多聚免疫球蛋白受体(polymeric immurnoglobulin receptor, pIgR)是免疫球蛋白超家族的组成成员之一，在先天性免疫与获得性免疫中均起着重要作用^[1-2]。目前，已在多种硬骨鱼类，如团头鲂(Megalobrama amblycephala)，草鱼(Ctenopharynodon idella)，泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)，鳜(Siniperca chuatsi)，青鲫(Carassius auratus indigentiaus)，中华鳖(Pelodiscus sinensis)中克隆获得plgR基因^[3-9]。哺乳动物pIgR能与四聚体IgM或二聚体IgA相结合，具有5个免疫球蛋白样功能域(Ig-like domains, ILD)，鸟类和两栖动物pIgR存在4个ILDs，分别与哺乳动物的第1个、第3个、第4个和第5个ILD结构域具有高度的相似性^[10-11]。硬骨鱼类pIgR只具有2个ILDs，其与哺乳动物第1个和第5个ILD具有高度的同源性。

鱼类的黏膜免疫系统是抵御外界病原感染的第一道防线，是鱼类免疫系统的重要组成部分。pIgR是鱼类黏膜免疫系统中一个重要因子，其在介导多聚免疫球蛋白抵御病原感染的免疫反应中起着关键作用^[12-14]。在哺乳动物中，经蛋白酶水解，pIgR的分泌成分(secretory component, SC)与其配体一起从顶膜释放，导致sIgAs或游离SC释放到顶腔中^[15]。硬骨鱼类pIgR在分子结构和免疫功能上与哺乳动物pIgR具有高度的相似性，在转运IgM和IgT的过程中起着重要的作用^[16]。牙鲆(Paralichthys olivaceus) pIgR能促进IgM-抗原复合物经免疫排泄进入肠道黏膜，经鳗弧菌疫苗接种后，其胆汁和黏液中能诱导产生pIgR-IgM复合物，此外，在牙鲆的黏液中发现存在pIgR的分泌成分，而血清没有^[17-19]。虹鳟(Oncorhynchus mykiss) pIgR能转运肠黏液中的四聚体IgT进入肠腔，可抑制肠腔被细菌感染，其在虹鳟肠黏膜中发挥关键的免疫功能^[20]。然而，目前鱼类被嗜水气单胞菌感染，pIgR在免疫系统中的作用机制尚不清楚。

鳙(Aristichthys nobilis)，俗称雄鱼、大头鱼、胖头、花鲢，其与白鲢、草鱼及青鱼并称为我国的四大家鱼。近年来，鳙养殖业发展速度极其迅猛，虽带来了显著的经济效益和社会效益，但高密度精养和环境恶化使鳙遭受的胁迫日益严重。嗜水气单胞菌感染引起的细菌性出血病对鳙的危害最为严重，具有季节性、爆发性、死亡率高等特点。目前，关于鳙感染嗜水气单胞菌后的组织病理变化及pIgR基因免疫响应的研究尚未见报道。本研究以鳙为研究对象，通过组织切片与苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE) 检测鳙感染嗜水气单胞菌后不同组织的病理变化；利用PCR与RACE技术克隆鳙pIgR基因，分析其序列特征，并检测pIgR基因在鳙不同组织中的表达及对嗜水气单胞菌的免疫响应，以期阐明鳙pIgR 在抵御嗜水气单胞菌感染过程中的免疫应答规律，为鳙健康养殖与利用鱼类的免疫系统进行病害防控提供指导依据。

实验鳙(100±2) g取自湖南文理学院鱼类繁育与健康养殖基地。在取样前，实验鱼在暂养池中暂养14 d，在此期间24 h充氧曝气，控制溶氧量为(6.0±0.2) μg/mL，保持水中溶氧充足，同时控制水温在(26±2) ℃，并每天投喂两次适量的鳙膨化颗粒料。将正常健康的鳙通过鱼用麻醉剂三卡因(MS-222)麻醉，利用1 mL无菌注射器进行尾静脉取血，然后分别取肌肉、皮肤、鳃、肝脏、脾脏、肠、中肾、心脏、头肾等组织约100 mg。经液氮速冻后，保存于–80 ℃冰箱，用于RNA的提取。

