淡水生态系统为人类社会提供了至关重要的商品和服务，受到气候变化和人类活动的严重影响，生物多样性面临多种威胁^[1]。鱼类是淡水生态系统中的重要组成部分，研究鱼类有助于了解和保护生物多样性^[2]。青藏高原特有的气候条件和地理环境孕育了独特的高原鱼类，这些鱼类对于高原生态系统的健康和稳定起到关键作用。巨须裂腹鱼(Schizothorax macropogon)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)^[3]，主要分布于青藏高原雅鲁藏布江流域，是西藏重要的土著经济鱼类之一，在雅鲁藏布江水生生态系统中具有较多种群数量和较高的生态位，是具有重要影响力的物种^[4-5]。近年来，我国学者对于巨须裂腹鱼的研究主要集中在资源动态^[5]，早期发育特征^[6]、年龄与生长^[7]等方面。关于巨须裂腹鱼肠道微生物群落结构和多样性的研究还相对较少。

水霉病(saprolegniasis)也叫肤霉病或白毛病，是淡水水产养殖中广泛存在的真菌感染^[8-9]，是影响巨须裂腹鱼生存和繁殖的严重问题。腐殖质增生是鱼类发育中的胚胎所遭受的病理的次要表现。水霉菌一般广泛存在于淡水生态系统，以游动孢子形式迅速扩散，对水产动物的种类没有选择性。主要表现为在躯体上形成白色如棉絮状覆盖物，受伤的鱼类和死卵更容易受到感染。水霉病防治难度较大，给淡水鱼养殖业带来巨大的经济损失^[10]。自从特效药物孔雀石绿禁用后，直至目前水霉病的防治仍然是困扰渔业的一大难题。已有的研究表明，水霉菌(Saprolegnia)会感染鱼类的伤口或寄生虫感染处^[11]。在孔庆辉等^[12]的研究中，感染水霉菌的巨须裂腹鱼脾脏组织中有1889个基因发生差异表达，其中1414个基因上调，475个基因下调。这表明水霉病感染可以显著影响巨须裂腹鱼脾脏组织的基因表达模式。水霉病的感染会影响巨须裂腹鱼的正常游泳、食欲、消化系统和排泄系统等，使巨须裂腹鱼的免疫力下降。巨须裂腹鱼是西藏的特有鱼类，本实验在2021年11月以不同健康状况的巨须裂腹鱼为研究对象，通过16S rRNA扩增子测序，首次对巨须裂腹鱼肠道微生物的结构特征及潜在功能开展研究，并分析患病和健康巨须裂腹鱼肠道菌群之间的差异性，为巨须裂腹鱼的保护和水霉病的防治提供参考。

我们对于动物微生物肠道的了解很大程度上是基于对哺乳动物的研究。为了更好地了解动物宿主和本土微生物之间的共生关系的进化基础，有必要研究非哺乳动物和脊椎动物物种的肠道微生物群^[13]。肠道是鱼类消化系统的重要组成部分，参与消化和吸收过程。肠道微生物影响肠道发育并与宿主的免疫系统相互作用，对宿主的健康具有重要意义^[14]。肠道微生物维持着肠道内环境的平衡，对宿主的健康具有重要意义，且在不同的宿主间存在差异，这些差异可能受环境、年龄、生理状况、饮食等因素的影响。鱼类肠道微生物影响着鱼类的疾病预防、代谢健康、免疫系统调节、与环境的交互等功能^[15-17]，同时可能是鱼类分解有机物的主控因素^[18]。肠道微生物的多样性受到食性的影响，巨须裂腹鱼主要摄食水中的底栖无脊椎动物和水生昆虫，兼食硅藻。感染水霉病可能会导致病菌的增殖，从而引起肠炎等消化系统疾病。一些肠道微生物具有抗真菌活性，能够抑制水霉病的生长^[19]。肠道微生物在保持宿主肠道的健康、促进肠道正常发育、提高机体能量吸收和脂肪代谢、抵抗病原入侵等方面具有重要意义^[14]。目前，关于鱼类肠道微生物的信息主要是基于培养研究得出，这些方法只能揭示有限范围内的微生物多样性^[20]。通过比较分析水霉病感染与健康状态下巨须裂腹鱼肠道微生物多样性差异，可以更全面地了解巨须裂腹鱼肠道菌群组成及其在生长发育中的重要作用，对于野生鱼类资源养护与利用有重要指导意义。

