2025, Vol. 32 
2. 湖北黄优源渔业发展有限公司，湖北 武汉 430200
2. Hubei Huang YouYuan Fishery Development Limited Company, Wuhan 430200, China
马口鱼(Opsariichthys bidens)又名桃花鱼，属鲤形目鲤科
目前有关马口鱼的研究主要集中在寄生虫[8-9]、分布与分类[10]、基础生物学[11]、分子生物学[12-13]等方面。对于马口鱼的人工繁殖也有研究报道[14-15]，虽然繁育出了马口鱼苗种，但难以满足规模化生产的需要。当前，尚未明确马口鱼在人工饲养下精卵巢发育进程与规律，基于人工养殖亲本群体的大规模人工繁殖技术体系也未见研究报道。
本研究探讨了华中地区马口鱼卵巢周年发育进程和池塘养殖亲本群体的繁殖时间，在此基础上对繁殖技术进行摸索，分析了池塘水温波动对其卵巢发育和人工催产的影响，并开展了大规模人工繁殖。研究结果可为其他地区马口鱼的养殖提供依据，对马口鱼相关产业发展起到推动作用，并为我国种质资源的开发利用提供重要参考资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验鱼由合作基地(湖北黄优源渔业发展有限公司，武汉江夏)繁殖获得，投喂马口鱼专用配合饲料，养殖面积为2600.0 m2，水深2.0 m的室外池塘中，密度为150.0 kg/667.0 m2。
1.2 卵巢周年发育样品采集选定1口池塘进行卵巢发育规律观察，从2021年11月10日起，每20 d采样1次。该池马口鱼于4月15日及6月5日共进行了2次人工繁殖。在临近产卵及产卵之后每10 d采样1次，于2022年10月26日结束采样。采用撒网随机捕捞的方式进行采样，每次取5尾鱼。
1.3 参数测量使用丁香油对样品鱼进行麻醉，测量体重(body weight, BW)、体长(body length, BL)、性腺重(gonad weight, GW)。用性腺重占体重的百分比表示性腺指数(gonadosomatic index, GSI)。
性腺发育成熟后、繁殖之前在池塘中随机取10尾马口鱼雌鱼，测量体重和体长。每尾取0.1~ 0.3 g卵巢组织，对其中卵粒进行计数，推算绝对繁殖力(F)、相对体重繁殖力(FW)和相对体长繁殖力(FL)。
使用温度记录仪(精度0.1 ℃)每隔4 h在水面下0.7 m处连续记录池塘水温变化，取平均值表示当日水温。
1.4 卵巢组织学观察每次采样时，将卵巢组织用Bouin’s液固定24 h，然后转移至75%乙醇溶液中保存，用于后续组织学切片制作。卵巢组织样品采用常规组织切片、染色和制片方法，并用连接摄像头的显微镜进行照片采集和组织学分析。取每尾鱼卵巢前、中、后段切片各1片，分别记录1个视野内各时相卵母细胞数量，进行后续统计分析。
1.5 人工繁殖技术研究 1.5.1 精卵比例对人工授精效果的影响精卵比例，或称精子密度，指授精时精子与卵子数量比值。试验设8个精子密度梯度：1.0×103、5.0×103、1.0×104、2.5×104、5.0×104、1.0×105、5.0×105和1.0×106，每个梯度设定3次重复，每次重复使用授精卵子200颗。
使用血球计数板分别测定20尾性成熟雄鱼精子浓度(轻压有乳白色精液流出)，测得精子平均密度为(1.76±0.19)×1010个/mL。挑选合格的马口鱼亲本，按照雌鱼LRH-A2 (5 μg/kg)+DOM (3 mg/kg)进行催产药的注射，雄鱼减半。达到效应时间后，选择3尾在精子激活后持续快速运动时间>25 s的雄鱼，收集其精液并混匀，用移液枪吸取定量精液并用Hank’s液稀释至固定浓度后备用。将各比例组精子与卵子置于烧杯中混合均匀，再加入10 mL 0.3% NaCl溶液激活精子，轻摇2 min使其充分受精，之后转入直径10 cm的培养皿中，置于40 cm×30 cm×9 cm的塑料盒中静水孵化。在原肠中期统计各组受精率，出膜后统计各组孵化率。
1.5.2 催产药物对催产效果的影响以300尾成熟待产的雌性马口鱼为实验对象，将其随机分为5组(表1)，每组设3个平行，每个平行20尾雌鱼，将LRH-A2、DOM和HCG以不同组合对实验鱼进行处理，对照组注射0.6% NaCl溶液。根据