取300尾体重(100±2) g的鳙，暂养于室内循环水暂养池中，控制水温为(26±2) ℃，每天9:00和17:00定时投喂适量的鳙成鱼颗粒膨化料一次，使实验鳙达到饱食状态。实验过程保持充足氧气。从患出血病的鳙体内分离鉴定获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，挑选单克隆菌株接种到LB液体培养基中进行扩大培养，在28 ℃的恒温摇床中震荡培养24 h。通过预实验探索，嗜水气单胞菌对鳙的半致死浓度约为1×10⁷ CFU/mL。对鳙进行腹腔注射感染嗜水气单胞菌，实验组注射0.1 mL (1×10⁷ CFU/mL)嗜水气单胞菌的悬液，对照组注射0.1 mL PBS，观察鳙的发病情况，在感染嗜水气单胞菌5 d取有典型病症的鳙，经MS-222麻醉，用注射器尾静脉取血后，进行解剖观察，并取头肾、脾脏、肝脏、肠和鳃组织3~5 mm于4%的中性甲醛固定，根据于永耀等人报道的泥鳅感染嗜水气单胞菌后组织病理变化的研究方法^[5]，对鳙头肾、脾脏、肝脏、肠和鳃组织进行HE染色与观察，并进行比较分析。

在嗜水气单胞菌感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d和 28 d，从实验组和对照组分别取5条鳙，通过MS-222麻醉后，进行尾静脉取血，然后取肠、鳃、肝脏、脾、头肾组织100 mg，经液氮速冻后，保存于–80 ℃冰箱，用于后续提取不同时间点各组织中的RNA。

利用动物组织总RNA提取试剂盒(Simgen，中国)，根据其说明书的操作方法，提取鳙头肾总RNA，利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳20 min，在凝胶成像仪中进行观察与拍照，检测头肾RNA的完整性，利用微量核酸测定仪检测RNA的浓度与纯度。选择经凝胶电泳后完整性好的RNA作为模板，利用反转录试剂盒(Simgen)，根据其说明书的操作方法，反转录获得鳙头肾cDNA，保存于–20 ℃冰箱备用。

利用Primer 6.0软件，根据NCBI中已公布的鲤科鱼类pIgR基因序列，设计鳙pIgR基因中间序列扩增引物(表1)，以头肾cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳35 min，将目的条带进行胶回收与纯化，然后与PMD19-T载体连接，经转化与蓝白斑筛选后，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测与测序。

表1

表1 　鳙pIgR基因扩增所用引物 Tab. 1 　Primers used to amplify the Aristichthys nobilis pIgR gene 引物名称primer name 引物序列(5ʹ‒3ʹ) primer sequence (5ʹ‒3ʹ) 中间序列扩增引物 primers for partial cDNA fragments pIgR-F CACGGCAGGATGATAGAC pIgR-R CACACCACAAGAGGAGAC RACE引物Primer for RACE primer for 3' RACE (3ʹ GSP) GATTACGCCAAGCTTGCGACGGATTCTGAAGGAG primer for 5' RACE (5ʹ GSP) GATTACGCCAAGCTTGTGGATGAGCACACTTCTAC long primer TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT short primer CTAATACGACTCACTATAGGGC ORF引物Primers for ORF ORF-F CCGATGGTTTATCACACTCG ORF-R TGGCAACACTATCAACACTA 实时荧光定量PCR引物 primers for quantitative Real-time PCR qRT-F AAGGAGCATTCAGCAGTAG qRT-R CACACCACAAGAGGAGAC β-actin-F CTCTGCTATGTGGCTCTTGAC β-actin-R GAGTATTTACGCTCAGGTGGG

