中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹、大闸蟹，属节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)，因其营养丰富、味道鲜美而备受欢迎。中华绒螯蟹是我国重要的经济养殖品种，也是研究甲壳动物的重要模式生物，研究其生长发育和营养代谢的调控对于生产实践和理论研究都有重要意义。Rheb (Ras homologue enriched in brain)是一种小型的GTP酶，属于Ras超家族，它是mTOR (mammalian or mechanistic target of rapamycin)信号通路上游重要的正调控因子^[1]。mTOR是进化上非常保守的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶，存在mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)两种复合物^[2-3]，其中mTORC1整合生长因子(如胰岛素)、营养物质(氨基酸)、环境胁迫等各种信号，在调节细胞生长、分化、自噬和营养代谢中起重要作用^[4]。Rheb受生长因子或营养物质的刺激，发挥分子开关的作用，由Rheb-GDP转变为Rheb-GTP，激活mTORC1使其发挥蛋白质激酶作用，磷酸化下游的4EBP1 (eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1)和S6K (ribosomal protein S6 kinase)，从而启动蛋白质合成^[5]。哺乳动物中Rheb基因已有较多研究，小鼠Rheb1可通过促进mTORC1信号通路和抑制AMPK信号通路促进胰腺组织β细胞的增殖^[6]，可通过mTOR信号通路调控巨核–红系多能性干细胞发育^[7]，还可以通过mTORC1调控DRP1蛋白的降解，进而调节线粒体形态的周期性变化，起到偶联昼夜节律和细胞代谢的“桥梁”作用^[8]。

甲壳动物的生长发育和蜕壳密切相关，其蜕壳激素的生物合成依赖mTOR信号通路^[9]。在黑背陆地蟹(Gecarcinus lateralis)蜕壳前的中晚期，mTOR信号通路成员如mTOR、Akt、EF2和S6K表达显著上调以维持蜕皮激素的浓度^[10-11]。在调控生长和代谢方面，凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肌肉组织中包括Rheb在内的mTOR信号通路成员Akt、slc3a2、S6K和TOR在亮氨酸刺激下其mRNA表达量显著增加^[12]，中华绒螯蟹mTOR信号通路下游的S6K1 mRNA表达量在蜕壳诱导的肌肉生长中也显著增加^[13]。然而，对甲壳动物mTOR信号通路上游调控因子Rheb的研究相对较少，目前仅凡纳滨对虾这一物种有所报道^[14]。本研究克隆了中华绒螯蟹Rheb的编码序列，将其编码的蛋白命名为EsRheb，对其保守结构域、功能位点、三维结构进行了生物信息学分析，并检测了EsRheb转录产物的组织分布及饥饿和摘除眼柄对EsRheb在不同组织中转录表达的影响，为进一步研究Rheb-mTOR信号通路参与调节甲壳动物的生长和营养代谢提供研究基础。

中华绒螯蟹幼蟹购自江苏固城，体重(10.95± 2.25) g。暂养于实验室30 cm×60 cm×45 cm的玻璃水族箱内，自然光照，水温(25±1) ℃。每天更换曝气3 d的自来水并投喂商品饲料。待螃蟹适应实验室条件1周后，随机取3只中华绒螯蟹，分别取其肝胰腺、胃、肠、眼柄、Y器、心脏、鳃放于−80 ℃冰箱待测。剩余螃蟹分为两大组，第1大组做饥饿处理，分3个平行组饲养，每个平行组每天只换水不投喂，于第7天、14天随机取3只螃蟹，分别取其螯足肌肉和肝胰腺组织放入−80 ℃冰箱待测；第2大组做眼柄摘除处理，具体方法如下：用剪刀在右侧眼柄基部剪断，用烧红的镊子灼烫伤口消毒后，将螃蟹放回玻璃缸中，同样分3个平行组饲养，每个平行组和对照组同样正常换水、投喂。于摘除眼柄后的第1天、2天、3天、5天、7天，随机取3只螃蟹，分别取螯足肌肉和Y器，放入天−80 ℃度冰箱待测。(其中因为Y器较小，3只螃蟹的Y器为一组样本，3组样本共9只螃蟹)。

取中华绒螯蟹肌肉组织，采用Trizol法提取总RNA；采用Fermentas公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链作为PCR的模板。根据NCBI公共数据库的中华绒螯蟹TSA (transcriptome shotgun assembly)序列(accession: GFBK01021924.1)设计引物(表1)，进行PCR反应，获得中华绒螯蟹Rheb cDNA序列。PCR反应加样体系：cDNA模板5 μL，上下游引物(10×)各1.5 μL, Ex taq (Takara) 1.0 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1.0 μL, 2×Ex tag Buffer (TaKaRa) 25 μL，加入去离子水至总体积50 μL。PCR反应条件设置为：94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min 40 s, 35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将含有目的基因的琼脂糖凝胶切下回收，连接转化至pMD-18 Vector载体，筛选阳性克隆后送上海生工生物工程有限公司测序。