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表1 马口鱼人工繁殖催产药物与配伍 Tab. 1 Different agents and matching for artificial reproduction in hooksnout carp, Opsariichthys bidens |
催产率=产卵亲本重量/催产亲鱼总重量×100%；
产卵率=产出总卵重/催产亲鱼总重量×100%；
死亡率=死亡亲本尾数/亲本总尾数×100%。
1.5.3 低渗溶液对人工授精效果的影响本实验设置浓度为0.1%~0.7% (梯度0.1%)的NaCl溶液共7个处理组，及1个对照组，每组设3个平行，每个平行200粒卵子。获得精子和卵子后，以适宜的精卵比例进行授精。授精时先将稀释后的精子加入卵子中混合均匀，然后倒入10 mL各组对应的低渗溶液，轻摇2 min使其充分受精。统计各组的受精率，并在鱼苗出膜后统计孵化率。
1.6 规模化人工繁殖研究 1.6.1 亲鱼挑选在长方形水泥池(9.0 m×3.0 m× 0.6 m)中架设尼龙网箱，网箱长9.0 m、宽1.0 m，水深0.4 m。将亲本转入网箱后进行挑选，选择外观健康、腹部柔软膨大的雌鱼和轻压腹部有乳白色精液流出的雄鱼作为繁殖亲本，并将挑选出的雌雄亲本分开暂养，防止自然产卵。
1.6.2 催产根据
当70%的雌鱼轻压腹部可见卵粒排出，视为达到效应时间，此时将待产雌鱼打捞至铺有干燥毛巾的容器中，再进行挤卵，收集卵粒的容器应保持干燥且洁净。根据
使用有效容积为0.8 m3的孵化桶流水孵化，每桶放入80~100万粒卵，每小时记录1次水温，水体交换速率≥3.0 m3/h。记录受精率、孵化率和孵化时长(受精完成时开始至50%受精卵脱膜所用时长)。
1.7 数据分析运用SPSS (Version 27)软件进行数据统计分析，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)完成各组显著性检验，之后用Duncan’s分析明确组间差异，P<0.05时认为差异有显著性。文中数据均以平均值±标准误($\bar x \pm {\rm{SE}}$)表示。方差分析前确定数据的正态性与方差齐性。利用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)进行相关性分析。
2 结果与分析 2.1 雌雄差异在养殖过程中，对某一池塘雄性马口鱼和雌性马口鱼的生长指标分别进行测量，结果如表2所示，数据显示，在相同养殖条件下，马口鱼的体重和体长均表现出显著的性别差异，同日龄雄鱼各指标显著高于雌鱼(P<0.05), 190日龄雄鱼平均体重已达到雌鱼的167%。
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表2 马口鱼不同阶段雌雄生长差异 Tab. 2 Sexual growth dimorphism in hooksnout carp (Opsariichthys bidens) at different stages n=100; $\bar x \pm {\rm{SE}}$ |
在湖北地区，4月马口鱼雄鱼第二性征逐渐明显，珠星出现，表现在上下颌、鳃盖及臀鳍鳍条部位；色彩鲜艳，体侧浮现出蓝绿色纵向条纹，下颌、鳃盖、背鳍、胸鳍、腹鳍与臀鳍呈橘色(图1)，秋季降温后，第二性征逐渐消失，但体侧隐约可见条状斑块。
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图1 繁殖季节与非繁殖季节马口鱼雌雄二态性a. 繁殖季节雄鱼；b. 繁殖季节雌鱼；c. 非繁殖季节雄鱼；d. 非繁殖季节雌鱼. Fig. 1 Morphological difference of male and female hooksnout carp (Opsariichthys bidens) in reproductive and non-reproductive periodsa. Male in spawning season; b. Female in spawning season; c. Male in non-spawning season; d. Female in non-spawning season. |
如图2所示，湖北地区全年最低水温6.4 ℃，最高水温34.8 ℃，马口鱼雌鱼GSI的周年变化范围为1.16%~11.65%，且有3处波峰，分别出现在4月中旬、5月下旬和8月中旬，表明马口鱼在排卵后卵巢可以再次发育成熟，为分批产卵类型。