本次实验的样本采集工作于2021年11月在西藏自治区农科院雅鲁藏布江曲水水产养殖基地进行。通过在湖中布设捕捞网，成功捕获了15条巨须裂腹鱼。捕获后，将这些鱼样本放入无菌自封袋中，并立即存放在−20 ℃的车载冰箱内，以保持样本的新鲜度。回到实验室后，对这些样本进行了解冻，并从中提取了肠道样本(图1)。通过观察和分类，确定其中10条巨须裂腹鱼处于健康状态，而另外5条则患有水霉病。随后，将这些肠道样本保存在含有95%酒精的容器中，并将其存放在−20 ℃的冰箱中以备后续分析。最后，对这15个样本进行了DNA测序工作。

图1

图1 　巨须裂腹鱼标本与肠道处理图a. 巨须裂腹鱼标本图；b. 患病巨须裂腹鱼肠道；c. 健康巨须裂腹鱼肠道. Fig. 1 　Diagram of Schizothorax macropogon with gut treatmenta. Diagram of an individual S. macropogon; b. Gut of sick S. macropogon; c. Gut of healthy S. macropogon.

提取巨须裂腹鱼肠道细菌和真菌总DNA。使用338F (5ʹ-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3ʹ)和806R (5ʹ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ʹ)作为通用引物对DNA样本中的16S rRNA基因V3~V4区域进行PCR扩增^[18]。采用ITS1F (5ʹ-CTTGGTC-ATTTAGAGGAAGTAA-3ʹ)和ITS2R (5ʹ-GCTGC-GTTCTTCATCGATGC-3ʹ)引物，对真菌ITS1~ ITS2区域PCR扩增^[19]。PCR的反应条件为：使用20 μL PCR反应体系(10×Bufferrv 2 μL; 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；正反引物(5 μmol/L)各0.8 μL; rTaq聚合酶0.2 μL；牛血清白蛋白0.2 μL; 10 ng DNA 模板；将ddH₂O补充至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s，共25个循环。使用Nano Drop 2000测试DNA纯度与浓度，琼脂糖凝胶电泳用于检查PCR成功率。所有样本均送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析。

使用Flash和Trimmomatic软件对测序后得到的双端序列进行拼接、过滤。再采用Usearch软件对所得数据进行聚类分析。为了确定样本分组是否可行，采用ANOSIM相似性和Adonis置换多因素方差分析对样本进行分析。对Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao和Coverage指数进行分析，并通过Welch T检验进行Alpha多样性组间差异检验；运用主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)对巨须裂腹鱼肠道微生物群落相似性进行分析。基于R语言的PSYCH包中的corr. test函数，以属水平的细菌和真菌丰度为基础，生成共现性网络图。利用Gephi软件计算网络的节点、网络直径、平均路径、模块化指数等。本研究的部分数据还借助美吉云平台进行了分析。

支持本研究结果的数据上传至国家微生物科学数据中心(NMDC)，编号为NMDC1001935，链接为https://nmdc.cn/resource/genomics/project/detail/。

巨须裂腹鱼肠道样本经过测序并按最小样本序列数进行抽平共得到401349原始细菌序列和766794条原始真菌序列。肠道细菌共注释到1587个OTUs，共检测到34个门、92个纲、215个目、362个科、662个属和1044个种；两组样本共有的OTU为416个，健康组和患病组样本特有的OTU数量分别为529和230 (图2c)。肠道真菌共注释到1815个OTUs，共检测到11个门、38个纲、102个目、215个科、385个属和560个种；健康组和患病组样本特有的OTU数量分别为714和218 (图2d)。由图2a和2b得，Shannon稀释曲线逐渐趋于平缓，表明细菌和真菌样本测序数量充足，测序结果可靠，可以反映样品中绝大多数的微生物的信息。

图2

图2 　细菌和真菌高通量测序的Shannon稀释性曲线和OTU Venn图 Fig. 2 　Shannon dilatancy curves and OTU Venn plots for high-throughput sequencing of bacteria and fungus

