2025, Vol. 32 
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东 青岛 266071
3. 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, National Laboratory of Marine Aquaculture Breeding and Sustainable Production, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国特有的一种海水养殖鱼类，具有很高的营养价值和商业前景。然而，半滑舌鳎的雌、雄个体生长速率存在显著差异，导致雌性成鱼体重可达雄性成鱼体重的2~4倍[1]，这一现象限制了养殖户的生产积极性，进而制约了半滑舌鳎养殖业的进步与发展。基于这一产业问题，此前本研究室利用转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)基因组编辑技术，成功敲除了半滑舌鳎雄性决定dmrt1基因的8个碱基[2]，并繁殖出F3纯合突变雄鱼。纯合突变雄鱼的生长速度较普通雄鱼快2倍以上，体重接近普通雌鱼[3]，成功破解了半滑舌鳎雄鱼长不大的难题，也为半滑舌鳎基因编辑育种技术的建立奠定了基础。
肠道微生物对宿主免疫力的提高、营养吸收的改善、生长发育的调控等方面具有重要的影响[4]，肠道微生物可以在一定程度上反映基因编辑动物的健康状况。此外，基因编辑动物的肠道微生物可能以粪便的形式进入外界环境，进而影响外界环境中的其他个体以及微生物菌群。此前，有关转基因生物对周遭环境产生影响的报道引起了针对基因修饰生物环境安全性的强烈关注[5]，编辑后的基因是否会通过肠道微生物或者饲养过程中的其他行为对环境产生影响，是目前亟需探究的问题。
环境DNA (environmental DNA, eDNA)指生物在环境中遗留下来的DNA，通常来自于生物的脱落组织、黏液、分泌物、血液和尸体等。近年来，eDNA技术作为一种生态系统检测方法备受关注，尤其在水生生物多样性监测方面显示出广泛的应用潜力。然而，利用eDNA技术监测基因编辑动物的环境安全性尚未见相关研究报道。在实际应用中，检测养殖水体中的eDNA仍面临诸多挑战。与土壤环境相比，水环境中鱼类的分泌物和脱落组织占比较小，加之养殖水体的浑浊度较高，固体颗粒物容易堵塞滤膜孔径，从而可能影响eDNA的有效富集。因此，迫切需要为养殖水环境中的基因编辑动物环境风险监测开发合适的方法。
本研究通过16S rDNA高通量测序技术检测了半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼的肠道微生物群落，并检测了相同环境下混合饲养的普通雌、雄鱼体中是否出现编辑后的目的基因，此外，利用eDNA技术检测了dmrt1纯合突变雄鱼的养殖水环境与废水排放路径中是否存在编辑后的目的基因，以评估半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼的环境安全性。
1 材料与方法 1.1 dmrt1纯合突变雄鱼肠道微生物检测 1.1.1 实验材料本次实验共采集半滑舌鳎15尾，其中雌鱼、雄鱼、dmrt1纯合突变雄鱼各5尾，均为18月龄左右，2024年5月9日采集于唐山市维卓水产养殖基地，共同饲养于同一养殖池中3个月以上。其中，普通雄鱼的平均体重为(106.9±19.64) g，平均体长为(27.0±1.68) cm；野生型雌鱼的平均体重为(283.7±40.81) g，平均体长为(34.5±1.87) cm; dmrt1纯合突变雄鱼的平均体重为(209.65±27.25) g，平均体长为(35.8±6.21) cm。收集其肠道组织，过液氮后–80 ℃保存。
1.1.2 水环境样本采集在养殖池中使用采水器采集水样3 L，经200 μm筛绢筛绢过滤除去大型固体颗粒物，使用抽滤气压<250 mmHg的真空泵，将水环境样本注入抽滤杯后，使用5 μm聚碳酸酯膜(直径47 mm)滤膜过滤30 min，过滤后置入冷冻离心管中，过液氮后−80 ℃保存。
1.1.3 PCR扩增与测序提取各样本细菌总DNA，使用带有barcode的特异性引物扩增16S rDNA的V3~ V4区域[6](341F: 5ʹ-CCTACGGGNGGCWGCAG-3ʹ; 806R: 5ʹ-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3ʹ)[7]。将纯化后的扩增产物连接测序接头，构建测序文库，并进行Illumina测序。