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图2 马口鱼卵巢指数变化与周年水温变化关系GSI：性腺指数. 不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 2 Annual changes of female gonadosomatic index (GSI) in hooksnout carp Opsariichthys bidensGSI: gonadosomatic index. Different letters show significant difference of GSI in different sampling periods (P<0.05). |
3月10日水温升高至15.5 ℃，卵巢体积增大，20 d后GSI由2.41%增长至6.73%，变化显著(P< 0.05), 4月13日GSI达到最大值11.65%。4月15日笔者成功对这批马口鱼进行了人工繁殖，产卵后第10 天，马口鱼GSI显著降低，仅为6.29% (P<0.05)。随后卵巢继续发育，GSI快速增长，于5月27日第2次达到波峰(10.49%)，与第1次波峰GSI无显著差异(P<0.05)。笔者在6月5日对这批马口鱼进行了第二次人工繁殖并取得成功。6月12日，二次产卵后的马口鱼GSI降至5.66%，而后在8月15日第3次出现峰值(9.23%)。9月5日，马口鱼的GSI显著降低至4.48% (P<0.05)，是进入繁殖期以来出现的最低值。10月初，水温骤降，马口鱼卵巢进一步缩小，GSI仅为1.65%。从10月至次年2月，马口鱼GSI变化范围为1.16%~ 1.65%，最低值出现在11月中旬，该时期水温逐渐降低，卵巢发育基本停滞，直到3月10日GSI才出现小幅增长。
马口鱼以III期卵巢越冬。11月30日马口鱼卵巢内卵母细胞均处于II时相或III时相，III时相卵母细胞数量比为26%，卵巢呈黄色，肉眼可见细小卵粒(图3，图4)，越冬后，3月10日卵巢内仍只存在第II时相和第III时相的卵母细胞，但III时相卵母细胞数量比增加至47%，卵巢体积略有增大，位于卵巢中线的血管清晰可见(图3~5)。
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图3 马口鱼卵巢不同季节各时相卵母细胞数量比例变化 Fig. 3 Changes of the number percentage of oocytes with different phases in hooksnout carp (Opsariichthys bidens) in different seasons |
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图4 马口鱼卵巢解剖图a. III期卵巢，11月30日；b. III期卵巢，3月10日；c. IV期卵巢，4月13日；d. IV期卵巢，5月27日；e. VI期卵巢，6月12日；f. V期卵巢，8月15日；g. VI期卵巢，9月5日；h. III期卵巢，10月4日. Fig. 4 Ovary morphology of hooksnout carp, Opsariichthys bidensa. Stage III ovary on November 30th; b. Stage III ovary on March 10th; c. Stage IV ovary on April 13th; d. Stage IV ovary on May 27th; e. Stage VI ovary on June 12th; f. Stage V ovary on August 15th; g. Stage VI ovary on September 5th; h. Stage III ovary on October 4th. |
