2024, Vol. 31 
2. 上海长江口渔业资源增殖和生态修复工程技术研究中心，上海 200090
3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306
2. Shanghai Engineering Research Center of Fisheries Stock Enhancement and Habitat Restoration of the Yangtze Estuary, Shanghai 200090, China
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属甲壳纲，十足目，方蟹科，绒螯蟹属，是我国重要的经济物种，广泛分布于我国的黄河、长江等流域，具有明显的索饵洄游和生殖洄游习性[1-3]。中华绒螯蟹的幼体阶段，按照形态学划分，可以分为蚤状幼体和大眼幼体(蟹苗)两个阶段。根据历史监测数据可知，每年5月亲蟹主要分布在横沙浅滩与九段沙附近，蟹苗主要分布在顾园沙附近[4]。长江口是世界第三大河口，也是中国所有河口中的最大渔场[5]，同时也是中华绒螯蟹幼体的重要栖息地，许多幼体将其作为觅食的场所和逃避捕食者的避难所[6]。长江口的中华绒螯蟹资源在历史上比较丰富，但是由于过度捕捞[7]，滩涂围垦，大坝调蓄[8]，岸线硬化等原因，导致长江口中华绒螯蟹资源减少。蟹苗资源在1983—2003年枯竭近20年[9], 2004年后，通过多年的增殖放流，长江口蟹苗的资源量有所回升[10]。但总体上并没有每年持续上升，不同年份间仍存在较大波动。
针对中华绒螯蟹资源保护相关监测工作，以往的调查取样多采用传统调查方法，属于侵入性取样，容易对水生生物的栖息地造成不良影响。而且长江口的蟹类种类繁多，监测时需要专业人员具有较高的分类学知识。中华绒螯蟹大眼幼体阶段时间较短，一周左右就会变态为仔蟹，传统调查方法监测蟹苗汛期较困难，费用较高。自2021年起，长江实行10年禁捕，在长江禁渔的背景下，很难再获得渔业数据，因此需要采用一种长江禁渔背景下的中华绒螯蟹资源监测新方法，对蟹苗汛期资源进行监测，即环境DNA(eDNA)技术。
目前，eDNA技术已在生物多样性分析[11]、入侵物种监控[12]、珍稀濒危物种监测[13]、生物量评估[14]等方面取得了初步应用，但应用eDNA技术开展的水生生物资源定量评估研究较少。Baldigo等[15]使用eDNA技术评估溪流中溪鳟(Squaliobarbus ourriculus)的种群密度和生物量，结果表明，eDNA可以解释种群密度和生物量44%和24%的变化。Stoeckle等[16]的研究发现，新泽西州海洋拖网调查到的鱼类70%的捕获量和eDNA调查结果一致。Sun等[17]运用eDNA技术评估中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)在渤海水域中的生物量，结果表明，渤海水域每240 m2就有1只对虾分布。Chen等[18]运用eDNA技术监测了长江口水域的鱼类生物多样性，结果表明，被动式采样可以更有效地监测生物多样性。张方圆等[19]运用eDNA技术监测了2022年冬季长江口中华绒螯蟹亲蟹的资源状况。总体而言，eDNA技术在不同环境中水生生物资源评估方面的研究结果不同，如何准确地评估野外环境中的生物量还是一个难题。
本研究基于eDNA技术，探讨其应用在长江口中华绒螯蟹蟹苗资源监测中的可行性，该研究还有助于揭示中华绒螯蟹蟹苗在长江口种群资源量的动态变化，评估中华绒螯蟹的资源状况，同时还可以为其他水域监测中华绒螯蟹的资源变化提供参考。
1 材料与方法 1.1 室内定量曲线构建实验对象为中华绒螯蟹苗，捕自长江口水域。实验于2023年6月进行，共设置4个密度梯度实验组，1个空白对照组，每个实验组设置3个平行。每个实验组养殖水体积为20 L，浓度梯度分别为20 L水体1只蟹苗，10只蟹苗，100只蟹苗，1000只蟹苗，对照组无蟹苗。选用的缸为长39 cm，宽28 cm，高30 cm的长方体，开始实验前，在缸中放入一定体积的水，曝气3 d后，每个缸取1 L水，做阴性对照。结果为阴性后继续实验。为了避免饵料影响eDNA释放速率，在实验期间不喂食，实验时间为72 h。开始实验后，每个实验组分别在第72小时时收集1 L水样。实验期间水温为22.7~24.1 ℃，盐度为0.16‰~0.18‰。
在定量曲线构建实验完成的基础上，将养殖实验浓度为20 L水体1000只蟹苗的3个实验组，进行eDNA降解实验，蟹苗全部捞出，其余实验条件不变。3个实验组分别在第1、3、5、7、14、21、28天时采集500 mL水样，每组3个重复。
每次取完水样，需立即用0.45 μm的玻璃纤维滤膜完成对eDNA的富集，eDNA富集完成后，将样品放置−80 ℃冰箱保存。