1.1.4 数据处理获取原始数据序列(Raw Reads)之后，使用Usearch软件[8]对低质量的Reads进行过滤，然后将双端Reads拼接成Tag，并进一步过滤低质量Tag，得到高质量Tags (Clean Tags)。随后，根据Clean Tags进行聚类，去除聚类过程中检测到的嵌合体Tag，最终获得OUT (Operational Taxonomic Units)的丰度和OTU代表序列，进行物种注释，相似度阈值设定为97%。采用QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology)软件[9]分析Alpha多样性评估肠道微生物多样性，beta多样性评估样品物种差异；使用PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2)软件[10]，结合IMG (Integrated Microbial Genomes)细菌基因组和古菌基因组数据库，分析获得KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesv)群落功能分类信息[11]。
1.2 dmrt1纯合突变雄鱼环境安全检测 1.2.1 鱼类样品采集将20月龄的半滑舌鳎普通雌、雄鱼和dmrt1纯合突变雄鱼若干条混养在同一养殖池内3个月以上，dmrt1纯合突变雄鱼均打上电子标记。取池中无标记普通鱼16条，剪取鳍条，4 ℃酒精保存。
1.2.2 DNA提取及遗传性别鉴定使用TIANGEN TIANamp Marine Animals DNA Kit (天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA样品后，使用性别鉴定引物扩增(F: 5ʹ-CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC-3ʹ; R: 5ʹ-GATCCAGAGAAAA TAAACCCAGG-3ʹ)[12], PCR程序设定：95 ℃, 3 min; 95 ℃, 30 s, 55 ℃, 30 s, 72 ℃, 30 s，循环29次，72 ℃, 5 min。用琼脂糖凝胶电泳检测结果。
1.2.3 dmrt1基因编辑样品的靶位点片段扩增及测序使用崔忠凯[13]研发的半滑舌鳎dmrt1引物(F: 5ʹ-CGGGCAAAGGGAGAAGG-3ʹ, R: 5ʹ-AAAAACATCTCCTGAGGGCTAA-3ʹ)对dmrt1片段进行扩增，PCR程序设定：95°C, 3 min; 95 ℃, 30 s, 60 ℃, 30 s, 72 ℃, 40 s，循环31次，72 ℃, 5 min。用琼脂糖凝胶电泳检测结果，由北京擎科生物科技股份有限公司测序。
1.2.4 水环境样品采集半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼和普通雌、雄鱼混合饲养的养殖场布局如图1所示，沿排水管道设计了5个采样点，分别是A：养殖池内，B：养殖池侧排水口，C：养殖池外总排水口，D：养殖池外排水口5 m处，E：养殖池外排水口20 m处。每个采样点分别使用采水器采集底层水样3 L，每个采样点采集的水环境样品独立存放。
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图1 半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼和普通雌、雄鱼混合饲养水产养殖池排水路径 Fig. 1 Drainage path of mixed rearing aquaculture pond of mrt1–/– ZZ male and normal male Cynoglossus semilaevis |
采集到的水环境样品，先经200 μm筛绢筛绢过滤除去大型固体颗粒物，使用抽滤气压<250 mmHg的真空泵，将水环境样本注入抽滤杯后，使用5 μm聚碳酸酯膜(直径47 mm)滤膜过滤30 min，过滤后置入冷冻离心管中，过液氮后–80 ℃保存。