表1

表1 　中华绒螯蟹Rheb cDNA扩增引物 Tab. 1 　The primers for Eriocheir sinensis Rheb cDNA amplification 引物名称primer name 序列(5′−3′) sequence (5′−3′) 应用application EsRheb-F1EsRheb-R1 CTTATGGACCAGTGAGCC RT-PCR TCTGGCTATATCACAGAG RT-PCR EsRheb-F2EsRheb-R2 GTCATCTCTCTGCATCCAGTTT qRT-PCR CCTCGCACCTTGAGTTTCTT qRT-PCR 27S-F27S-R GGTCGATGACAATGGCAAGA qRT-PCR CCACAGTACTGGCGGTCAAA qRT-PCR

表1 　中华绒螯蟹Rheb cDNA扩增引物 Tab. 1 　The primers for Eriocheir sinensis Rheb cDNA amplification

序列相似性搜索和分析使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)；开放阅读框预测及蛋白质序列转换使用NCBI网站的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和Expas的翻译工具(http://web.expasy.org/translate/)；结构域预测使用NCBI网站上的CD-search^[15](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，蛋白质结构建模和分析利用同源建模工具SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)和Pymol软件(https://pymol.org/)。多序列比对和系统发育树构建使用MEGA7.0上的Clustal序列比对工具和邻接法发育树构建工具进行1000次自展检验(bootstrap)评估进化树分支可信度^[16]。

实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测EsRheb mRNA在不同组织的表达情况以及眼柄摘除和饥饿处理对其表达的影响。用于qRT-PCR的特异引物和内参引物分别根据中华绒螯蟹EsRheb编码序列和27SRNA序列设计(表1)。利用QuantStudio 3 (ABI)荧光定量仪的2^−ΔΔCt方法检测中华绒螯蟹Rheb mRNA的相对表达量，反应程序设置为95 ℃ 3 min, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s；然后重复95 ℃ 5 s, 60 ℃ 15 s，共40个循环；熔解曲线从65 ℃上升至99 ℃，梯度为0.5 ℃/read。实时定量PCR均进行3次技术重复。

利用SPSS 18.0软件中的单因素方差分析，差异显著性以P<0.05为标准，数据结果用平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示。

本研究克隆到的编码中华绒螯蟹Rheb的cDNA全长为606 nt (图1)，其中核苷酸37~585位开放阅读框(ORF)编码182个氨基酸。cDNA序列的其余部分为EsRheb mRNA的非翻译区。以EsRheb cDNA编码的氨基酸序列作为查询项，用NCBI网站上的Smart BLAST搜索得到的相似性分值最高的返回序列是果蝇(Drosophila melanogaster) Rheb蛋白(查询号NP_730950.2)。实验所得序列已提交到GenBank，核酸和编码蛋白的查询号分别为PP860494.1和XBK48587。

图1

图1 　中华绒螯蟹Rheb cDNA序列及编码的氨基酸序列起始密码子，为终止密码子，箭头标出的是cDNA克隆和qRT-PCR所用引物的位置和方向. Fig. 1 　cDNA and deduced amino acid sequences of EsRheb of Eriocheir sinensis is the start codon and is the stop codon, the arrows indicate the position and direction of the primers used for cloning and qRT-PCR.

利用CD-search工具在数据库NCBI-Curated进行保守域搜索(操作时间2024.6.7)，结果如图2所示。中华绒螯蟹Rheb的6-182氨基酸区域是Rheb保守域家族(编号cd04137)，其重要功能位点/保守基序包括GTP/Mg²⁺结合位点(14~21, 30~31, 34, 37, 62, 118~119, 121~122, 148~149)，脂质修饰位点(179~182), GEFs (Guanine nucleotide exchange factors)互作位点(19~20, 34, 36, 42~43, 56, 57, 59, 61~62, 150), GDI (GDP dissociation inhibitors)互作位点(13~14, 61~62)，效应因子RalGDS (Ral Guanine nucleotide dissociation stimulator)互作位点(35, 36, 40~43), Switch I区(35~42), Switch II区(61~79), G1 box (即Walker A motif, 12~19), G2 box (37), G3 box (59~62), G4 box (118~121), G5 box (148~150)。