表1 　鳙pIgR基因扩增所用引物 Tab. 1 　Primers used to amplify the Aristichthys nobilis pIgR gene

根据测序获得的鳙pIgR基因中间序列，设计3ʹ和5ʹRACE引物，以鳙头肾RNA为模板，利用SMARTer RACE 5'/3'Kit试剂盒(TaKaRa，日本)，根据试剂盒说明书的操作方法，扩增鳙pIgR基因 cDNA的3ʹ和5ʹ端序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，通过胶回收与纯化，将纯化的PCR产物链接到lineraried pRACE载体，转化到DH5α感受态细胞，经选择培养基筛选，挑选阳性克隆进行测序。将测序获得的3ʹ和5ʹ两端序列与中间序列进行拼接，获得鳙pIgR基因全长cDNA序列，再根据拼接获得的序列，利用Primer 6.0软件在起始密码子上游和终止密码子下游，设计一对特异性引物，对鳙pIgR基因开放阅读框(open reading frame, ORF)序列进行扩增与验证。

利用DNAstar软件对测序获得的中间序列，3ʹ和5ʹ两端序列进行拼接获得鳙pIgR基因cDNA全长序列。通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)中的open reading frame finder在线软件寻找鳙pIgR基因完整的ORF并对其氨基酸序列进行预测，利用Blastn在线软件在GenBank中对pIgR基因进行同源序列检索。通过SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)和UniProt (http://www.uniprot.org/)在线软件对鳙pIgR氨基酸结构域进行分析与标注。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)在线软件预测鳙pIgR的三级结构。利用Clustal X 1.83软件进行pIgR氨基酸多重序列比对分析。根据pIgR氨基酸序列，通过MEGA 5.0软件构建遗传系统进化树(NJ法，1000次)。

通过动物组织总RNA提取试剂盒(Simgen)，根据其说明书的操作方法，提取鳙不同组织的RNA，并利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录获得鳙不同组织的cDNA模板。根据已获得的鳙pIgR基因cDNA序列，利用Primer 6.0软件设计qRT-PCR引物，利用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(TaKaRa，日本)，以β-actin基因为内参基因，通过qRT-PCR检测pIgR基因在鳙各组织中的表达水平，采用ΔΔC_t法计算pIgR基因在不同组织中的相对表达量。

pIgR基因的相对表达量通过平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示，利用Excel软件和SPSS 18.0软件进行实验数据分析。P>0.05表示没有显著性差异，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

鳙pIgR基因cDNA序列全长1885 bp (GeneBank登录号：PQ227070), 5′非编码区(untranslated region, UTR)长57 bp, 3′ UTR 长820 bp，在 3′非编码区中包含一个终止密码子(TAA)和Poly A尾。鳙pIgR基因ORF长1008 bp，编码336氨基酸，其分子式为C₁₆₃₁H₂₅₆₈N₄₄₈O₄₉₇S₂₄，理论分子量为 37.17 kD，理论等电点为 7.51。pIgR 氨基酸序列中包含2个N-糖基化位点，4个保守的半胱氨酸。鳙pIgR蛋白结构分析发现，信号肽序列(signal peptide, SP)位于1~20氨基酸之间，其后依次为胞外区、跨膜区(transmembrane region, TM)以及胞内区，分别由243、23和50个氨基酸组成。胞外区中存在2个ILD, ILD1位于第21个氨基酸至第115氨基酸之间，ILD2位于第134氨基酸至第227个氨基酸之间(图1)。鳙pIgR蛋白整体呈扭曲的“L”型，主要由反向平行β折叠和无规卷曲组成(图2)。

图1

图1 　鳙pIgR基因全长cDNA序列及推测的氨基酸序列分析*表示终止密码子；双下划线表示poly A序列；氨基酸分区用箭头表示，黑五角星表示可能形成二硫键的半胱氨酸，波浪号表示糖基化位点. Fig. 1 　Sequencing results and amino acid sequence analysis of pIgR in Aristichthys nobilis* denotes a stop codon. A double underline indicates a poly A sequence. Arrows indicated amino acid partitions. The black pentagram indicates the cysteine that may form disulfide bonds. Tildes represent the glycosylation sites.