对健康组和患病组巨须裂腹鱼的肠道微生物在OTU水平上进行Alpha多样性指数分析(图3)，每组样本的coverage指数均达0.99以上，表明检测结果可靠。Sobs、Ace、Chao指数可以反映群落丰富度，Shannon指数和Simpson指数可以反映群多样性。分析发现健康组与患病组间肠道微生物的多样性指数存在较大差异。从细菌群落来看(图3a~3e)，健康组与患病组的Ace指数和Sobs指数具有显著差异(P<0.05), Chao指数具有极显著差异(P<0.01)。健康组的Ace指数、Sobs指数、Shannon指数和Chao指数大于患病组样本，表明两个分组的样本的群落丰富度具有显著差异，且健康组的群落丰富度和多样性高于患病组。从真菌群落来看(图3f~3j)，两个分组的样本的Ace指数、Sob指数和Chao指数具有极显著差异(P<0.01), Shannon指数和Simpson指数的组间差异不显著，健康组的多样性指数高于患病组，表明健康组的群落丰富度和多样性大于患病组样本。

图3

图3 　Alpha多样性指数a‒e. 细菌OTU水平的Alpha多样性指数；f‒j. 真菌群落OTU水平的Alpha多样性. ns：差异不显著. Fig. 3 　Alpha diversity indicesa‒e. Alpha diversity indices of bacteria at OTU level; f‒j. Alpha diversity indices at OTU level for fungus. ns: no significant difference.

基于OTU水平对健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道微生物群落结构的相似性进行PCoA分析，对巨须裂腹鱼肠道细菌群落结构进行分析可得，PCoA1轴和PCoA2轴的贡献率分别为51.2%和14.69%，二者积累贡献率为65.89%, PCoA分析(R²=0.2363, P=0.027)显示，健康组和患病组样本的细菌群落之间存在明显的分离，说明健康组和患病组巨须裂腹鱼细菌群落之间有显著的差异(图4a)。对巨须裂腹鱼肠道真菌群落结构进行分析可得，PCoA1轴和PCoA2轴的贡献率分别为39.16%和15.14%，二者积累贡献率为54.3%, PCoA分析(R²=0.2093, P=0.007)，健康组和患病组巨须裂腹鱼真菌群落之间存在明显的分离，说明健康组和患病组巨须裂腹鱼真菌群落之间有显著的差异。

图4

图4 　基于PCoA分析的群落结构相似性 Fig. 4 　Community structural similarity based on PCoA analysis

通过高通量测序对健康组与患病组巨须裂腹鱼肠道细菌群落进行分析，在门水平上，共获得了7个优势细菌门(相对丰度>1%)(图5a)，包括蓝藻门(Cyanobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidta)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)和绿弯菌门(Chloroflexi)。整体上，健康组与患病组的细菌群落结构具有相似性，但在菌群相对丰度上具有差异。健康组的肠道细菌优势菌门为蓝藻门、变形菌门和梭杆菌门；患病组的肠道细菌优势菌门为变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门。通过比较门水平的健康组和患病组巨须裂腹鱼细菌群落相对丰度可得，健康组蓝藻门相对丰度显著高于患病组；且变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门的菌群丰度显著低于患病组。

图5

图5 　患病组与健康组巨须裂腹鱼的肠道细菌群落结构 Fig. 5 　Gut bacterial community structure of Schizothorax macropogon in sick group and healthy group

细菌样本共注释到662个属(图5b)，平均相对丰度在前1%的属共有14个。健康组以norank_o_Chloroplast (58.30%)、Cetobacterium (9.85%)、Dechloromonas (2.61%)为主；患病组以Cetobacterium (17.37%)、o_Chloroplast (12.74%)、Aermonas (13.62%)、Clostridium_sensu_stricto_1 (9.74%)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia (5.82%)。与健康组相比患病组特有属为拟杆菌属(Bacterodies)和蛋白质小链菌属(Proteocatella)等。

根据分类学结果真菌共获得5个优势菌门，包括子囊菌门(Ascomycota)、未分类真菌、担子菌门(Basidionmycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)^[21]、壶菌门(Chytridiomycota)(图5c)。两组样本的真菌群落结构在门水平上具有相似性，但在物种相对丰度上具有差异。比较健康组与患病组巨须裂腹鱼肠道真菌相对丰度发现，健康组的罗兹菌门相对丰度更高，而子囊菌门和担子菌门的相对丰度较低。