1.2.6 eDNA提取和扩增将上述滤纸剪碎后，依次加入0.11 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(pH=8.0), 10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，10 mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，简单离心，56 ℃温浴24 h以上。采用Zymo Research Quick-DNA Kits (Zymo Research，美国)按步骤提取滤纸上的eDNA，并检验提取的基因组eDNA浓度和质量，用作PCR模板。使用Miya等[14]设计的海洋鱼类通用引物MiFish (F: 5ʹ-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3ʹ, R: 5ʹ-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3ʹ)作为对照，PCR程序设定：94 ℃, 5 min; 94 ℃, 30 s, 60 ℃/55 ℃, 30 s, 72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃, 10 min。使用琼脂糖凝胶电泳检测结果后，片段交由北京擎科生物科技股份有限公司测序。
2 结果与分析 2.1 半滑舌鳎肠道微生物多样性分析结果质控后共测序获得有效序列(effective tags) 1755062条，平均每个样本117004条，每个样品的高质量Tags数量占据原始PE Reads数的百分比均在90%左右。将Tag序列按相似度97%聚类，共获得3416个OTUs。Alpha多样性分析结果如图2a、图2b所示，其中，dmrt1纯合突变雄鱼的Shannon指数略高，Simpson指数则是普通雌鱼略高，但是3组的两种指数之间均不存在显著性差异(P>0.05)。此外，基于OTU水平的PLS-DA分析如图2c所示，3组样本中F组样本点分布紧密，组内一致性最高。3组样本分布明显分离，显示组间存在显著差异，D组与M组分布最远，其差异显著，F组则介于两者之间。
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图2 dmrt1纯合突变雄性半滑舌鳎和普通雌、雄半滑舌鳎肠道菌群多样性指数a. Shannon指数；b. Simpson指数；c. 基于OTU水平的PLS-DA分析. D代表dmrt1纯合突变雄鱼组，F代表普通雌鱼组，M代表普通雄鱼组. Fig. 2 Diversity indices of intestinal microbiota in dmrt1–/– ZZ male and normal Cynoglossus semilaevisa. Shannon Index; b. Simpson Index; c. PLS-DA analysis based on OTU level. D: dmrt1–/– ZZ males; F: normal females; M: normal males. |
肠道微生物群落的组成结构分析结果(图3)表明，在门水平上共鉴定出24个菌门，3组中占绝对优势的均为变形菌门(Proteobacteria)，其次是厚壁菌门(Firmicutes)，二者相对丰度之和在 3 组的肠道菌群结构中均占比98%以上，变形菌门和厚壁菌门的相对丰度在纯合突变雄鱼和普通雌鱼之间不存在显著性差异(图3a)。在属水平上共鉴定出211个菌属，相对丰度较高的菌属主要包括弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发光菌属(Photobacterium)、阴道球菌属(Vagococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)等。其中，在普通雌鱼和雄鱼中占比最高的均是弧菌属，其次是不动杆菌属；而纯合突变雄鱼中占比最高的则是不动杆菌属，其次是弧菌属(图3b)。
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图3 dmrt1纯合突变雄性半滑舌鳎和普通雌、雄半滑舌鳎肠道菌群组成结构柱状图a. 门水平；b. 属水平. D代表dmrt1纯合突变雄鱼组，F代表普通雌鱼组，M代表普通雄鱼组. Fig. 3 Intestinal microbiota composition in dmrt1–/– ZZ male and normal Cynoglossus semilaevisa. phylum level; b. genus level. D: dmrt1–/– ZZ males; F: normal females; M: normal males. |
使用PICRUSt对菌群代谢功能进行预测结果如图4，三组注释的KEGG一级通路包括代谢、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理和生物体系统，除细胞过程在纯合突变雄鱼与普通雄鱼之间存在差异外，其余各项在纯合突变雄鱼和普通雌、雄鱼之间均不存在显著性差异。而二级通路上的主要信号通路包括碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、氨基酸代谢等。在丰度前十的功能中，除纯合突变雄鱼的外来化合物的生物降解与代谢功能与普通雄鱼存在差异外，其余各项在纯合突变雄鱼和普通雌、雄鱼之间均不存在显著性差异。