图2

图2 　鳙pIgR蛋白预测的三级结构 Fig. 2 　Predicted tertiary structure of Aristichthys nobilis pIgR protein

多重序列比对结果显示(图3)，鳙pIgR的胞外区缺失ILD2、ILD3和ILD4，只有两个ILD，鳙pIgR的两个ILD分别与哺乳动物的ILD1和ILD5具有高度的相似性。在鸟类与哺乳类动物的 ILD1中均包含3个互补决定区(complementary determining region, CDR)，而鳙pIgR的ILD1中没有CDR。在硬骨鱼类、鸟类与哺乳类动物pIgR的ILD1结构域中均存在KYWC和DSGWYWC独特且保守的氨基酸序列，在ILD2结构域中具有Kx WC和DxGWYWC (x表示其他氨基酸)保守的序列，在ILD1与ILD2中均具有2个保守且位置相同的半胱氨酸残基。

图3

图3 　鳙pIgR氨基酸序列与其他鱼类pIgR多重序列比对分析黑色五角星表示保守的半胱氨酸位点；红色字符表示独特且保守的氨基酸序列. Fig. 3 　Multiple sequence alignment analysis of Aristichthys nobilis pIgR amino acid sequence with pIgR of other speciesThe black pentagrams indicates conserved cysteine sites. Red characters represent unique and conservative amino acid sequences.

利用Blastp在线软件将鳙pIgR基因预测的氨基酸序列在基因库中进行同源序列检索，鳙pIgR氨基酸序列与其他鱼类pIgR的相似性依次为团头鲂(Megalobrama amblycephala 92.56%)、麦穗鱼(Pseudorasbora parva 84.88%)、鲤(Cyprinus carpio 76.87%)、斑马鱼(Danio rerio 75.81%)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus 69.82%)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss 51.38%)。通过MEGA 5.0软件，利用邻接法(Neighbor-joining method, NJ)构建遗传系统进化树，发现鳙pIgR与同属鲤形目鱼类的pIgR聚为一簇，且鳙pIgR与团头鲂pIgR聚为一个分支，表明鳙与团头鲂亲缘关系最近(图4)。

图4

图4 　pIgR基因遗传系统进化树黑色三角形表示鳙. Fig. 4 　Genetic phylogenetic tree of pIgR geneThe black triangle represents Aristichthys nobilis.

pIgR基因在正常健康鳙的不同组织中均有表达，其在肝脏中的表达量最高，其次为脾、肠、头肾、鳃及皮肤，在中肾、心及脑组织中具有较低的表达量，在鳙肌肉中pIgR基因的相对表达量最低(图5)。

图5

图5 　鳙pIgR基因在不同组织的相对表达量不同字母表示组织间pIgR表达量差异显著(P<0.05). Fig. 5 　Relative expression of pIgR gene in different tissues of Aristichthys nobilisDifferent letters indicate significant difference in pIgR expression between different tissue (P<0.05).

鳙感染嗜水气单胞菌后，肠、鳃、肝、脾脏及头肾中pIgR基因的表达量在感染的28 d内，呈先升高后降低的趋势(图6)。鳙头肾中pIgR基因的表达水平在感染后3 d显著性升高，在感染7 d达到最高水平(9.38倍，P<0.01)，然后在感染28 d降至2.46倍，显著性高于对照组(P<0.01)。在脾脏中，pIgR基因的表达水平在感染后逐渐升高，在14 d达到峰值(15.98倍，P<0.01)，然后逐渐降低，在感染28 d降至2.61倍，但仍然显著性高于对照组(P<0.01)。在肠与鳃，pIgR基因的表达水平均在感染5 d达到峰值，分别是对照组的18.63倍及16.53倍(P<0.01)，然后逐渐下降，在28 d与对照组比较没有显著性差异(P>0.05)。在肝中，pIgR基因表达水平在感染1 d显著性升高，在14 d达到峰值(12.28倍，P<0.01)，然后逐渐降低，在28 d下降至1.35倍，与对照组比较，没有显著性差异，(P<0.05)。

图6

图6 　嗜水气单胞菌感染后鳙pIgR基因在不同组织的表达变化*表示差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 6 　Changes of pIgR gene expression in different tissues of Aristichthys nobilis after Aeromonas hydrophila infection* indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01).