真菌样本共注释到385个属(图5d)，平均相对丰度在前1%的属共有20个。健康组巨须裂腹鱼肠道真菌群落结构主要以未注释真菌(28.35%)、小双腔菌属(Didymella)(15.78%)、枝孢菌属(Cladosporium)(4.96%)、Ceratorhiza (3.88%)为主；患病组巨须裂腹鱼肠道真菌群落结构主要以Cutaneotrichosporon (16.27%)、未分类真菌(15.00%)、Boeremia (8.57%)、小双腔菌属 (Didymella)(7.58%)和小毛盘菌属(Cistella)(4.20%)为主。患病组巨须裂腹鱼肠道真菌中的小毛盘菌属、Saitozyma、假丝酵母属(Candida)的相对丰度高于健康组；健康组的特有属有Ceratorhiza；患病组的特有属为Boeremia和Tausonia。

通过LEfSe分析，比较健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道中差异显著的细菌群落，本研究中检测到的大量OTU的计算复杂性，因此仅从门到属的水平进行统计。LDA判别柱形图统计多组中有显著作用的微生物类群，通过LDA分析获得的LDA分值，LDA分值越大，代表物种丰度对差异效果影响越大。由图6可得，健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道细菌群落的显著差异物种小于50个，且健康组和患病组的标志物种分别有31个和7个。其中，健康组肠道细菌群落中的蓝藻门、蓝藻纲(Cyanophyceae)、Chloroplast目等的相对丰度显著高于患病组；患病组巨须裂腹鱼肠道细菌群落的Gammaproteobacteria纲、变形菌门、拟杆菌目(Bacteroidales)等的相对丰度显著高于健康组。

图6

图6 　健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道细菌的LEfSe分析圆表示从门到属的系统发育水平；圆的直径与相应分类单元的丰度成正比；黄色圆表示在各组中丰度差异不显著的细菌类群. Fig. 6 　LEfSe analyses of intestinal bacteria in healthy group and sick group of Schizothorax macropogonCircles indicate phylogenetic levels from phylum to genus, with their diameters proportional to corresponding taxa abundance, and the yellow circles represent bacterial taxa whose abundance did not differ significantly among the groups.

通过LEfSe分析，比较健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道中差异显著的真菌群落，本研究中检测到的大量OTU的计算复杂性，因此仅从门到属的水平进行统计。LDA判别柱形图统计多组中有显著作用的微生物类群，通过LDA分析获得的LDA分值，LDA分值越大，代表物种丰度对差异效果影响越大。由图7可得，健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道真菌群落的显著差异物种小于50个，且健康组和患病组的标志物种分别有35个和10个。其中健康组巨须裂腹鱼肠道真菌的小双腔菌属、芽枝菇科(Bulleribasidiaceae)、Vishniacozyma属等的相对丰度显著高于患病组；患病组巨须裂腹鱼肠道真菌的Barnettozyma属、散囊菌门(Eurotiomycetes)、青霉属(Apiotrichum)等的相对丰度显著高于健康组。

图7

图7 　健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道真菌的LEfSe分析圆表示从门到属的系统发育水平；圆的直径与相应分类单元的丰度成正比；黄色圆表示在各组中丰度差异不显著的真菌类群. Fig.7 　LEfSe analyses of gut fungi in healthy group and sick group of Schizothorax macropogonCircles indicate phylogenetic levels from phylum to genus, with their diameters proportional to corresponding taxa abundance, and the yellow circles represent fungal taxa whose abundance did not differ significantly among the groups.

对门水平的巨须裂腹鱼肠道微生物进行共现性网络互作分析，结果表明肠道真菌(94.32%)的正相关边比例高于肠道细菌(72.82%)，表明肠道真菌之间存在更多的协同作用或相互依赖关系，比肠道细菌具有更高的稳定性。在肠道细菌共现性网络中(图8a、表1)，由98个节点和1619条边组成，模块化指数为0.17，表明肠道细菌网络具有一定的模块化结构，划分出许多小的社区，网络结构具有一定的复杂性和连通性。从整个肠道细菌网络组成来看，肠道细菌以变形菌门(41.84%)、蓝藻门(21.43%)、放线菌门(10.20%)、厚壁菌门(9.18%)、拟杆菌门(6.12%)等为主。在肠道真菌共现性网络中(图8、表1)，由94个节点1003条边组成，模块化指数为0.23，表明肠道真菌网络具有一定的模块化结构，划分出许多小的社区，网络结构具有一定的复杂性和连通性。从整个肠道真菌网络组成来看，肠道真菌主要以未分类真菌门(unclassified_unclassified_Fungi) (31.91%)、子囊菌门(26.6%)、担子菌门(24.47%)、罗兹菌门(14.89%)和壶菌门(2.13%)为主。

