2024, Vol. 31 
2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部长江下游渔业资源环境科学观测实验站，江苏 无锡 214081
3. 三江源国家公园管理局，青海 西宁 810000
4. 青海湖裸鲤救护中心，青海 西宁 810000
2. Scientific Observation and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in the Lower Reaches of the hangjiang River, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China
3. Sanjiangyuan National Park Administration Qinghai Xining 810000, China
4. Rescue Center of Gymnocypris przewalskii Qinghai Xining 810000, China
鄂陵湖(Ngoring Lake)，古称柏海，又称鄂灵湖，位于黄河源头，海拔高度平均达4200 m，湖水面积为651.08 km2，作为青藏高原第一大淡水湖泊[1,2]，鄂陵湖不仅拥有独特的自然美景，还承载着重要的科研、环境保护意义。
花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裸鲤属(Gymnocypris)，又称大嘴湟鱼、大嘴花鱼、大嘴鱼等[3]，属冷水性鱼类，生长、发育缓慢，性成熟较晚[4]，是中国黄河及其支流上游具有开发前景的一种经济鱼种[5]。近几十年来由于过度捕捞、水电站的建设，其野生种群数量急剧下降[6]，应加强保护力度，扩大花斑裸鲤的种群数量，恢复黄河上游花斑裸鲤的渔业资源。目前，关于花斑裸鲤的人工繁育[6-8]、胚胎及仔鱼发育[9]和基因组功能结构解析[10]等方面均有研究并取得了重要成果。
鱼类的食性研究在生态学和资源管理中占据举足轻重的地位。在鱼类食性的研究中，镜检分析法是最传统、最广泛的方法，它通过显微镜对胃或肠内容物进行食物组成、饵料生物多样性及各种类重要性等方面的研究，能提供鱼类近期所食用食物的详细分类信息，直观地反映鱼类近期摄食行为[11]。虽然该法操作简单，直观、成本低，但是也有弊端。针对消化程度较高、腐烂程度较严重的胃肠含物则难以鉴定甚至无法鉴定[12-13]，从而低估食物多样性；且工作量大，对鉴定人员专业技术能力要求高[13]。随着分子生物学技术的发展，高通量测序技术逐渐得到应用，并被扩展到水生生物食性分析领域[14]。由Taberlet等[15]于2012年研究提出的DNA宏条形码技术(DNA metabarcoding)结合DNA条形码和高通量测序技术，通过对大量样本进行处理和测序后，借助数据库序列比对实现物种水平上的食物种类鉴定，并通过比较所得物种序列的相对丰度来定量描述目标种的食物组成，从而实现食性研究的定性及定量分析[16]。然而在食性分析中有时目标DNA种类繁多，通用引物对某些物种可能会失灵，在片段扩增时会导致数据丢失或失真等情况从而影响结果的完整性，研究较少的自然区域，可能存在较多未知物种，当地物种的数据库往往匮乏或不全从而影响物种鉴定[17]。大量的研究表明每一种食性研究方法在实际应用中均存在局限性，将镜检分析法这种传统的食性研究方法与宏条形码技术这种新兴方法相结合，可以突破单种方法的局限性，提高对生物食性研究的可靠性[18]。
此前关于花斑裸鲤的食性研究较少，特别是黄河上游两个湖泊——鄂陵湖和扎陵湖中的野生花斑裸鲤种群。目前已有的研究显示，自然水域中花斑裸鲤成鱼为杂食性，鄢思利[5]采用镜检分析法发现四川省阿坝州红原县境内的花斑裸鲤食物组成主要为植物碎屑、藻类、水生昆虫及其幼虫、摇蚊幼虫和小型鱼类。而将宏条形码技术和镜检鉴定结合起来，对花斑裸鲤肠内容物组成进行定性及定量分析的研究尚未见报道。本研究选取真核生物18S rDNA的可变区V8区作为标记基因，结合高通量测序技术和镜检鉴别结果，对鄂陵湖水域内花斑裸鲤的食性进行研究，以期为开展人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性研究提供重要的基础数据和资料。
1 材料与方法 1.1 样本来源鄂陵湖共设3个点位，每个点位放置3条刺网及3条定置串联笼壶，其中刺网网目均为7种网目的多网目复合刺网(1.2 cm、2 cm、4 cm、6 cm、8 cm、10 cm、14 cm)，长、高分别为125 m、1.5 m；定置串联笼壶网目为1.6 cm，长、宽、高分别为10 m、0.4 m、0.4 m。刺网、定置串联笼壶均放置2小时后收集网具上所有渔获物，点位经纬度见表1。