鳙被嗜水气单胞菌感染5 d，通过组织切片与HE染色观察发现，肠道绒毛黏液细胞增多，肠绒毛宽度增大，肠壁肌肉层厚度增加(图7)；头肾与脾脏组织出现炎症细胞侵染，脾脏中出现大量的空泡细胞；肝脏肝窦增宽；鳃丝变形缩短，鳃丝细胞凋落(图8)。

图7

图7 　感染嗜水气单胞菌5 d后鳙肠组织病理变化a. 对照组肠；b. 实验组肠；c. 肠绒毛长度；d. 肌层厚度. 红色箭头表示黏液细胞；**表示差异极显著(P<0.01). Fig. 7 　Pathological changes of intestinal tissue of Aristichthys nobilis at the 5th day after infection with Aeromonas hydrophilaa. Intestines of control group; b. Intestines of experimental group; c. Intestinal villi length; d. Muscle thickness. The red arrows represent the mucus cells. ** is considered an extremely significant difference (P<0.01).

图8

图8 　感染嗜水气单胞菌5d鳙头肾、脾脏、肝脏和鳃组织病理变化a. 对照组脾脏；a1. 实验组脾脏；b. 对照组头肾；b1. 实验组头肾；c. 对照组肝脏；c1. 实验组肝脏；d. 对照组鳃；d1. 实验组鳃. 红色箭头表示空泡细胞，黑色圈表示炎症细胞，黑色三角形表示肝窦增宽，红色直线表示鳃丝长度. Fig. 8 　Pathological changes of head kidney, spleen, liver and gill of Aristichthys nobilis at the 5th day after infection with Aeromonas hydrophilaa. Spleen of control group; a1. Spleen of experimental group; b. Head kidney of control group; b1. Head kidney of experimental group; c. Liver of control group; c1. Liver of experimental group; d. Gill of control group; d1. Gill of experimental group; The red arrows indicate vacuolar cells, the black circles indicate inflammatory cells, the black triangles indicate the width of hepatic sinuses, and the red straight line indicates the length of gill filaments.

本研究克隆获得了鳙pIgR基因cDNA全长序列，鳙pIgR氨基酸序列与其他鱼类的相似性从高到低依次是草鱼(95.68%)、团头鲂(92.56%)、麦穗鱼(84.88%)、鲤(76.87%)、鲫(76.09%)、斑马鱼(75.81%)、泥鳅(69.82%)、虹鳟(51.38%)。鳙pIgR氨基酸序列与其他鱼类，尤其是鲤科鱼类的pIgR氨基酸序列具有高度的相似性。通过系统进化树分析，发现鳙pIgR与同属鲤科鱼类的pIgR聚为一支，其原因可能是鳙属于鲤形目鱼类，其与鲤科鱼类具有较近的亲缘关系，其中鳙与团头鲂聚为一个分支，表明鳙与团头鲂亲缘关系最近。