图8

图8 　门水平的巨须裂腹鱼肠道微生物共现性网络分析 Fig. 8 　Gut microbial co-occurrence network analysis of Schizothorax macrobarbatus at phylum level

表1

表1 　共现网络的拓扑结构特征 Tab. 1 　Features of the topology of the co-occurrence network 网络拓扑指标 network topology metrics 细菌 bacteria 真菌 fungus 节点数 number of nodes 98.00 94.00 边数 number of edges 1619.00 1003.00 平均度 average degree 33.04 21.34 平均加权度 average weighted degree 33.04 21.34 网络直径 network diameter 6.00 6.00 图密度 graph density 0.34 0.23 模块化指数 modularity index 0.17 0.23 连接部件 connected components 2.00 2.00 平均聚类系数 average clustering coefficient 0.73 0.63 平均路径长度 average path length 2.11 2.32 正相关比例 positive correlation ratio 72.82% 94.32% 负相关比例 negative correlation ratio 27.18% 5.68%

表1 　共现网络的拓扑结构特征 Tab. 1 　Features of the topology of the co-occurrence network

使用Bugbase基于16S rRNA基因序列OTU对巨须裂腹鱼肠道微生物的需氧情况、可移动元件、兼性厌氧、生物膜形成、革兰氏阴性/阳性和耐受性等8种表型的生物水平覆盖情况进行了预测(表2)。结果显示，多样性较高的患病组巨须裂腹鱼肠道的厌氧菌多于好氧菌，健康组巨须裂腹鱼肠道内的厌氧菌和好氧菌比较均衡。厌氧微生物常表现出与宿主的共生关系，贴壁生长；好氧微生物由于其需氧性常远离肠道壁生存。在预测革兰氏菌的微生物水平覆盖率中，革兰氏阴性菌的比例远高于革兰氏阳性菌，革兰氏阳性菌可以产生外毒素，这些毒素在细菌死亡时释放，可能导致疾病；革兰氏阴性菌可以产生内毒素，这些毒素是细胞壁的一部分，在细菌死亡或细胞壁受损时会释放，引起强烈的免疫反应。对肠道细菌群落的耐受性分析发现，健康组肠道细菌群落具有更高比例的耐受菌群，更能适应环境的变化，更具有稳定性。

表2

表2 　巨须裂腹鱼肠道微生物预测表型的相对丰度 Tab. 2 　The relative abundance of predicted phenotypes of intestinal microbes in Schizothorax macrobarbatus % 表型 phenotype 健康组 healthy group 患病组 sick group 需氧情况 aerobic 3.53 3.06 可移动元件 contains mobile elements 4.52 12.90 兼性厌氧性 facultatively anaerobic 3.99 6.51 生物膜形成 forms biofilms 6.28 7.25 革兰氏阴性 Gram-negative 33.57 30.35 革兰氏阳性 Gram-positive 5.86 15.69 耐受性 stress tolerance 36.02 22.66

表2 　巨须裂腹鱼肠道微生物预测表型的相对丰度 Tab. 2 　The relative abundance of predicted phenotypes of intestinal microbes in Schizothorax macrobarbatus %

使用FAPROTAX基于16S rRNA基因对巨须裂腹鱼肠道细菌群落进行功能组差异检验(图9)，对硫化合物的暗反应、硫氧化、无氧光自养等65种生态功能进行分析，挑选占比较高的9种功能绘制功能预测组间差异。整体上，健康组巨须裂腹鱼肠道细菌功能菌群与患病组之间具有显著差异(P<0.05)，且健康组的相对丰度高于患病组。健康组中硫化合物的暗反应和硫氧化的占比最高，肠道中的硫酸盐还原菌，如脱硫弧菌(Desulfovibrio)，能够通过代谢途径产生硫化氢，有助于保护肠道黏膜，并且可以促进某些物质的代谢；本研究中在超过38.46%的样本中检测到该菌属，但其相对丰度较小，这一结果与功能预测结果基本吻合，说明样本中存在较高比例的硫化合物暗反应和硫氧化菌群。

图9

图9 　巨须裂腹鱼肠道细菌群落的组间功能预测差异分析 Fig. 9 　Analysis of predicted differences in the component function of the gut bacterial of Schizothorax macrobarbatus