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表1 采样点位经纬度 Tab. 1 Sampling site latitude and longitude |
于2023年6月进行采样，将采自鄂陵湖的22尾花斑裸鲤样本经生物学测定，解剖鱼体，鉴别性别、肠充塞度以及性腺发育时期后，用剪刀从鱼体肛门处沿腹部剪开，使用镊子取出肠道后用10%的福尔马林液固定保存。分析时先用针管冲出肠道内含物，滤去水分后使用METTLER TOLEDO分析天平称量食团重，然后将称重后的食团浸泡于75%的乙醇溶液中充分摇匀。鉴别饵料生物种类并分别计数。浮游植物、浮游动物等小型饵料生物使用LEICA DM500显微镜进行观察计数并鉴定到属(种)；底栖动物使用OLYMPUS SZX16体视显微镜进行观察计数鉴定，被消化的则根据残留的头部、附肢等不同生物特征进行鉴别；鱼类等大型饵料生物用肉眼观察并称重。本研究中，食物种类鉴定依据《淡水微型生物与底栖动物图谱》[19]、《水生生物学》[20]和《中国流域常见水生生物图集》[21]，种类鉴定时尽可能鉴定到最小的分类单元。
1.3 食性高通量测序法根据花斑裸鲤样本体型大小(按规格分3组，平均值±标准偏差分别为H.S: 254.08±17.04 mm、H.M: 307.38±17.90 mm、H.L: 413.05±53.93 mm)选取肠道充塞度在3级以上且肠道饱满的11尾花斑裸鲤肠内容物用于高通量测序。用无菌解剖刀切除花斑裸鲤整个肠道，切取所需肠段的内容物，随后将肠段中的内容物分装在15 mL的无菌离心管中，确保样本的纯净与完整后，加入无水乙醇摇匀保存并标记。使用方舟生物科技公司的ALFA土壤DNA小量提取试剂盒对花斑裸鲤肠道内容物样品进行基因组DNA的提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，同时利用NanoDrop和Qubit检测DNA的浓度和纯度。
PCR扩增引物选用指定的引物针(引物序列为：V8F, 5′-ATAACAGGTCTGTGATGCCCT-3′, 1510R, 5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′)对18S rRNA基因的目标区域进行扩增，并带有 Barcode 序列。PCR扩增体系：2×高保真性聚合酶25 µL，正反引物各2 µL, DNA模板3µL，添加无核酸酶水至50 µL。反应程序：95 ℃预变性3min, 95 ℃变性20 s, 56 ℃退火30s, 72 ℃延伸30s；进行32个循环，最后72 ℃延伸5min。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳的检测。利用GeneTools Analysis Software (Version4.03.05.0, SynGene)对PCR产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各PCR产物进行混合。使用E.Z.N.A. ®Gel Extraction Kit (Omega, USA)凝胶回收试剂盒回收 PCR混合产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。建库按照 ALFA-SEQ DNA Library Prep Kit标准流程进行建库操作，NanoDrop和QSEP400高通量核酸蛋白分析系统对文库质量进行评价，完成后在Illumina NovaSeq 6000平台上对文库进行测序。
1.4 数据处理与分析肠道充塞度判断标准参考殷名称[22]的方法划分。
摄食强度用空肠率表示[23]，计算公式如下：
| $空肠率\left( \% \right) = 空肠样本数/总样本数 \times 100$ | (1) |
用于评价饵料重要性的指标[24]包括出现频率(F%)、重量百分比(W%)、数量百分比(N%)、相对性重要指数(IRI)和相对重要性指数百分比(%IRI)，公式如下：
| $\begin{array}{c} F\% = {\rm{某种饵料出现的花斑裸鲤标本数}}/\\ {\rm{用于食物组成分析的标本总数}} \end{array}$ | (2) |
| $F\% = {\rm{某种饵料重量}}/{\rm{饵料总重量}}$ | (3) |
| $F\% = {\rm{某种饵料数目}}/{\rm{总饵料数目}}$ | (4) |