pIgR氨基酸多重序列比对结果显示，鳙pIgR和其他硬骨鱼类的pIgR一样，其胞外区缺失ILD2、ILD3和ILD4，只有两个ILD (ILD1和ILD2)^[3]。鳙pIgR的ILD1和ILD2中均具有Kx WC和Dx Gx Yx C的保守序列，与哺乳动物pIgR的ILD1和ILD5具有高度的相似性^[16]。哺乳动物的多聚免疫球蛋白能与pIgR的ILD1与ILD5结合，其在多聚免疫球蛋白的转运过程中起着重要的作用^[15]。鳙pIgR的ILD1和ILD2对应哺乳动物pIgR的ILD1和ILD5，据此推测鳙pIgR的2个ILD也能与多聚免疫球蛋白结合并介导其转运。不同鱼类pIgR的ILD1与ILD2中都包含4个保守且位置相同的半胱氨酸(Cys)，哺乳动物pIgR的 ILD1与ILD5的这4 个保守Cys，可形成2个二硫键，参与β折叠的形成，从而与多聚免疫球蛋白结合。与哺乳动物pIgR的ILD5相比，鳙pIgR的ILD2少2个Cys，哺乳动物ILD5的这 2 个Cys能与Ig A共价结合，表明鳙ILD2和免疫球蛋白结合不需要这 2 个Cys，推测鳙ILD2与黏液免疫球蛋白的结合方式和哺乳类动物pIgR的ILD5 结合免疫球蛋白的方式不同^[16]。在pIgR与免疫球蛋白结合的过程中，环状互补决定区(complementary determining region, CDR)起着关键的作用^[21]。然而，鳙ILD1 中不具有鸟类与哺乳类动物ILD1中所存在的CDR，因此，鳙pIgR与免疫球蛋白的结合方式还有待进一步深入研究。

pIgR基因在不同鱼类的各种组织中广泛表达(如肠、皮肤、鳃、肝、脾和头肾)^{[3-6, 8, 13, 16, 22-24]}。在本研究中，pIgR基因在正常健康鳙的不同组织中均有表达，其在肝脏中的表达量最高，在脾、肠、头肾、鳃及皮肤的表达量次之，在中肾、心及脑组织中具有较低的表达量，pIgR基因在鳙肌肉中的表达水平最低。pIgR基因在鳙各组织中的表达规律与其在团头鲂^[3]、青鲫^[8]、鲤^[22]、牙鲆^[13]和海鲈^[25]中的研究结果相似，其在肝脏中表达量最高。肝脏是重要的解毒与免疫应答器官，在鱼类肝脏中可以刺激大量免疫相关基因的表达来提高免疫防御，此外，在鱼的胆管和毛细血管中检测到黏膜IgM^[26-27]。肝脏中的pIgR 在介导黏液IgM从肝脏经胞吞入胆汁，继而进入肠道中，发挥了重要作用^[27]。牙鲆pIgR基因的相对表达量在皮肤、鳃、肠和肝脏中较高，在前肾和脾脏中次之，在肌肉和胃中表达量最低 ^[19]。青鲫与大鳞副泥鳅pIgR基因在黏膜免疫相关组织中具有较高的表达量^{[5, 8]}。通过原位杂交检测发现pIgR主要分布于鲤与红鳍东方鲀的黏膜免疫相关组织(肠上皮细胞和皮肤)^{[16, 22]}。在本研究中，鳙pIgR基因在皮肤、鳃和肠道等黏膜免疫组织中均有较高的表达，表明pIgR可能在鳙黏膜免疫系统中发挥重要的作用。

不同的病原刺激，pIgR基因的免疫应答规律不同。大菱鲆在灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激72 h内，皮肤、鳃、胃、肠、脾脏、肝和头肾中pIgR基因的转录水平先升高后降低^[6]。泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)感染小瓜虫，pIgR基因在鳃、皮肤、肾脏和脾脏中的表达量均在感染后14 d达到峰值^[5]。本研究对鳙进行腹腔注射感染嗜水气单胞菌，鳙头肾、脾脏、肝、肠和鳃中pIgR基因的转录水平在感染的28 d内呈先升高后降低的趋势，表明嗜水气单胞菌能诱导鳙pIgR基因的表达，在健康鳙各组织中pIgR基因均有不同水平的表达，因此，pIgR基因在鳙体内的表达模式是诱导型和组成型同时存在。大菱鲆经灭活鳗弧菌浸泡刺激后，pIgR基因的转录水平在鳃中8 h出现峰值，在胃中12 h出现峰值，在肝、肠和皮肤中24 h达到峰值，而在头肾和脾中48 h出现峰值^[6]。鳙感染嗜水气单胞菌后，pIgR基因的表达量在肠和鳃中在感染5 d达到最大值，头肾中pIgR基因的表达水平在7 d达到峰值，脾和肝脏中pIgR基因在14 d达到峰值，pIgR基因在黏膜免疫相关组织(鳃和肠)达到峰值的时间要早于系统免疫相关组织(头肾和脾脏)，且在黏膜免疫组织中达到峰值的相对表达量高于其在系统免疫组织的相对表达量，表明在鳙抵御嗜水气单胞菌感染过程中，pIgR可能在黏膜免疫系统起到重要作用。