高原鱼类在生物多样性和生态系统中占有重要地位。Kumarasan等^[21]的研究讨论了鱼类肠道微生物群落结构组成，影响鱼类肠道微生物组成的因素以及鱼类肠道微生物的免疫作用，对于逐步完善鱼类肠道微生物的研究具有重要意义，有利于促进渔业产业化健康发展。肠道微生物的比较分析在疾病防控^[22-23]、环境适应以及摄食管理^[24]方面具有重要意义。当外界环境发生变化，宿主会通过调节自身肠道微生物组成来适应外界食物资源变化带来的挑战^[25]。本研究以西藏特有种不同健康状况的巨须裂腹鱼为研究对象，收集其肠道样本，利用高通量测序技术获得两组样本肠道菌群组成和功能差异，发现健康组巨须裂腹鱼的Shannon指数和Chao指数显著高于患病组巨须裂腹鱼。高菌群多样性是维持免疫系统稳定的关键原因之一^[26]，表明巨须裂腹鱼患水霉病后，肠道微生物群落较健康组样本更简单，抵抗外界干扰能力，适应能力和恢复自身平衡的能力均低于健康组巨须裂腹鱼。

本研究发现健康组巨须裂腹鱼肠道微生物群落的细菌门主要是蓝藻门、变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等，这与前人的研究结果相一致^[27-29]。其中蓝藻门是两组巨须裂腹鱼中的绝对优势菌门，是一类能够通过产氧光合作用获取能量的细菌，部分也可通过异营来获取能量。这表明蓝藻门在巨须裂腹鱼肠道能量获取和转换方面扮演着重要角色，对宿主的健康和能量平衡具有重要影响^[30]。巨须裂腹鱼是杂食性鱼类，其肠道中的厚壁菌门能够帮助宿主消化分解植物纤维大分子物质^[31-32]，促进对相关营养物质的吸收，在多种免疫因子调节和肠道保护方面起到重要作用。在前人的研究中，厚壁菌门是大多数鱼类肠道中的重要微生物类群^[33]。在本研究中患病组巨须裂腹鱼肠道中的厚壁菌门的相对丰度高于健康组，在Ye等^[34]的研究中，巨须裂腹鱼肠道中前肠与后肠的厚壁菌门相对丰度存在差异，这可能反映了肠道不同区域的微生物组成随消化过程而变化。这些研究结果共同强调了厚壁菌门在鱼类肠道健康和功能中的重要性，并揭示了其在疾病状态下可能发挥的不同作用。患病组巨须裂腹鱼的变形菌门相对丰度远高于健康组巨须裂腹鱼，这反映了患水霉病后肠道微生物群落结构更加不稳定。在其他鱼类疾病的研究中，变形菌门的增加与病原体的入侵和肠道微生物群落的失衡有关，在Yang等^[35]的研究中，感染了特定病原体的鱼类变形菌门相对丰度增加，这可能与病原体的繁殖和宿主免疫反应的激活有关。

在属水平上，拟杆菌属和变形杆菌属是患病组巨须裂腹鱼的特有属。巨须裂腹鱼与其他鱼类相比，显示出一些特有种和相对丰度差异明显的菌群，如昆明裂腹鱼与鳜鱼共有的优势菌群包括乳酸杆菌属(Limnobacter)和假单胞杆菌属(Pseudomonas)，而滇池高背鲫中红杆菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)^[19]。拟杆菌属与动物宿主肠道健康和疾病状态密切相关，在宿主的营养代谢和免疫系统中扮演着重要角色^[36]。在孙豪等^[37]的研究中，拟杆菌属是斑点叉尾鮰肠道的优势菌群。这与我们的研究结果存在差异。这种差异可能源于不同鱼类宿主的生理特性和环境适应性，以及他们所处的不同环境条件。变形杆菌属广泛分布于自然界，在土壤、污水和垃圾中可检测出，也可寄生于人和动物的肠道^[38]。在肠道微生物群落中，变形杆菌属丰富较高可能指示肠道菌群失衡的一个标志^[39]。有研究表明，变形杆菌属与宿主体内的验证具有相关性，特别是在肠道损伤中^[40]，这与我们的研究结果相呼应，也进一步强调其在动物肠道微生物群落中的重要性。