图2

图2 　中华绒螯蟹Rheb蛋白保守域和功能位点 Fig. 2 　Conserved domains and putative functional sites of EsRheb of Eriocheir sinensis

以AlphaFold v2方法预测的榄绿青蟹(Scylla olivacea) Rheb结构坐标数据(alphfald database编号A0A0P4WH70.1.A)为模板，用swiss-model模拟工具得出中华绒螯蟹Rheb的结构模型如图3a所示。将EsRheb的结构模型与X射线衍射技术解析的人Rheb-NR1 [4-bromo-6-(3,4-dichlorophenylthio)-1-(4-(dimethylcarbamoyl)benzyl)-1H-indole-2-carb-oxylic acid, PDB编号6bsx.1]晶体结构进行叠加，二者几乎完全重叠(图3b)。

图3

图3 　中华绒螯蟹Rheb三维结构及与人Rheb晶体结构比较a. 中华绒螯蟹Rheb模拟结构；b. 中华绒螯蟹Rheb与人Rheb晶体结构(黄色链)叠加. Fig. 3 　The three-dimensional structure of Eriocheir Sinensis EsRheb and its comparison with human Rheb crystal structurea. Simulation structure of EsRheb; b. Superposition of EsRheb and human Rheb crystal structure (yellow chain).

选取演化地位各异的生物类群代表物种，以中华绒螯蟹Rheb作为查询项用Blast搜索同源序列，以获得的最为相似序列作为查询项搜索SWISS-PROT蛋白质数据库，鉴定是否为Rheb直系同源物，结果如表2所示。

表2

表2 　基于Blast的中华绒螯蟹Rheb与不同生物Rheb的相似度 Tab. 2 　Similarity comparison of EsRheb with Rheb fron diferent taxa by Blast 物种名species name 最大分值max score 覆盖度/% query cover E值E value 一致度/% Per. Ident 序列长度Acc.Len 查询号accession 智人Homo sapiens 251 99 6.00E-85 65.03 184 NP_005605.1 菲律宾鼯猴Cynocephalus volans 251 99 9.00E-86 65.03 184 XP_062956341.1 小家鼠Mus musculus 251 99 3.00E-85 65.03 184 NP_444305.2 大杜鹃Cuculus canorus 254 99 5.00E-87 65.57 184 XP_009556600.1 撒丁雨蛙Hyla sarda 246 99 6.00E-84 63.39 184 XP_056375601.1 原鳍鱼Protopterus annectens 264 95 4.00E-91 72.00 184 XP_043939716.1 欧洲文昌鱼Branchiostoma lanceolatum 255 98 1.00E-87 65.00 183 CAH1229605.1 灯泡海鞘Clavelina lepadiformis 258 99 3.00E-89 64.64 183 CAK8687775.1 仿刺参Apostichopus japonicus 230 91 3.00E-78 65.66 178 PIK43080.1 海星Sterias rubens 229 91 1.00E-77 63.47 185 XP_033625362.1 欧文虫Owenia fusiformis 272 100 2.00E-94 68.13 182 CAH1774143.1 拟穴青蟹Scylla paramamosain 362 100 1.00E-129 95.60 182 XP_063878927.1 小龙虾Procambarus clarkii 337 100 9.00E-120 89.01 182 XP_045613414.1 双斑蟋Gryllus bimaculatus 287 100 1.00E-100 72.53 182 GLH10476.1 长须罗蛉Lutzomyia longipalpis 259 100 1.00E-89 67.03 182 XP_055695580.1 纹藤壶Amphibalanus amphitrite 262 99 2.00E-90 64.09 182 XP_043247181.1 巨纵沟纽虫 Lineus longissimus 256 100 4.00E-88 64.84 181 XP_064644094.1 萼形柱珊瑚Stylophora pistillata 243 98 6.00E-83 64.29 185 XP_022782693.1 栉水母Bolinopsis microptera 181 93 2.00E-58 50.29 189 XP_063674023.1 丝盘虫Trichoplax sp. H2 218 97 1.00E-73 56.50 185 RDD45281.1 面包屑海绵Halichondria panicea 231 99 2.00E-78 59.67 181 XP_064397002.1 领鞭虫Salpingoeca rosetta 137 95 3.00E-41 43.26 186 XP_004997693.1* 蜷丝球虫Capsaspora owczarzaki 196 98 1.00E-64 52.17 186 XP_004343532.2 中黏菌Sphaeroforma arctica 135 89 8.00E-41 42.94 185 XP_014148669.1* 肺孢子菌Pneumocystis wakefieldiae 215 99 6.00E-69 56.28 185 QSL65239.1 变形虫Acytostelium subglobosum 193 98 1.00E-62 49.72 184 XP_012757648.1 注：*标记的为rap1B同源物. Note: * labels rap1B homologues.

