成熟期, 因而熊本牡蛎三倍体具有较高的种质利用潜力。牡蛎三倍体的性腺发育程度及可育性与它们的生存环境相关, 例如在长牡蛎中, 有的学者不能观察到三倍体个体的生殖细胞排出体外的现象[23], 而其他学者发现丰富的食物(浮游植物密度)与较高的水温可促进长牡蛎三倍体个体的未成熟性腺发育至成熟状态[6,29]。Séguin等[30]观察到42%的长牡蛎三倍体在水温20~22 ℃时可达到性成熟。本研究中熊本牡蛎三倍体养殖于热带海区, 在繁殖季节平均水温均高于30 ℃。因此, 本研究中熊本牡蛎三倍体较高的可育性可能与较高的生活水温有关, 高的生活水温促进了它们的性腺发育与成熟。此外, 三倍体的诱导方法亦可影响三倍体可育性, 有研究报道在长牡蛎中, 通过四倍体与二倍体杂交生产三倍体, 比使用化学药物诱导产生三倍体具有更高的可育性, 可能是因为杂交三倍体从可育的四倍体中遗传得到了促进性腺发育的基因[9]。
本研究中熊本牡蛎三倍体性腺组织滤泡数少于二倍体(表1), 但性腺中结缔组织占比远高于二倍体, 并且在三倍体未成熟性腺组织中(形成期), 滤泡的空隙明显多于二倍体, 原始生殖细胞较少, 即使在成熟的三倍体性腺组织中(成熟期和排放期), 滤泡中仍存在较多的空隙, 而二倍体滤泡中则被成熟的卵子充满(图1)。目前, 较多研究已报道了牡蛎三倍体的可育性, 但仍未有统一的评价牡蛎三倍体可育程度的标准。Cox等[24]把牡蛎的可育程度分为两种类型, 一种类型是性腺产生极少的配子, 或者仅产生一些成熟的配子, 或者滤泡中具有较多的空隙, 仅释放一些配子; 另一种类型是滤泡中可产生成熟的配子。本研究中熊本牡蛎三倍体的未成熟与成熟性腺发育特点均与上述性腺发育分类吻合, 但依据该评价方法, 有研究报道水温为30 ℃时87%的长牡蛎三倍体具有成熟的性腺[31], 而另外的研究却未观测到长牡蛎三倍体可产生配子[6], 并且基于该评价方法, Cox等[24]与Jouaux等[7]也未观测到性腺成熟的长牡蛎三倍体产卵现象, 因而该评价方法可能并不能全面反映牡蛎三倍体的可育程度。Jouaux等[7]又把长牡蛎三倍体中配子生成方式分为alpha与beta两种类型, alpha类型为性腺中具有大量增殖的原始生殖细胞, 而beta类型则为性腺中未有配子形成。在本研究中, 22%的熊本牡蛎三倍体性腺可发育至成熟期, 并可排出成熟配子, 属于alpha类型, 它们具有可产生成熟生殖配子的能力; 而性腺仅能发育至形成期或增殖期的熊本牡蛎三倍体属于beta类型。
3.2 熊本牡蛎三倍体与二倍体性别比例和卵径熊本牡蛎三倍体性腺处于分化期时雄性个体的比例较高, 之后雌性个体比例增加并达到最大值, 可能表明随着日龄的增加熊本牡蛎性反转方式为雄性转为雌性, 这种性比变化方式与长牡蛎相似[31]。另外, 熊本牡蛎三倍体与二倍体具有不同的性比。Guo等[32]与Normand等[6]认为环境与生物因子通过影响生理状态而影响机体生理活动, 可能是决定牡蛎性别的首要因素。牡蛎三倍体与二倍体具有不同的能量再分配模式与生理状态[33], 这种差异可能导致两者的性比变化模式不同。环境因子亦可改变贝类群体的性比, 如水体中锌离子浓度升高可使等边浅蛤(Gomphina aequilatera)群体中雄性个体增加[34]。此外, 熊本牡蛎二倍体的性比具有季节性变化。熊本牡蛎二倍体雌性个体在冬季(120~150日龄)增加, 而在翌年的春季(180~270日龄)减少, 秋季(360~450日龄)时再次升高。相比而言, 熊本牡蛎三倍体性比的季节性变化不明显, 可能是由于熊本牡蛎三倍体性腺滞育, 未分化性腺的比例较大。在悉尼岩牡蛎三倍体中也发现了相似的现象, 它们的性腺发育节奏比二倍体滞后[24]。
180~450日龄性腺成熟期的熊本牡蛎三倍体与二倍体卵径变化与生殖季节相关, 繁殖季节性腺成熟期三倍体卵径显著小于非繁殖季节; 而二倍体卵径随着成熟期性腺比例的增加而逐渐增大, 相似的结果亦在二倍体长牡蛎壳金色群体中观察到[35]。因此, 与其他影响因素如食物丰度、杂合度、能量代谢能力等相比, 繁殖季节牡蛎性腺发育占用了大量的能量与营养物质, 个体生长受到限制, 因而在繁殖季节, 三倍体与二倍体牡蛎的性腺发育对它们的个体生长影响较大[33,36,37]。
总之, 熊本牡蛎三倍体性腺发育周期与二倍体相似, 均可分为形成期、增殖期、成熟期、排放期和耗尽期5个时期, 三倍体部分个体可育, 60~450日龄平均22%个体的性腺可发育至成熟期; 三倍体与二倍体性腺发育同步, 繁殖期位于3—9月, 但三倍体性别比例显著偏离1 : 1(P<0.01), 雌性个体数量较多, 并且三倍体与二倍体的卵径变化与繁殖周期相关, 三倍体卵径比二倍体大17.33%。本研究为熊本牡蛎三倍体和二倍体繁育提供了重要参考依据。
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