1.2 野外研究区域与采样方法样品采集地点为上海市崇明岛附近的长江口水域(图1)，采样时间为2023年5月28日至6月13日，累计采样14次。通过查阅文献以及参考往年调查数据，确定中华绒螯蟹蟹苗集中出现区域，设置2个采样点，分别为团结沙采样点与北八滧采样点，每个站点采样次数均为14次。蟹苗发生地位于九段沙附近[1]，北八滧采样点为距离蟹苗发生地较近采样点，团结沙采样点位于中华绒螯蟹的主要洄游通道的采样点。传统调查通过浮游生物采样网水平拖拽采集中华绒螯蟹蟹苗样品，采样网全长145 cm，网开口直径50 cm。在采样的同时进行eDNA样品采集，eDNA样品采集的为表层水水样，每次采集2个重复，每瓶水体积为1 L。采样前需要将采样瓶清洗消毒，并用该点水样润洗3次。水样采集完成后，先后采用孔径为1.2 μm和0.45 μm的玻璃纤维滤膜在12 h内完成对eDNA的富集，防止eDNA的降解。每次富集时需提前将设备清洗干净，减少对样品的污染，eDNA富集完成后，用镊子将滤膜放置到2 mL的离心管中，放置−80 ℃冰箱保存。
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图1 长江口中华绒螯蟹定点监测站点 Fig. 1 Monitoring stations for Eriocheir sinensis in the Yangtze River estuary |
基于历史调查结果，长江口存在的主要蟹类有中华绒螯蟹、狭额绒螯蟹(Eriocheir leptognathus)、天津厚蟹(Helice tientsinensis)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)、谭氏泥蟹(Ilyrplax deschampsi)、无齿螳臂相手蟹(Chiromantes dehaani)等7种[20]。根据NCBI数据库中中华绒螯蟹(GenBank: KM516908.1)及上述物种的CO I基因序列，利用CLUSTALW [Multiple Sequence Alignment-CLUSTAL W (genome.jp)]比对上述物种的CO I基因序列，并使用Primer Premier 5.0软件设计中华绒螯蟹CO I基因定量PCR扩增特异性引物与探针。引物扩增的目的片段长度为131 bp，前引物序列为CO I-F: TCTGATTATCCTGACGCCTATG，后引物序列为CO I-R: AAGATTACTGGGCGATTAGAAAC，探针序列为：CO I-P: AGCCGCATTAGGAT。引物的合成与测试由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.4 DNA提取与标准品制备DNA提取采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，并参照说明书对滤膜上的DNA进行提取。提取中华绒螯蟹肌肉组织中的基因组DNA，采用PCR技术扩增mtDNA CO I基因，扩增反应为25 μL的体系：2 μL的10× PCR buffer, 0.5 μL的10 mM dNTPs，上下游引物各0.5 μL (10 μM), 0.5 μL的Taq Plus DNA Polymerase (5 U/μL), 2 μL的25 mM MgCl2，以及2 μL模板DNA。PCR扩增实验程序为：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，上述3步骤进行35个循环，最后72 ℃ 8 min。
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒将目的片段进行回收纯化。使用生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒B518191 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，构建好的质粒经测序鉴定无误后用微量分光光度计测定质粒OD260的值，并换算成拷贝数(copies/µL)。10倍梯度稀释构建好的各质粒，90 µL稀释液+10 µL质粒，一共做6个点，每个点做3个重复，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。
1.5 荧光定量PCR检测将DNA样品稀释10倍作为模板上机检测。定量PCR试剂：2× TaqMan Fast qPCR Master Mix (B639274, BBI)。使用的定量PCR仪为LightCycler 480 II型荧光定量PCR仪(Roche, Rotkreuz, Switzerland)。荧光定量PCR为10 µL的反应体系，5 μL的2× TaqMan Fast qPCR Master Mix，上下游引物和探针各0.2 μL (10 μmol/L), 3.4 μL的ddH20，以及1 μL模板DNA。反应条件：94 ℃ 3 min, 45个循环(94 ℃ 15 s, 57 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s)。
1.6 数据处理通过已知拷贝数的标准品绘制标准曲线，从而计算待检基因的拷贝值，拷贝值(x0)的计算公式为：