表2 　基于Blast的中华绒螯蟹Rheb与不同生物Rheb的相似度 Tab. 2 　Similarity comparison of EsRheb with Rheb fron diferent taxa by Blast

由表2可以看出，在蜷丝球虫(Capsaspora owczarzaki)、肺孢子菌(Pneumocystis wakefieldiae)和变形虫(Acytostelium subglobosum)等单细胞生物中都有Rheb的存在。但在演化上最接近多细胞动物的领鞭毛虫(Choanoflagellida)及其姐妹群黏菌门(Ichthyosporea)生物中却没有发现Rheb，最为相似的是Rap1B (Ras-related protein Rap-1b)同源蛋白。另外，EsRheb与栉水母动物(Bolinopsis microptera) Rheb的相似性低于海绵动物(Halichondria panicea)、真菌、蜷丝球虫。选取14个代表性物种的Rheb序列与EsRheb进行系统发生树分析，结果显示EsRheb与节肢动物的Rheb聚成一群(图4)。

图4

图4 　Rheb系统发育分析物种名称和序列参考表2. Fig. 4 　Evolutionary relationships of RhebAnimal names and sequences refer to Tab. 2.

实时定量荧光PCR检测表明，中华绒螯蟹Rheb mRNA表达较高的3种组织为肝胰腺、胃和心脏，其次为Y器；表达量最低的为眼柄(图5a)。饥饿处理的第7天和14天，Rheb基因在螯足肌肉组织的表达量与对照组相比显著降低，在肝胰腺中的表达量和对照组没有统计学差异(图5b)。摘除单侧眼柄对中华绒螯蟹Rheb转录水平的影响如图5c、5d所示。Y器中Rheb mRNA表达量在第2天显著升高，第5天开始有所下降，但仍显著高于对照组(图5c)。螯足肌肉组织中Rheb mRNA表达量从第2天显著升高，一直持续到第7天实验结束(图5d)。

图5

图5 　中华绒螯蟹Rheb mRNA的表达特征a. 中华绒螯蟹Rheb在不同组织中的相对表达量；b. 饥饿处理，螯足肌肉和肝胰腺中华绒螯蟹Rheb的相对表达量；c. 摘除眼柄后Y器中华绒螯蟹Rheb的相对表达量；d. 摘除眼柄后螯足肌肉中华绒螯蟹Rheb的相对表达量. 不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 5 　Expression profile of EsRheb mRNA of Eriocheir sinensisa. The relative expression of EsRheb in different tissues; b. the relative expression of EsRheb respond to starvation in hepatopancreas and claw muscles; c. the relative expression of EsRheb respond to eyestalk ablation in Y organ; d. the relative expression of EsRheb respond to eyestalk ablation in claw muscles. The different letters indicate significant differences (P<0.05).

鉴于Rheb介导的mTOR信号通路在调节生物的代谢、生长和发育过程中的重要性，本研究克隆了中华绒螯蟹Rheb的编码cDNA，作为进一步研究其功能的基础。克隆得到的cDNA所编码的氨基酸序列与GenBank中计算机自动注释的序列(XP_050735195.1)有1个氨基酸(170V/D)的差异，与其他研究组提交的序列(WWE43162.1)有5个连续的氨基酸不同(170~174)，其原因是动物单核苷酸多态性还是可变剪接，抑或是测序错误需要进一步证实。

对编码中华绒螯蟹Rheb的氨基酸序列进行保守域预测，获得了其保守域和功能位点的丰富信息。EsRheb的6~182氨基酸区域是Rheb保守域家族，属于小型GTP酶。同时这部分区域也属于P-loop_NTPase保守域超家族(cl38936)，该家族的特点是含有核苷酸结合基序Walker A基序(GxxxxGK[S/T], x是任何氨基酸)和Walker B基序(hhhh[D/E], h是疏水氨基酸)。EsRheb的switch I (35~42)、Switch II区(61~79)是高度保守序列，是使Rheb与TOR的相互接触的主要区域，具有依赖GTP的构象^[1]。另外，中华绒螯蟹Rheb预测有5个保守的G boxes基序，他们与GTP的结合及GTPase的活性有关^[17]。这些信息为实验室设计“湿”实验研究其功能提供了重要依据。将中华绒螯蟹Rheb的三维结构与X射线晶体衍射技术获得的人Rheb-NR1抑制剂复合物结构^[18-20]进行比较，从叠加图可以看出肽链骨架走向基本一致，说明Rheb三维结构非常保守。这种物种间的序列和结构保守性为研究不同生物Rheb的功能及开发以Rheb为靶点的药物提供了非常有用的借鉴。