| ${\rm{IRI}} = \left( {W\% {\rm{ }} + N\% } \right)F\% $ | (5) |
| $\% {\rm{IRI}} = \left( {{\rm{IRI}}/\sum {\rm{IRI}}} \right) \times {\rm{ }}100$ | (6) |
通过Fastp软件(version 0.14.1)对原始下机数据进行reads质量过滤，去除低质量的reads。质控后的reads通过USEARCH软件(v11.0.667)对双端序列进行拼接，并去除低质量的拼接序列。拼接后的序列利用 VSEARCH软件(v2.5.2)进行质控，最终得到有效的拼接片段(Clean Tags)。利用 VSEARCH软件(v2.5.2)对所有样品的全部Clean tags进行聚类，默认以98%的一致性将序列聚类[25]，认为一个OTU(operational taxonomic unit)可能表示一个物种，出现同一OTU对应多种物种的OTU的情况，如果结果的相似度大于98%，覆盖率(coverage)为100%，且仅对应一个物种，则取该结果；当一个OTU对应多个物种时，则记为能够涵盖所有相似度最高的当地物种的最低分类单元[26]，默认算法为centroids。通过 BLAST 方法将代表序列与目标基因宏条码数据库的数据库比对，分别将98%, 95%, 90%, 85%作为种，属，科，目，纲5个分类水平的阈值[27]，获得物种注释信息。
2 结果与分析 2.1 花斑裸鲤的摄食强度与性腺发育时期本次调查共采集到花斑裸鲤101尾，重17746.86 g，样本的规格分布范围为130.9~467.03 mm，体重分布范围为25.66~1662.12 g。统计分析结果显示，样本的采集过程随机且具有代表性，因此能够反映不同生长阶段花斑裸鲤肠含物组成的共性特征。其中，空肠率为32.35%，肠道充塞度达到5级的花斑裸鲤个体最多占比达到39.71%；鄂陵湖花斑裸鲤渔获样品中无性腺尚未发育个体(I期)，性腺发育Ⅴ期个体最多占比达到47.06%。
2.2 镜检分析花斑裸鲤肠道内容物食物组成花斑裸鲤22个样本用于镜检分析食物组成，从肠道内含物分析看(表2)，花斑裸鲤肠道中鉴定出饵料生物26种(属)，其中硅藻门(Bacillariophyta)种类最多，有17种(属)，其次是水生植物3种(属)、桡足类(Copepods)2种(属)、绿藻门(Chlorophyta)、黄藻门(Xanthophyta)、轮虫(Rotifera)以及水生昆虫均鉴定到1种(属)。解剖发现，花斑裸鲤的肠道里主要食物是藻类与水生植物，如异极藻(Gomphonema)、桥弯藻(Cymbella)、舟形藻(Navicula)、脆杆藻(Fragilaria)、针杆藻(Synedra)、眼子菜(Potamogeton)等，以及包含有机碎屑与残肢的食糜。
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表2 基于镜检分析的花斑裸鲤食物组成 Tab. 2 Food composition of Gymnocypris eckloni based on microscopic analysis |
除去碎屑及残肢，从数量百分比来看，肠道中舟形藻数量最多，占比为17.19%，其次为针杆藻(16.77%)、异极藻(14.28%)和桥弯藻(10.97%)；从重量百分比来看，眼子菜占比最高为10.64%，其次是水毛茛(Batrachium)，占比9.31%，和不可辨认水生植物，占比为1.33%；从出现频率来看，肠道中舟形藻最高，为100%，其次为针杆藻(出现频率为90.91%)、异极藻(72.73%)和桥弯藻(54.55%)；从相对重要性指数百分比来看，肠道中舟形藻最高为24.23%，其次为针杆藻(21.45%)、异极藻(14.59%)，最低为窗纹藻(Epithemia)、螺形龟甲轮虫(Keratella cochlearis)、猛水蚤(Harpacticoida)以及前突摇蚊(Procladius)，均小于0.01% (表2)。
2.3 花斑裸鲤肠含物真核生物物种组成基于Illumina NovaSeq 6000二代测序平台双端测序，从11尾花斑裸鲤食的肠道内含物中提取并扩增出的 DNA经碱基识别分析转化为原始测序序列(raw reads)。通过对raw reads进行剪切过滤，经过质控，平均得到28563条有效数据。以98%的一致性将序列聚类成为OTUs，共得到52个OTUs。得到的OTU序列与目标基因参考数据库的序列进行比对，根据最佳比对的相似度确定目标序列的分类层级，最终获得物种注释。舍弃序列数低于该样品总序列数的0.01%，真菌、细菌、捕食者序列及可能来自实验污染的人序列不计入食物类群。经过筛选之后一共获得12门，43属饵料生物。