嗜水气单胞菌可引发鱼类的败血症和内脏出血。鱼类的肝脏不仅具有解毒的功能，同时能分泌大量的抗应激与免疫相关因子参与免疫防御^[27]。青鲫感染嗜水气单胞菌后，肝脏有明显的出血症状，且细胞出现空泡^[8]。团头鲂经肛门灌注感染嗜水气单胞菌，肝脏组织出血，肝窦增宽^[3]。在本研究中，鳙经腹腔注射感染嗜水气单胞菌，肝脏出现肝窦增宽，结构紊乱的现象，表明嗜水气单胞菌感染鳙，导致肝脏组织受损，其解毒与免疫防御功能降低。

肠与鳃是鱼类重要的黏膜免疫组织，在抵御病原菌感染过程中起着关键的作用。青鲫被嗜水气单胞菌感染，鳃丝萎缩变短，肠绒毛缩短，杯状细胞增多^[8]。香鱼感染嗜水气单胞菌，病鱼鳃表面纤毛破损，鳃小片结构崩解形成空泡，造成病鱼严重的呼吸系统障碍，肠道黏膜表面的隐窝和上皮内出现大量杯状细胞，这些杯状细胞主要功能是分泌黏液蛋白，这些蛋白覆盖在黏膜表面不仅可以保护其不被细菌侵染，而且可以分泌溶菌酶起到杀菌的作用^[28]。团头鲂经肛门灌注感染嗜水气单胞菌，肠道充血，肠绒毛变形，宽度增宽，肠壁增厚，鳃丝细胞萎缩，鳃丝缩短变形^[3]。鳙经腹腔注射感染嗜水气单胞菌，肠道绒毛黏液细胞增多，肠绒毛增宽，肠壁肌肉层增厚，表现出明显的肠道炎症症状。鳙在感染嗜水气单胞菌5 d，鳃丝缩短变形，鳃丝细胞凋落，表明嗜水气单胞菌感染不仅导致鳙的黏膜免疫系统遭到破坏，也影响其呼吸系统和消化系统功能。

头肾与脾脏是鱼类重要的系统免疫组织，香鱼感染嗜水气单胞菌后，脾脏组织出血，脾脏中出现大量的淋巴细胞、浆细胞，发生炎症反应^[28]。青鲫被嗜水气单胞菌感染，脾脏出现炎症细胞侵染，导致青鲫的造血和免疫功能下降^[8]。嗜水气单胞菌分泌的组织毒素、气胞毒素、溶血素等毒性蛋白，可破坏细胞膜结构，导致细胞出现空泡和凋亡现象，造成组织损伤^[29-30]。团头鲂感染嗜水气单胞菌，头肾组织间隙增宽，结构紊乱，脾脏肿大，脾脏体指数显著高于对照组，脾脏与头肾组织出现大量的炎症细胞^[3]。鳙被嗜水气单胞菌感染5 d，头肾与脾脏组织均出现炎症细胞侵染，且脾脏中出现大量的空泡细胞，表明嗜水气单胞菌感染导致鳙头肾与脾脏组织损伤，结构坏死，鱼体免疫系统被破坏，这可能是鳙患败血症在短期内大量死亡的主要原因之一。