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图5 马口鱼卵巢各发育时期组织学观察a. 3月10日III期卵巢；b. 4月13日IV期卵巢；c. 5月27日IV期卵巢；d. 8月15日V期卵巢；e. 9月5日VI期卵巢；f. 10月4日III期卵巢。Oo2, Oo3, Oo4, Oo5, Oo6分别为II时相、III时相、IV时相、V时相、VI时相卵母细胞. n：细胞核；nu：核仁；yg：卵黄颗粒；ft：滤泡膜；cv：皮质液泡. Fig. 5 Ovarian histology of hooksnout carp (Opsariichthys bidens) in different stagesa. Stage III ovaries on March 10th; b. Stage IV ovaries on April 13th; c. Stage IV ovaries on May 27th; d. Stage V ovaries on August 15th; e. Stage VI ovaries on September 5th; f. Stage III ovaries on October 4th. Oo2: phase II oocytes; Oo3: phase III oocytes; Oo4: phase IV oocytes; Oo5: phase V oocytes; Oo6: phase VI Stageocytes; n: nucleus; nu: nucleolus; yg: yolk granules; ft: follicle theca; cv: cortical vacuole. |
3月底，马口鱼卵巢发育至IV期，卵巢内可观察到IV时相卵母细胞，数量占比为16%，随着水温升高卵巢进一步积累卵黄。4月13日卵巢已充满整个腹腔(图4c)，卵黄颗粒充满整个卵母细胞，并有部分卵母细胞细胞核开始向动物极偏移(图5b)，此时IV时相卵母细胞数量比达到42%, II时相卵母细胞数量比从57%降至31%，可以进行人工催产。产卵后第10天，卵巢内仍存在18%第IV时相卵母细胞，且Ⅱ时相卵母细胞占比大幅增加至59% (图3)。5月27日马口鱼GSI达到第2次波峰时，卵巢形态饱满而有光泽，呈深黄色(图4d), II时相卵母细胞数量比33%，与4月13日基本一致，但IV时相卵母细胞占比不高，为25% (图5c，图3)。6月12日，第2次产卵后的马口鱼卵巢颜色暗淡，紧贴于腹部两侧(图4e)，卵巢内以II时相卵母细胞为主，数量比高达74% (图3)。8月15日卵巢再次充满腹腔，血管清晰(图4f)，卵巢内IV时相卵母细胞数量比已达到35%，同时还存在少量V时相卵母细胞，V时相卵母细胞内卵黄颗粒排列松散，细胞膜与滤泡膜已分离(图5d)，但由于此时湖北地区水温过高，并未进行第3次人工繁殖试验。
9月初，卵巢体积显著缩小，卵巢表面血管萎缩(图4g)，此时湖北地区水温降至30.0 ℃以下，马口鱼卵巢进入退化阶段，卵巢内IV时相卵母细胞仅剩8%，并存在4% VI时相卵母细胞，VI时相卵母细胞的特点是形状不规则，细胞核完全解体消散，滤泡细胞肥大(图3，图5e)。10月初马口鱼卵巢进一步缩小，呈肉红色，卵巢内只存在Ⅱ时相和III时相卵母细胞(图4h，图5f), Ⅲ时相卵母细胞数量比为13%，到11月30日卵巢体积无显著变化，但III时相卵母细胞数量比增长至26% (图3)。
2.3 繁殖力统计如表3所示，1冬龄雌性马口鱼性成熟时，绝对繁殖力为4658.0~8098.0粒，平均值为6165.4粒。相对体重繁殖力为155.5~215.9粒/g，平均值为187.7粒/g。相对体长繁殖力为387.6~613.5粒/cm，平均值为479.8粒/cm。绝对繁殖力与体重(X)显著正相关(r=0.780, P<0.05)，拟合方程为Y= 2330.95e0.029X (R2=0.56)；与卵巢重量(x)呈显著正相关(r=0.783, P<0.05)，拟合方程为Y=e9.29−2.39/x (R2=0.63，图6)。绝对繁殖力与体长和GSI相关性不显著(P>0.05)。
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表3 马口鱼雌鱼繁殖力 Tab. 3 Fecundity of hooksnout carp, Opsariichthys bidens n=10 |
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图6 马口鱼相对繁殖力与体重和卵巢重回归a. 绝对繁殖力与体重的相关性分析；b. 绝对繁殖力与卵巢重的相关性分析. Fig. 6 Relative fecundity of hooksnout carp, Opsariichthys bidensa. Relationship between fecundity and body weight; b. Relationship between fecundity and ovary weight. |