| ${C_t} = - k \times {\rm{lg}}{x_0} + b$ | (1) |
此时计算出的拷贝值为每微升DNA的含量，需要乘以每个样品提取的DNA总量后，才是每个样品中的拷贝值，即单位为copies/L。采用SPSS 18.0软件中的Pearson相关性分析方法对水样eDNA浓度与蟹苗密度之间进行相关性分析。以调查时间为基础，绘制每次调查的蟹苗密度和eDNA浓度的柱状图；以蟹苗密度为基础，建立eDNA浓度与蟹苗密度之间的关系，以上绘图与建立模型均采用Origin2021软件进行。
采用错位相关法量化eDNA浓度与蟹苗密度之间的时滞效应[21]。按照观测时间将蟹苗密度时间序列xi与eDNA浓度时间序列yi一一对应，其次将数据以步长一天进行移动并计算两者之间的相关关系，当相关系数达到最大时，此时移动的时间即为两者的时滞时间，其中相关系数R的计算公式为：
| ${R_k} = \frac{{\sum\limits_{i = 1}^{n - k} {\left( {{x_i} - \overline {{x_i}} } \right)\left( {{y_{i + k}} - \overline {{y_{i + k}}} } \right)} }}{{\sqrt {\sum\limits_{i = 1}^{n - k} {{{\left( {{x_i} - {{\bar x}_i}} \right)}^2}} } \sqrt {\sum\limits_{i = 1}^{n - k} {\left( {{y_{i + k}} - \overline {{y_{i + k}}} } \right)} } }}$ | (2) |
式中，Rk为当移动数为k时的相关系数；n为样本量；xi蟹苗密度；yi+k为eDNA浓度；$\overline {{x_i}} $蟹苗密度均值；$\overline {{y_{i + k}}} $eDNA浓度均值。其中k=0, ±1, ±2, …, ±n，当k>0时表示蟹苗密度变化提前于eDNA浓度，反之则表示蟹苗密度变化滞后于eDNA浓度。
最大相关系数Rm为：
| ${R_{\rm{m}}} = {\rm{max}}\left( {{R_k}} \right)$ | (3) |
当相关系数达到最大时，时滞时间计算公式为：
| ${T_{\rm{L}}} = m$ | (4) |
式中，TL为时滞时间，d; m为相关系数最大时蟹苗密度序列的移动数。
2 结果与分析 2.1 引物特异性验证将引物和探针序列与其他蟹类进行了序列比对，结果显示该序列能够明显区分中华绒螯蟹与其他近缘物种(表1)。登录NCBI数据库对测序获得的序列进行相似性对比，对比结果表明qPCR扩增所得的产物与中华绒螯蟹核苷酸序列相似性达100%。
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表1 中华绒螯蟹与其他近缘物种的序列比对 Tab. 1 Sequence alignment of Eriocheir sinensis and other closely related species |
将构建好的各质粒，稀释不同倍数后用荧光定量PCR仪扩增，根据标准品浓度与扩增的Ct值生成标准曲线(图2)。标准曲线的方程如下：
| $y = - 3.509x + 41.07,{R^2} = 0.9985$ | (5) |
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图2 中华绒螯蟹CO Ⅰ基因引物标准曲线 Fig. 2 Standard curve of CO I gene primer in Eriocheir sinensis |
稀释的质粒标准品DNA浓度范围内具有良好的线性关系，表明建立的标准曲线能够准确地反映河蟹CO Ⅰ基因的扩增。
2.3 eDNA定量曲线的构建室内条件下，72 h内4个密度梯度实验组蟹苗的eDNA浓度分别为171.07±149.18、607.37±543.41、14024.49±2899.73、32445.44±4694.30 copies/mL，对照组中未检出蟹苗的CO I基因。将标准化后的蟹苗eDNA浓度与其个体数量间分别进行对数函数、线性方程与幂函数方程拟合(图3)，结果显示，二者之间的最佳方程为幂函数方程(表2) y=2.94x0.43, R2=0.9921。
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图3 中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间的关系 Fig. 3 Relationship between Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration |
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表2 中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间定量曲线拟合结果 Tab. 2 Quantitative curve fitting results of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration |
eDNA降解结果显示，在蟹苗去除后，水体中eDNA含量与时间为负相关。第1天检测时水体中eDNA浓度为2233.62 copies/mL，第5天检测时eDNA浓度为695.78 copies/mL，而后eDNA浓度逐渐降低，在第28天降解为65.71 copies/mL。用幂函数、线性方程和二次项方程拟合eDNA降解与时间之间的关系(图4)，发现最佳方程为幂函数方程(表3)，拟合方程为y=1102.29x−0.68, R2=5715。
09-1129-11-F004.jpg "点击查看原图") |
图4 中华绒螯蟹蟹苗eDNA在不同时间的降解 Fig. 4 Degradation of Eriocheir sinensis megalopa eDNA over time |
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表3 eDNA在不同时间的降解曲线拟合结果 Tab. 3 Curve fitting results of eDNA degradation over time |
浮游生物网监测结果显示(图5), 2023年5—6月调查北八滧水域蟹苗的密度为(23.03±55.10)个/m3。除5月28日、6月9日、6月12日和6月14日外，其余时间均监测到蟹苗的存在，6月4日的蟹苗密度达到最大值。
09-1129-11-F005.jpg "点击查看原图") |
图5 北八滧水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度的时间变化 Fig. 5 Temporal variation of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in the Beibayao waters |
eDNA监测结果表示(图5)，北八滧水域eDNA浓度为(9145.86±31147.36) copies/mL。其中，6月4日eDNA浓度达到最大值，总体上呈现先升后降的趋势。eDNA浓度与蟹苗密度的变化趋势一致，且在同一天达到最高值。
将北八滧水域的eDNA浓度数据进行标准化处理后，Pearson相关分析结果表明，北八滧水域蟹苗密度与eDNA浓度间极显著性相关(P<0.01)，相关系数为0.735。对蟹苗密度与标准化后的eDNA浓度进行线性、对数、幂函数拟合(图6)，结果表明，蟹苗密度与eDNA浓度间的幂函数方程拟合程度最高(表4)，方程为y=2.05×(x+0.17)0.14, R2=0.6712。
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图6 北八滧水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间的关系 Fig. 6 Relationship between Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in the Beibayao waters |
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表4 北八滧水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间拟合结果 Tab. 4 Fitting results of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in Beibayao waters |
团结沙水域监测结果显示(图7), 2023年5—6月浮游生物网监测的蟹苗密度为(0.38±1.03)个/m3，除5月28日、6月12日和6月13日外，其余时间均监测到蟹苗的存在，6月2日的蟹苗密度达到最大值。eDNA浓度为(29808.3± 98958.76) copies/mL，其中6月7日eDNA浓度达到最大值，总体上呈现先升后降的趋势。团结沙水域的eDNA浓度与蟹苗密度的变化趋势均为先升后降，但最高值出现的时间相隔5 d。
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图7 团结沙水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度的时间变化 Fig. 7 Temporal variation of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in Tuanjiesha waters |