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图4 dmrt1纯合突变雄性半滑舌鳎和普通雌、雄半滑舌鳎肠道菌群代谢功能预测结果堆叠图D代表dmrt1纯合突变雄鱼组，F代表普通雌鱼组，M代表普通雄鱼组. Fig. 4 Predicted metabolic functions of intestinal microbiota in dmrt1–/– ZZ male and normal Cynoglossus semilaevisD: dmrt1–/– ZZ males; F: normal females; M: normal males. |
检验了半滑舌鳎养殖水环境中的微生物群落，与纯合突变雄鱼的肠道指示物种对比后发现(图5)，在门水平下，纯合突变雄鱼中总计鉴定了17个指示物种，其中16个都与水环境指示物种重合，仅有协同菌门(Synergistota)未从养殖水环境中检出，占比0.8914%。
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图5 dmrt1纯合突变雄性半滑舌鳎肠道微生物和水环境微生物指示物种venn图(门水平)D: dmrt1纯合突变雄鱼组，P：水环境组. Fig. 5 Venn diagram of intestinal microorganisms and aquatic environmental microbial species in dmrt1–/– ZZ male Cynoglossus semilaevis (phylum level)D: dmrt1–/– ZZ males; P: water environment. |
相同环境饲养的16条普通半滑舌鳎的基因型测序结果如图6所示。dmrt1纯合突变雄鱼的基因序列缺失碱基“TCGTGTCT”, 16个样品中均未出现碱基缺失现象，证明与dmrt1纯合突变雄鱼混合饲养的普通雌、雄鱼dmrt1基因并未出现碱基缺失现象。
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图6 普通半滑舌鳎基因型测序对比图D代表dmrt1纯合突变雄鱼组，F代表普通雌鱼组，M代表普通雄鱼组. Fig. 6 Genotype sequencing comparison chart of normal Cynoglossus semilaevisD: dmrt1–/– ZZ males; F: normal females; M: normal males. |
通过设置的对照组检测了dmrt1纯合突变雄鱼和普通雌、雄鱼混合养殖的水环境及排水路径中是否存在编辑后的目的基因，结果如图7所示。5个水环境样品中均扩增出MiFish产物(图7a)，证明水环境eDNA样本提取成功。而使用dmrt1基因鉴定引物扩增后，均未出现条带。进一步将扩增得到的MiFish产物测序后使用NCBI (National Center for Biotechnology Information)进行序列比对，与此前发布的半滑舌鳎全基因组序列[15]相似度为100 % (图7b)，证明所扩增的MiFish产物属于半滑舌鳎。环境中可以检测到半滑舌鳎的12S RNA基因，但无法检测到半滑舌鳎dmrt1基因，表明碱基敲除的dmrt1基因未漂移到环境水体中。
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图7 dmrt1纯合突变雄性半滑舌鳎养殖水环境eDNA检测图a. 5个水环境样品产物扩增结果；b.测序结果NCBI比对图. A：养殖池内水样eDNA, B：养殖池侧排水口水样eDNA, C：养殖池外总排水口水样eDNA, D：养殖池外排水口5 m处水样eDNA, E：养殖池外排水口20 m处水样eDNA, marker: DL2000;. Fig. 7 eDNA of the breeding environment of dmrt1–/– ZZ male Cynoglossus semilaevisa. Amplification results of MiFish in five water environmental samples; b. NCBI sequencing alignment. A: eDNA of inside the breeding pond, B: eDNA of side outlet of the breeding pond, C: eDNA of main outlet outside the breeding pond, D: eDNA of 5 m from the outlet outside the breeding pond, E: eDNA of 20 m from the outlet outside the breeding pond; marker: DL2000. |