如图7所示，马口鱼受精率随精卵比增加显著提高(P<0.05)，当精卵比达5.0×104及以上后，受精率趋于稳定，当精卵比为1.0×105时受精率达到最高值77.09%。马口鱼孵化率较为稳定，精子密度对其未产生显著影响。由此判断，马口鱼规模化人工繁殖时，最佳精子与卵子数量比应为5.0× 104~1.0×105: 1。
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图7 精卵数量比对马口鱼受精率与孵化率的影响不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 7 The effects of sperm/egg ratio on fertilization rate and hatching rate of hooksnout carp, Opsariichthys bidensDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). |
不同催产方案催产效果如表4所示。各组马口鱼产后死亡率均较低，无显著性差异，除对照组(GP1) 和LRH-A2 处理组(GP2)催产失败，其余3组均成功产卵。但同时使用LRH-A2和DOM (GP3)时，催产率、产卵率、受精率和孵化率均显著低于GP4 和GP5 (P<0.05)。而将HCG取代DOM与LRH-A2配合使用时(GP4)，不仅催产率和产卵率有显著提高，受精率和孵化率也显著增长，且将效应时间缩短了3 h，但在此基础上加入DOM (GP5)，催产效果无明显变化，说明GP4已达到理想的催产效果。
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表4 催产激素配伍对马口鱼繁殖效果的影响 Tab. 4 The effects of of spawning agent matching on spawning results in hooksnout carp Opsariichthys bidens n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
由图8可知，NaCl浓度较低时，随着浓度升高，马口鱼受精率呈上升趋势，并在浓度升高为0.3%时出现显著性差异(P<0.05)。而当NaCl浓度提高至0.5%时，相比于在0.3%浓度条件下，受精率显著降低(P<0.05)，此后继续提高浓度，则导致受精率进一步降低。孵化率在NaCl溶液浓度不超过0.5%时未出现显著差异，继续升高NaCl溶液浓度，则会使孵化率显著降低(P<0.05)。建议使用0.3%~0.4% NaCl溶液作为马口鱼人工繁殖的授精介质。
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图8 低渗溶液浓度对马口鱼受精率和孵化率的影响不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 8 Effects of hypotonic solution on fertilization rate and hatching rate in hooksnout carp Opsariichthys bidensDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). |
如表5所示，2022年共进行9次马口鱼规模化人工繁殖试验，均取得成功。所用亲本为1冬龄初次达到性成熟的马口鱼，其中前6次所用亲本均为首次催产亲本，将这些亲本在池塘继续培育，并分3次完成了第二次人工繁殖试验。试验累计催产雌性马口鱼675.0 kg，产出1150万尾水花，平均受精率66.63%，平均孵化率80.12%。马口鱼受精卵平均规格为650粒/g，卵径为1.03~1.22 mm，平均值1.12 mm。
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表5 马口鱼规模化人工繁殖结果 Tab. 5 Large-scale artificial reproduction in hooksnout carp, Opsariichthys bidens |