单细胞生物到多细胞真后生动物的演化是一个备受关注的科学问题^[21]。本研究用中华绒螯蟹Rheb查询项(query)和结果项(hit)进行双向blast^[22]，从单细胞真核生物变形虫到现代人类，在广泛的不同演化地位的生物类群的代表性物种中鉴定了对应的Rheb。在演化地位较早的蜷丝球虫纲、真菌和管柄菌属生物中都发现有Rheb的存在，说明Rheb在动物界演化的开始即存在。但在演化上最接近多细胞动物的领鞭毛虫类以及姐妹群中粘菌门生物中却没有发现Rheb，最相近的是和Rheb同属于Ras超家族的Rap1B同源蛋白。Rheb在领鞭毛虫和中黏菌门生物中的缺失是一个令人迷惑的问题，值得进一步探究。另外，中华绒螯蟹Rheb与栉水母动物Rheb的相似性低于海绵动物，这和最近研究结论栉水母动物而不是海绵动物是真后生动物的姊妹群相一致^[23]。但令人意外的是，中华绒螯蟹Rheb与栉水母动物Rheb的相似性也低于真菌、蜷丝球虫等单细胞生物，其原因也需要进一步探究。总之，对Rheb这种保守基因及相关信号通路的跨物种比较分析，一方面可以深入理解演化背景下结构和功能的关系，另一方面也为生物演化的研究提供线索。

脊椎动物中，Rheb基因主要在骨骼肌、心肌、睾丸和卵巢中大量表达^[24]。本实验检测到Rheb在华绒螯蟹幼蟹的消化器官(肝胰腺、胃)、心肌、骨骼肌(螯足肌肉)和Y器(内分泌器官)中表达量较高，推测和幼体生长快，有较强的新陈代谢水平有关。

甲壳动物生长过程中，往往会因为蜕壳、环境变化等原因遭遇饥饿的情况。饥饿能够抑制mTOR信号通路，显著下调罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肌肉组织中TOR及其下游基因的转录表达^[25]，而亮氨酸则能显著上调包括Rheb在内的mTOR信号通路关键基因的转录表达^[12]。本实验观察到，在饥饿处理的第7天和14天，中华绒螯蟹螯足肌肉组织中Rheb在转录水平显著低于对照组。而肝胰腺是甲壳动物重要的消化器官，储存了大量的脂类和糖元。在饥饿状态下，这些储存的脂类和糖原可被分解利用，以满足动物基本的生理需要^[26]。这或许可以解释饥饿处理后中华绒螯蟹Rheb在肝胰腺组织中的转录表达没有像肌肉组织中那样显著下调，而是保持在稳定状态。

甲壳动物的生长发育由周期性的蜕壳完成。蜕壳由眼柄分泌的蜕皮抑制激素和Y器分泌的蜕皮激素调控。对黑背陆蟹的研究表明，Y器的激活和蜕皮激素的生物合成依赖于mTOR信号通路，Y器的转录组中mTOR信号通路基因有较高的表达^[27-28]，本实验检测到Y器中Rheb有较高的表达量与此一致。在蜕壳间期，Y器被眼柄分泌的蜕壳抑制激素抑制，处于不活跃状态。摘除眼柄解除了蜕壳抑制激素的抑制作用，Y器被激活以合成较多的蜕壳激素。摘除眼柄不仅促进甲壳动物分泌蜕壳激素，还能促进甲壳动物体内蛋白质、糖类、脂类的合成代谢^[29]。实践证明摘除眼柄能够促进甲壳动物的蜕壳生长和性腺发育^[30]。本实验中华绒螯蟹幼蟹摘除单侧眼柄后，可观察到Y器和螯足肌肉组织中Rheb基因转录水平的表达均显著高于对照组。这种表达变化势必影响mTOR信号通路的强度，提示中华绒螯蟹Rheb参与了摘除眼柄促进动物生长和发育的生理过程。

本研究克隆得到编码184个氨基酸全长的中华绒螯蟹Rheb的cDNA。Rheb在中华绒螯蟹和生物界广泛物种间高度保守，中华绒螯蟹Rheb与人Rheb三维结构高度相似。Rheb转录本在中华绒螯蟹幼蟹消化器官(肝胰腺、胃)、心肌、骨骼肌(螯足肌肉)和Y器(内分泌器官)有较高的表达，并可能参与了中华绒螯蟹mTOR介导的生长发育和营养代谢调控。