真菌种类繁多，在生态系统中占有重要地位，对营养和能量循环的干预程度相对较大，能够通过循环有机物将营养物质输送到不同的营养级^[41]。鱼类肠道真菌的研究是一个较新的领域，对于理解鱼类的健康、疾病防治具有重要意义。本研究发现子囊菌门和担子菌门是巨须裂腹鱼肠道中的绝对优势真菌门，这与Zhou等^[42]的研究具有相似性，在他们的研究中子囊菌门和担子菌门是罗非鱼和鳙鱼肠道的优势菌门。进一步的，我们发现患病组的巨须裂腹鱼子囊菌门的相对丰度高于健康组，这与子囊菌门在鱼类健康和营养代谢中的重要作用相符合^[43]，子囊菌门能够分解一些细菌难以分解的复杂有机物，以及参与调节鱼类肠道的免疫反应^[44]。在先前的研究中子囊菌门和担子菌门是藏猪仔粪便^[45]、土壤真菌群落^[46]中的优势菌门，这一发现与我们的研究结果相呼应，进一步强调了这两个真菌门在不同宿主和不同生态系统之间的普遍性和重要性。

假丝酵母属是真菌感染最常见的病原体之一，在患病组的肠道中的相对丰度更高，这可能与肠道微生物的失衡有关。健康组的特有属有Ceratorhiza，通常与兰科植物形成菌根^[47]，可能具有抗病原体的特性，可以用于生物防治，控制植物病原菌^[48]。患病组的特有属为Boeremia和Tausonia。Boeremia和Tausonia主要在植物中被检测出，是重要的植物病原真菌，能够引起多种植物病害^[49]。在巨须裂腹鱼肠道中检测出，可能与其摄食种类存在关系，在自然环境下，草叶、树叶等含有较高含量的真菌，为鱼类肠道贡献了部分外源性真菌^[50]。

健康的肠道微生物群落可以通过产生抗菌物质、竞争营养和附着位点来抑制病原微生物的生长^[51]。肠道微生物产生的代谢产物，如短链脂肪酸，会影响生物体的代谢和炎症状态，这些代谢产物可以通过影响宿主的代谢途径来调节宿主对水霉病的易感性。本研究中采用高通量测序技术对巨须裂腹鱼肠道微生物群落进行分析，但尚未对水霉病相关的特定菌群进行筛选和分离。未来的研究中考虑增加代谢组测序技术，对水霉病的相关菌群进行更精确的分类和筛选，进一步探讨肠道微生物对水霉病的调控作用。

本研究基于16S rRNA高通量测序对高原巨须裂腹鱼健康组和患病组的肠道微生物多样性特征进行分析，揭示了健康组与患病组肠道微生物的差异与共同点，有助于我们更全面地了解自然状态下生长的巨须裂腹鱼肠道内的微生态环境状况，以及更好地理解生物如何适应极端环境，对丰富高原硬骨鱼类核心菌群的研究提供数据支撑，对于保护生物多样性和生态环境具有重要意义。然而，本研究开展于青藏高原地区，采样难度较大，随机性强、样本数量少等限制性因素也导致分析结果有一定的局限性，但对于野生鱼类肠道样品的采集这种状况还难以避免。

本研究提取了患水霉病和健康状态的巨须裂腹鱼的肠道内容物并通过高通量测序分析，结果表明，健康组巨须裂腹鱼的肠道微生物群落丰富度和多样性高于患病组，且肠道微生物群落之间具有显著差异(P<0.05)；健康组与患病组巨须裂腹鱼肠道微生物在群落组成上具有相似性，但相对丰度具有明显差异；LDA判别图显示了健康组和患病组巨须裂腹鱼肠道之间存在38个细菌标志物种和45个真菌标志物种。根据功能预测分析，健康组巨须裂腹鱼肠道细菌功能菌群与患病组之间具有显著差异(P<0.05)，且相对丰度高于患病组。本研究揭示了健康组与患病组巨须裂腹鱼肠道微生物的差异与共同点，为理解鱼类与其肠道微生物之间的相互作用提供了新的见解。本研究有助于更全面地了解自然状态下生长的巨须裂腹鱼肠道内的微生态环境状况，以及更好地理解生物如何适应极端环境，对丰富高原硬骨鱼类核心菌群的研究提供数据支撑，也为西藏地区特有鱼类肠道菌群的保护和管理提供了重要的理论依据，对于保护生物多样性和生态环境具有重要意义。未来的研究可以在此基础上，进一步探讨肠道微生物与巨须裂腹鱼健康之间的具体作用机制，以及如何通过调节肠道微生物来促进鱼类的健康和疾病防治。