马口鱼的效应时间随时间推移逐渐缩短并趋于稳定，5月中旬及以前，马口鱼的效应时间在20.0 h以上，此后缩短至16.0~17.0 h (表6)。在4月28日和5月24日，水温条件相近，但效应时间差距明显，说明水温并不是导致效应时间产生差异的关键因素。而效应积温则呈现出与效应时间一致的变化规律，直至5月下旬，效应积温均处于下降趋势，此后稳定在410.0~430.0 ℃∙h，说明效应积温应是判断效应时间的重要依据。早期效应积温不稳定，可能是由于亲本尚未达到最佳成熟状态，因此所需积温较高，而随着时间推移，水温升高，马口鱼卵巢均能达到理想成熟状态，所以效应积温达到稳定状态。
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表6 马口鱼不同季节人工催产效应时间与孵化时长 Tab. 6 Cumulative temperature of induced spawning and incubation in hooksnout carp, Opsariichthys bidens |
马口鱼受精卵为沉性卵，刚孵出仔鱼全长(6.0±0.2) mm。孵化水温显著影响孵化时长，孵化水温在26.0~29.0 ℃时，42.5~48.0 h便可完成孵化，所需积温为1200.0~1300.0 ℃∙h；当水温降低至22.0~25.5 ℃时，孵化过程需要约70.0 h才完成，且积温超过1600.0 ℃∙h；水温降低至21.0 ℃左右时，历经90 h才完成孵化，孵化积温高达1891.7 ℃∙h。虽然不同水温下孵化历时存在较大差异，但均能成功孵出马口鱼仔鱼，孵化率也未见显著差异，可见马口鱼受精卵孵化适温范围广，而为提高孵化效率，降低孵化风险，宜在水温25.0~29.0 ℃条件下进行孵化。
3 讨论 3.1 马口鱼卵巢周年变化规律性腺发育和成熟是鱼类繁殖的前提和基础，其受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)和环境因素的共同调控，其中季节性温度变化及温度阈值对其影响最为显著，也受到最多关注。本研究发现，在冬季水温下降过程中，马口鱼卵巢GSI及各相卵母细胞数量未出现明显变化，而在2月水温降至8.0 ℃以下时，卵巢GSI无显著增长，但卵巢内III时相卵母细胞数量却显著增加，说明此时马口鱼卵巢开始发育。这一现象在大口黑鲈(Micropterus salmoides)中也有发现，美国中西部地区的大口黑鲈卵巢中Ⅲ时相卵母细胞在水温降至13.9 ℃时才开始出现[16]；水温降至11.0 ℃时，池塘养殖的大口黑鲈卵巢中Ⅲ时相卵母细胞数量比逐渐超越其他时相的卵母细胞所占比例[17]。表明马口鱼和大口黑鲈的性腺需要水温下降至某一阈值才会启动发育，而此过程的机制有待进一步研究。
本研究中，马口鱼卵巢GSI在3、4月显著增加，并且4月GSI增长速度更快，推测是由于3月水温不稳定，升温后又经历了大幅度降温，减缓了卵巢发育速度。在一些研究得到了与此相似的结论，如升温可以显著提高文昌鱼(Branchiostoma belcher)的性腺发育速度[18]，繁殖前期进行低温处理则可以使大口黑鲈卵巢成熟时间推迟[19]。同一时间，安徽青弋江里的雌性马口鱼GSI发生大幅度增长[20]，不同的是，青弋江马口鱼GSI在8月便出现明显下降，本研究中其GSI在8月仍较高并有繁殖的可能。推测该差异的产生与池塘和江河环境的温度水平和温度波动关系密切。
马口鱼的第3次GSI峰值低于第1、2次峰值，且达到第3次波峰所需时间比达到第2次波峰多20 d，可见其卵巢在7、8月发育十分缓慢，此时正处于华中地区夏季高温期，水温长期位于30.0 ℃以上，表明过高的水温对马口鱼卵巢发育与成熟有明显抑制作用。
3.2 马口鱼繁殖力变化规律繁殖是鱼类生活史中的重要环节，是自然条件下唯一的补充种群数量的方式[21]。繁殖力是物种生殖潜力的量化，由遗传物质和环境因素共同决定，表现了鱼类对环境变动的适应性，是种群生存能力和繁殖策略的体现[22-23]。