测序结果表明：本次共检测到了包括链形植物门(Streptophyta)、顶复动物亚门(Apicomplexa)、脊索动物门(Chordata)、节肢动物门(Arthropoda)、刺胞动物门(Cnidaria)、绿藻门、硅藻门等在内的12门。在门水平上，占有优势地位的生物类群是链形植物门，占比为28.54%，其次是顶复动物亚门，占比20.81%，线虫动物门占比14.04%，脊索动物门占比10.16%，节肢动物门占比7.91%，绿藻门与硅藻门占比最低，分别为2.83%和2.19%。各门水平食物类群所占比例见表3。
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表3 基于DNA宏条形码测序技术分析的花斑裸鲤门水平食物所占百分比 Tab. 3 Percentage of Gymnocypris eckloni’s food compositions based on DNA metabarcoding technology at the phylum level % |
在属水平上共检测到了眼子菜属(Potamogeton L.)、狐尾藻属(Myriophyllum)、根枝藻属(Rhizoclonium)、果蝇属(Drosophila)、桥弯藻属、舟形藻属、前突摇蚊属、拟长跗摇蚊属等在内的43属(图1)。其中，占有优势地位的是眼子菜属(20.18%)，其次为狐尾藻16.32%，果蝇属8.67%，麦可属3.64%，具晶泡绿藻2.59%、根枝藻属2.33%、桥弯藻属2.29%、轮藻属2.24%、前突摇蚊属2.22%(图1)。
09-1069-10-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 花斑裸鲤肠含物基于属分类水平的真核生物zucheng Fig. 1 Intestinal contents evaluated at the genus level in Gymnocypris eckloni |
从图2可以看出，三种规格花斑裸鲤的肠含物样品共有的核心OTU数有21条；共有饵料生物9门，此外小规格花斑裸鲤与中等规格大小花斑裸鲤独有3门类，分别是软体动物门(Mollusca)、纤毛门(Ciliophora)和轮虫(Rotifera)；共有饵料生物19属，不同规格大小花斑裸鲤间肠道内饵料物种数差异较大。可以看出，大规格花斑裸鲤中肠道内含物的饵料生物种类最高。
09-1069-10-F002.jpg "点击查看原图") |
图2 基于DNA宏条形码技术OTU(a)、门(b)、属(c)三个水平不同规格花斑裸鲤肠含物真核生物数量韦恩图H.S：小规格花斑裸鲤，H.M：中等规格花斑裸鲤，H.L：大规格花斑裸鲤. Fig. 2 Venn diagrams of the number of eukaryotic organisms in the intestinal contents of different size Gymnocypris eckloni at OTU(a), phylum(b), and genus(c) levels based on DNA metabarcoding comparisonH.S: small size Gymnocypris eckloni, H.M: medium size Gymnocypris eckloni, H.L: large size Gymnocypris eckloni. |
丰富度、香农及Chao1多样性指数显示，花斑裸鲤肠含物中的饵料生物物种多样性指数由高到低依次为大规格>中等规格>小规格；辛普森多样性指数等均匀度指数显示，小规格花斑裸鲤肠含物的饵料生物物种分布更加均匀，高于中规格花斑裸鲤肠含物的饵料生物物种分布，高于大规格花斑裸鲤肠含物中的饵料生物物种分布(图3)。
09-1069-10-F003.jpg "点击查看原图") |
图3 基于DNA宏条形码技术的不同规格花斑裸鲤肠含物真核生物多样性指数差异箱形图H.S：小规格花斑裸鲤，H.M：中等规格花斑裸鲤，H.L：大规格花斑裸鲤. Fig. 3 Box plots of differences in eukaryotic diversity indices of intestinal contents of Gymnocypris eckloni with different sizes based on DNA metabarcoding technologyH.S: small size Gymnocypris eckloni, H.M: medium size Gymnocypris eckloni, H.L: large size Gymnocypris eckloni. |