目前，伴随着基因修饰技术的进步与发展，解决了许多传统育种手段无法克服的问题，如抗病性和产量提升等，为农业生物技术的发展提供了重要推动力。与此同时，其潜在的安全性问题也引发了公众的广泛关注，需要进一步研究和监管。此前有报道表明，fat-1转基因牛的肠道微生物组成产生了显著性变化[16]。但在GH转基因羊[17]和sFat-1转基因猪[18]中的研究表明，导入外源基因的宿主并未在肠道菌群结构上发生显著变化。相比转基因技术，基因编辑技术具有不涉及外源基因的优点。在MSTN基因编辑猪[19]、VEGF基因编辑羊[20]等的研究中尚未发现基因编辑对动物肠道菌群产生显著性影响的现象。
本研究的结果显示，半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼的肠道菌群Alpha多样性与普通雌、雄鱼之间均不存在显著性差异，说明dmrt1基因突变对其肠道菌群不产生显著影响。另一方面，dmrt1纯合突变雄鱼在三组中Shannon指数最高，反映了其肠道微生物群落可能具有较高的物种丰富度和均匀度。此外还发现，在门分类水平下，dmrt1纯合突变雄鱼的肠道微生物组成结构与普通雌鱼之间不存在显著性差异，但与普通雄鱼之间存在显著性差异。肠道微生物的不同可能影响生长差异，如在鲟科鱼类的研究中发现鞘氨醇单胞菌属和梭菌科细菌可能影响其生长速率[21]，在大黄鱼中发现变形菌门对其生长速率存在一定影响[22]。dmrt1纯合突变雄鱼肠道菌群的组成结构和雌鱼更为相似，推测其中可能存在某些参与调控生长速率的微生物群体，对dmrt1纯合突变雄鱼生长速度的提高起到一定作用。在门水平下，三组半滑舌鳎的肠道中变形菌门和拟杆菌门均为优势菌群，这与此前张正等[23]和张燕玉等[24]的报道一致。这两类菌种也是鱼类肠道的常见优势菌种，主要参与宿主的营养吸收与免疫反应等作用[25]。而在属水平下，在三组半滑舌鳎中丰度较高的不动杆菌属、弧菌属、发光菌属等也是鱼类肠道中的常见细菌[26]。一些与生长调控相关的肠道微生物在dmrt1纯合突变雄鱼中也出现了丰度提高，如假单胞菌属(Pseudomonas)[27]、盐单胞菌属(Halomonas)[28]等，可能参与作用于dmrt1纯合突变雄鱼生长速度的提高。此外，此前有报道表明，环境或饲料中适应肠道环境的细菌是鱼类肠道微生物的主要来源[29]。本研究结果中鱼类肠道微生物中的指示物种和养殖水环境高度重合，唯一不存在于水环境中的是协同菌门，协同菌门通常为厌氧菌，而养殖水体中往往溶解氧含量较高，可能抑制其生长。
基因修饰动物的环境风险也是目前的另一大议题，可能存在的环境风险包括是否会对同环境中养殖的其他个体产生影响，是否会对环境中的微生物产生影响等[30]。此前有关环境监测的研究主要聚焦在陆生动物，通常采用检测土壤微生物的方式，对养殖环境周遭一定距离内的环境风险进行监测[31]。水生动物较陆生动物而言，具有更难以检测、难以管控的特点，其环境风险的监测也存在许多不确定性。本研究一方面检测了同一环境中混合养殖的其他个体的基因型，确认了同一水环境中的其他个体基因型均未发生变化；另一方面，基于水环境eDNA技术，提出了一种针对水生基因编辑动物环境风险的可能监测方式，结果显示在养殖水环境及其排水路径中，并未检测到编辑后的目的基因，由此判断半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼并不存在环境安全风险。
此前，国内外有关鱼类肠道菌群的研究主要聚焦于外源性的影响因素，如饲料、饲养环境等，但是对于内源性影响因素的关注较少。本研究在控制外部饲养环境的条件下，着重探究了基因编辑对半滑舌鳎肠道菌群的影响，并进一步监测了可能由肠道菌群引发的环境风险，确认同一环境中混合养殖的其他个体及养殖环境水体均未受到影响。综上所述，本研究探究了半滑舌鳎dmrt1纯合突变雄鱼的肠道菌群特征以及环境安全性，为基因编辑水生动物的安全性评价方法提供了参考。
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