将团结沙水域的eDNA浓度数据进行标准化处理后，Pearson相关分析结果表明，蟹苗密度与eDNA浓度之间不具有相关性(P>0.05)。对蟹苗密度与标准化后的eDNA浓度进行线性、对数、二次项方程拟合，结果表明，蟹苗密度与eDNA浓度间的拟合方程R2数值较低(表5、图8)，结合前述峰值日期差异，所以考虑二者之间是否具有时滞效应。
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表5 团结沙水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间拟合结果 Tab. 5 Fitting results of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in Tuanjiesha waters |
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图8 团结沙水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间的关系 Fig. 8 Relationship between Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration in the Tuanjiesha waters |
采用错位相关法量化两个采样点蟹苗密度与eDNA浓度之间的时滞效应。结果显示，北八滧水域不具有时滞效应，团结沙水域具有时滞效应。团结沙水域结果表明，当k=5时相关系数R最大，最大相关系数Rm为864.96，蟹苗密度变化早于eDNA浓度。当相关系数最大时，时滞时间为5 d。时滞后的Pearson相关分析结果表明，团结沙蟹苗密度与eDNA浓度间极显著性相关(P<0.01)，相关系数为0.949。时滞后的蟹苗密度与eDNA浓度如图9所示。
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图9 时滞修正后中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度的时间变化 Fig. 9 Temporal variation of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration after time delay correction |
将时滞后的eDNA浓度数据标准化处理后，对蟹苗密度与标准化后的eDNA浓度进行线性、幂函数、二次项函数拟合(图10)，结果表明蟹苗密度与eDNA浓度间的线性方程拟合程度最高(表6), y=0.78x+2.23, R2=0.7470。
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图10 时滞修正后中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间的关系 Fig. 10 Relationship between Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration after time delay correction |
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表6 时滞修正后方程中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度间拟合结果 Tab. 6 Fitting results of Eriocheir sinensis megalopa density and eDNA concentration equation after time delay correction |
本研究中，室内养殖72 h的条件下，4个浓度实验组蟹苗的eDNA浓度与其个体数量间幂函数方程拟合程度最高，二者之间具有正相关关系。这与Maruyama等[22]对蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)的定量研究，以及Takahara等[23]对鱼类生物量的研究相似，都得出eDNA浓度与生物量之间具有正相关关系的结论。Joseph等[24]的研究表明，eDNA的降解会影响物种的发生和分布数据。本研究中去除蟹苗后，eDNA降解结果显示，水体中eDNA含量与时间为负相关，eDNA浓度与时间的拟合方程，幂函数方程拟合程度最高。1个月的时间内，eDNA浓度从2233.62 copies/mL降解到65.71 copies/mL, eDNA会在1个月左右的时间内降解到较低浓度。这与李苗等[25]的研究相似。李苗等[25]发现室内条件下中国明对虾的eDNA可在水体中存留30 d, eDNA浓度与其生物量间的关系同样也是幂函数方程拟合程度最高。但是如何将室内定量曲线和野外实验研究很好地结合起来，目前还没有较好的解决方法。