在不同地区，马口鱼繁殖力有明显差异[24-26] (表7)，并呈现一定规律。辽宁省马口鱼繁殖群体个体最大，绝对繁殖力最高；湖北地区次之；广东的繁殖群体个体最小，绝对繁殖力最低。相对体重繁殖力正与此相反。由此推测该差异与纬度关系密切，鱼类性成熟需要达到一定的积温，低纬度地区水温较高，马口鱼能更快性成熟，同时导致性成熟个体规格较小，反之高纬度地区性成熟个体规格大，该现象与四大家鱼研究中的结论相似[27]。但性成熟时间早常伴随寿命偏短[28]，因此低纬度地区的马口鱼为维持种群延续，便表现出更高的相对体重繁殖力，高纬度地区相对体重繁殖力则偏低。同在湖北地区，本研究所统计马口鱼绝对繁殖力和相对繁殖力均高于三道河水库马口鱼的繁殖力，极有可能是受到两地不同的生活环境影响，相比于水库，本研究中的马口鱼为池塘人工养殖，饵料更充分且营养更全面。而食物供应是否充分对鱼类的性腺发育程度和繁殖力有重要影响[29]。
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表7 不同地域来源马口鱼繁殖力比较 Tab. 7 Comparison on fecundity of hooksnout carp (Opsariichthys bidens) from different sources |
合适的催产方案是繁殖成功的前提，也是充分发挥鱼类繁殖潜力的重要措施，是诸多科研工作开展的基础。此前的报道所用催产方案各不相同[15, 30]，何种方案更适于马口鱼尚不明确。本研究对比的几种催产方案中，最适催产方案与李倩等[15]所用方案一致，催产率可达86.96%，但本研究中马口鱼效应时间更短，可能与亲本发育有关。本研究并未比较垂体对马口鱼的催产效果，主要原因在于垂体成本较高，且使用较为不便，易造成注射器堵塞。
现有关于马口鱼人工繁殖的报道中，在涉及雌雄亲鱼配比时，均以数量比进行匹配，生产效率低，且易造成精子浪费。更合理的方式是按照适宜精卵比例进行授精，避免优质精子浪费的同时提高繁殖效率。马口鱼授精时最佳精子密度略高于黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco) [31]，低于欧洲鳗(Anguilla japonica) [32]。精子密度偏高或偏低都会使杂交黄颡鱼的孵化率下降[33]，但马口鱼的孵化率并未受到精子密度影响。由于马口鱼单个个体精液量较少，规模化生产时雄鱼用量较多，降低马口鱼授精时精子密度需求的方式，以及长时间保存并维持马口鱼精子活力的措施都对马口鱼繁殖具有重要意义，值得进一步研究。
授精介质可以影响精子活力进而影响受精率[34]。低渗溶液浓度在0.0%~0.3%浓度范围内时，马口鱼和黄颡鱼[35]的受精率均随浓度升高而增加，低渗溶液对授精的积极作用或许也适用于其他鱼类。而NaCl浓度超过0.3%后，马口鱼受精率逐渐降低，与在松浦镜鲤(Cynipus carpio)、方正银鲫(Carassius auratus gibelio)、大鳞鲃(Barbus capito) [36]和黄颡鱼[35]的研究中得到的结论一致。高浓度的盐溶液使受精率下降，很可能是因为高盐度会导致精子中的ATP酶活性被抑制，从而使精子活力降低[37]。并且在本研究中观察到高浓度的NaCl溶液可以造成孵化率降低，推测是高浓度的NaCl溶液造成卵子损伤所致。
3.4 池塘培育马口鱼卵巢再次成熟特征本研究通过实验明确了湖北地区池塘养殖马口鱼的繁殖时间在4—7月，受到湖北地区夏季极端气候影响，每年7、8月池塘水温超高，致使人工繁殖工作停滞，若能将养殖水温控制在30 ℃以下，马口鱼的繁殖期或能持续至8月甚至9月，过去的研究也支持此结论[14, 20]，其他地区的马口鱼繁殖时间可以此为参考。通常马口鱼1冬龄达到性成熟，但在研究过程中发现，4月所得马口鱼水花过90 d的池塘培育，有极少数雄鱼已经达到性成熟，出现明显的第二性征，并能挤出乳白色精液。
马口鱼为分批产卵鱼类，单次繁殖量低，产卵率平均仅为4.83%，只有进行1年多次人工繁殖才能充分利用马口鱼的生殖潜力。黄颡鱼的1年2次人工繁殖早已实现[38]，翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)的1年3次人工繁殖也有报道[39]，可见对分批产卵鱼类进行一年多次人工繁殖是可行的。本研究在对性腺发育与成熟规律探索的基础上，首次报道了马口鱼亲本繁殖后再次催产的效果，成功实现同批亲本一年两次繁殖。尤为重要的是，两次催产在受精率与孵化率结果方面无显著差异，有效提高了亲本利用效率。若能减小夏季高温的影响，马口鱼或能实现一年3~4次人工繁殖，这对加快遗传改良和相关科研进程将起到重要推动作用。
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