本研究运用镜检分析法和宏条形码技术对鄂陵湖近岸花斑裸鲤的肠道内容物进行分析，经鉴定，花斑裸鲤肠道中共鉴定出饵料生物26种(属)，数量百分比最高的饵料类群为硅藻，达到97.71%，重量百分比最高的类群为水生植物，达到21.28%。此前，鄢思利[5]对四川省阿坝州红原县境内的黄河上游流域花斑裸鲤进行食性研究，其研究结果表明花斑裸鲤主要以植物碎屑、藻类、水生昆虫及其幼虫、摇蚊幼虫和小型鱼类为食的杂食性鱼类。但在鄂陵湖花斑裸鲤的肠道中并未观察鉴定到小型鱼类，推测原因有两个，首先本研究的自然水域花斑裸鲤样本采集于青海省玛多县境内，与前者研究的花斑裸鲤样本生活环境不同，可能导致其食性不完全一致。另外，花斑裸鲤肠道内容物中的食糜部分可能存在消化程度较高的鱼类组织，无法通过形态学鉴定，仅通过宏条形码测序技术检测到脊索动物门，不能进一步确定是否摄食鱼类。
通过DNA宏条形码技术对花斑裸鲤肠含物进行高通量测序鉴定，共鉴定出真核生物12门43属，揭示花斑裸鲤多样化的食物组成。通过测序鉴定发现，主要的食物来源是眼子菜和狐尾藻，还有部分摇蚊、钩虾以及藻类等，与前文镜检结果互为补充，表明仅使用单一的方法进行鱼类食性分析较难得到完整的食物组成。然而测序未鉴定到物种(属)水平的达20%，其原因是现代分子生物学技术虽可以不受鉴定对象的限制，但需先建立一个比较完整的基因数据库，才能满足后期序列比对的要求，这也体现出该技术的不足[28]。其次将测序结果与镜检结果对比发现，存在形态学鉴定到而测序未鉴定到的物种，如藻类中的窗纹藻、曲壳藻等，推测为DNA含量过低。因此仅通过镜检分析或DNA宏条形码技术单一的方法对花斑裸鲤食性进行分析，容易产生误差，通过两种方法结合，可以使结果更加准确、全面。将传统形态学鉴定与分子技术结合，用于研究鱼类食性是高效且准确的方法，这两种技术各自的优势可以互相补充和印证，从而提供更全面、深入的鱼类摄食习性的信息。
3.2 不同规格花斑裸鲤的食物组成以及摄食选择大规格花斑裸鲤[(413.05±53.93) mm]肠含物中饵料生物多样性高于中等规格花斑裸鲤[(307.38± 17.90) mm]高于小规格花斑裸鲤[(254.08±17.04) mm]，小规格花斑裸鲤肠含物样品中优势饵料生物为顶复动物，中等规格花斑裸鲤肠含物样品中优势饵料生物为链形植物和脊索动物，大规格花斑裸鲤肠含物样品中优势饵料生物为刺胞动物。贺舟挺等[29]在对黄海南部、东海北部和东海南部3个区域黄鮟鱇的摄食习性进行研究时发现，黄鮟鱇摄食强度变化不显著，而食物组成具有显著差异，食物种类随黄鮟鱇规格的增加有显著的变化，且食物多样性指数、食物种类和食物重量范围都随规格的增加而变化。本研究中随花斑裸鲤规格的增大，其肠含物中饵料生物组成也随之发生变化。
分析其原因：首先，花斑裸鲤口裂也随其规格的增长而变大，以至可进食的饵料生物种类增加，因此大规格花斑裸鲤肠含物中的饵料生物多样性较中规格与小规格更为丰富，食物组成也更倾向于刺胞动物门等；另外，在进食过程中随花斑裸鲤的规格增加，其运动能力和对于饵料生物的捕食能力增加，导致花斑裸鲤规格越大，其摄食选择范围越广，食物组成越多样；裸裂尻鱼属杂食性偏藻类食性，但体长280 mm以上的较大个体因摄食器官的生长完善，采用吞食的方式摄食高原鳅幼体，扩大摄食范围来适应高海拔资源匮乏的环境条件[30]；同样，大规格的花斑裸鲤通过利用更多的饵料资源，增强了花斑裸鲤对食物的竞争优势。
4 结论本研究以2023年6月鄂陵湖中采集的野生花斑裸鲤个体为研究对象，采用镜检分析法和DNA宏条形码技术相结合的方法，对花斑裸鲤的摄食强度、食物组成及其随发育的变化进行了研究，为花斑裸鲤的食物组成及其摄食变化的研究进行了补充。本研究和其他研究可以表明宏条形码技术可以检出主要的食物成分以及肉眼无法鉴定的食糜部分。镜检分析法可以直观地反映鱼类近期摄食行为，但在很大程度上取决于鉴定人员专业技术能力以及食物的消化程度。DNA宏条形码技术虽能克服这些问题，但无法根据检测到的DNA分析出食物的体积和重量，只能进行多样性分析。关于这一点本研究结合镜检分析法和DNA 宏条形码技术，从花斑裸鲤肠道内含物组成进行分析，了解了其食物组成和摄食强度，极大增强了描述花斑裸鲤食性的能力，可为花斑裸鲤野生资源保护提供重要的基础数据和资料。
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