3.2 蟹苗密度与eDNA浓度间的拟合运用eDNA技术进行定量研究，按照其具有处于不同的环境划分，可分为室内定量实验和野外应用实验，野外应用实验又可分为相对封闭水体(湖泊、水库等)与相对开放水体(江河、海洋等)。目前，eDNA技术在梯田、湖泊等环境较稳定的水域中应用效果较好，结合室内模拟结果，eDNA浓度变化可以较好地反映湖泊水域中物种生物量的变化情况。例如，郭娟等[26]比较了不同生物量条件下养殖水体麦穗鱼(Pseudorasbora parva) eDNA浓度的差异，结果显示eDNA浓度与生物量间呈正相关的线性关系。Spear等[27]比较了湖泊中大眼狮鲈(Sander vitreus)的丰度与eDNA浓度之间的关系，发现eDNA浓度与丰度之间存在显著性正相关关系。张方圆等[19]发现中华绒螯蟹亲蟹CPUE与表层水及底层水的eDNA浓度间均呈极显著相关关系。而李苗[28]与闫智聪等[29]的研究表明，海洋生物的生物量与其eDNA浓度之间并无显著的相关关系，这可能与海洋生态系统具有更加复杂的环境因素有关，eDNA浓度受其影响较大，从而导致研究对象的生物量与其eDNA浓度之间无显著关系。
本研究中在中华绒螯蟹蟹苗汛期监测的两个采样点，为北八滧水域和团结沙水域，两个采样点的eDNA浓度与生物量的变化，都呈现了先上升后下降的趋势。将两个采样点的eDNA浓度数据进行标准化处理后，分别做Pearson相关分析，结果表明，团结沙采样点的蟹苗密度与eDNA浓度之间不具有相关性，北八滧采样点的蟹苗密度与eDNA浓度之间具有极显著相关。本研究北八滧采样点的蟹苗密度与eDNA浓度之间具有较好的拟合方程，可能与选取实验的时间与物种有关，实验时间为5月下旬，正处于蟹苗汛期，实验物种较集中。而本研究两个实验地点，同一物种，同一时间进行实验，得到相关性不同的一个结果，可能与两个实验地点的环境有关。长江口具有其独特的生态系统，是区分于湖泊生态系统和海洋生态系统的一个生态系统。河口是受海洋和河流影响的海洋、咸水和淡水环境，并且河口在大小、水文环境和其他重要特征方面与海洋和淡水差异较大[30]。两个实验地点相比，北八滧采样点处于崇明岛北支，涨急流速相比落急流速偏大，在此区域潮水动力起主要作用。团结沙采样点处于崇明岛南支，虽然受到外海潮流影响，但是周围的围填工程会对潮流流速起减小作用，主要受径流作用影响[31]。
3.3 时滞效应原因的探讨时滞是时间滞后的简称，时滞效应最先运用到经济领域[32]，时滞效应的特点不仅表现为行动与效果之间存在时间差异，而且表现为传导过程中初始效果与最终证实效果之间存在差异。目前在全球植被对气候变化方面[33]，海洋初级生产力与输出生产力方面[34]都有关时滞效应的研究。采用错位相关法量化团结沙水域中华绒螯蟹蟹苗密度与eDNA浓度之间的时滞效应，发现蟹苗密度变化早于eDNA浓度，时滞时间为5 d。将时滞后的eDNA浓度数据标准化处理后，对蟹苗密度与标准化后的eDNA浓度进行方程拟合，结果表明蟹苗密度与eDNA浓度间的线性方程拟合程度最高。
本研究中团结沙水域传统方法监测中华绒螯蟹蟹苗与eDNA监测蟹苗同时间取样，结果显示蟹苗密度与eDNA之间的结果存在差异，蟹苗密度变化早于eDNA浓度。猜测原因如下：顾园沙水域附近为中华绒螯蟹蟹苗发生地[35]，根据中华绒螯蟹的洄游路线可知，从蟹苗发生地到达团结沙水域的时间大于到达北八滧水域的时间。在蟹苗洄游途中，生物体本身产生DNA的同时，DNA也会同步降解。团结沙水域虽然会受径流与潮流影响，但是周围具有围填工程，会对潮流流速起减小作用，所以团结沙水域主要受径流影响较大[36]。据堵南山[37]推测，蟹苗是垂直迁移，水平移动的行进方式，蟹苗在涨潮时借助潮水缘河而上，退潮时隐伏水底，并利用腹部附着在石块之下，等到下一次涨潮再继续上迁，即蟹苗迁移速度大于水体交换速度，最终蟹苗比其产生的eDNA先到达团结沙水域。所以团结沙水域的蟹苗密度与eDNA浓度之间具有时滞效应，蟹苗密度变化早于eDNA浓度。
蟹苗汛期监测期间，北八滧水域蟹苗的密度与标准化处理后的eDNA浓度间极显著性相关，对数方程拟合程度最高。团结沙水域蟹苗密度与eDNA浓度之间具有时滞效应，蟹苗密度变化提前于eDNA浓度，时滞时间为5 d。目前eDNA技术适用于蟹苗近发生地监测，不适用于蟹苗汛期远离发生地监测。
3.4 不足与展望由于河口环境较为复杂，室内模拟的eDNA定量曲线与降解规律暂时无法运用到野外环境，无法区分检测到的eDNA浓度是当天产生，还是多天累计产生。由于监测站点较少，导致现有数据无法解释蟹苗到达北八滧水域的时间，以及产生时滞效应的原因。
eDNA技术在水生生物资源评估中的应用具有高效、简便、对环境影响小等优点，但针对物种、地理环境、水文情况等不同其检测效果各异，定量评估资源量的方法仍需进一步完善。建立室内定量曲线与eDNA降解曲线时，要参照野外环境的水文因素等，或者要研究在开放水体的条件下，单个环境因子与多个环境因子与eDNA浓度与生物量之间的关系，以及单个环境因子与多个环境因子对eDNA降解速率的影响。增加蟹苗发生地到达北八滧水域之间的采样点，结合水动力模型研究蟹苗到达北八滧水域的时间，以及产生时滞效应的原因。
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