2025, Vol. 32 
2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东 广州 510380
2. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fishery Resource Application and Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou, Guangzhou 510380, China
草鱼属鲤科(Cyprinidae)、雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon)，全国各地均有养殖，其年产量常居淡水养殖鱼类首位[1]。由于草鱼4~5龄性腺发育成熟，一定程度上限制了其种质资源开发与利用的进度和效率[2]。针对20月龄以上草鱼生长存在性别二态性，雌性生长速度优于雄性[3]，深入解析草鱼性别基因在性腺发育过程中的调控作用对开展单性育种工作以缩短养殖周期具有重要意义。性别相关基因在硬骨鱼类性别决定、性腺分化和发育过程中发挥关键作用，如dmrt1、amh、foxl2、cyp19a、sox3、sox9等性别决定基因，对这类基因功能的研究有利于开展鱼类单性育种等工作[4]。其中，dmrt1和amh基因突变的雄性斑马鱼(Danio rerio)可发生性逆转成为伪雌鱼[5], foxl2基因的转录水平在史氏鲟(Acipenser schrenck)性腺组织中具有性别二态性并在性别分化过程中发挥重要作用[6]，然而目前围绕草鱼性别关键基因挖掘及相关功能研究相对较少。本研究旨在探究性别决定基因在草鱼性腺发育过程中的表达模式及其与各性别基因间的调控作用，为开展草鱼单性育种技术研究提供支撑。
芳香化酶(Cytochrome P450 Aromatase, CYP19)是细胞色素P450 (Cytochrome P450)家族的成员之一，是催化雄激素转变为雌激素的关键限速酶[7-8]。绝大部分哺乳动物中，P450芳香化酶都是由单一的cyp19基因编码而成，而硬骨鱼cyp19基因至少存在cyp19a和cyp19b两种亚型，分别编码不同形式的芳香化酶异构体——性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB)[9]。其中，cyp19a作为内源性雌激素合成的关键基因，该基因所编码的芳香化酶广泛参与调控鱼类卵巢的分化和发育。张东云等[10]通过分别投喂30 mg/kg的17β-雌二醇和20 mg/kg的17β-雌二醇混合10 mg/kg曲洛斯坦所获得的大口黑鲈(Micropterus salmoides)伪雌鱼性腺组织中cyp19a1a基因表达水平相较雄鱼显著上调。Zhang等[11]研究发现XX型尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)缺失cyp19a1a基因可导致鱼体雌激素水平下降，性腺生殖细胞数量减少并发育为精巢。舒畅等[12]制备了牙鲆(Paralichthys olivaceus) Cyp19a多克隆抗体并发现牙鲆性腺cyp19a基因的蛋白水平与转录水平一致，具有性别二态性，利用Foxl2和Dmrt1重组蛋白处理牙鲆性腺分化期幼鱼可分别显著上调和下调cyp19a的转录水平，表明Foxl2和Dmrt1蛋白可通过调控cyp19a的表达参与调控性腺的分化与发育。随着分子生物学技术的发展，鱼类cyp19a基因在性腺发育过程中与各性别基因间的调控作用愈发明确，如斑马鱼[13]、尼罗罗非鱼[14]和大黄鱼(Larimichthys crocea)[15]等。目前，祁博等[16]在草鱼不同月龄中cyp19a1a的转录水平发现，在雌性草鱼3、6、48月龄时cyp19a1a的转录水平均有不同程度的显著上升，表明cyp19a1a对草鱼卵巢的分化和发育具有重要作用，但其在草鱼性腺发育过程中的表达模式及其与各性别基因的调控作用尚未清晰。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是真核生物体内的一种天然免疫，是基于小 RNA (small RNA, sRNA)的基因表达调控方式。RNAi现象在生物界普遍存在，可以在转录水平、转录后水平、翻译水平上对靶基因的表达实现特异性阻断和抑制，是一种高效、稳定的抑制基因表达的技术手段，随着基于RNAi原理的基因沉默技术逐渐成熟，成为研究基因功能的有力工具[17-18]。在刺参(Apostichopus japonicus)[19]、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)[20]和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[21]等甲壳动物中均能通过注射或投喂dsRNA进行特异性抑制目的基因的表达。Song等[22]通过对鲤(Cyprinus carpio) igf3基因长时间的dsRNA干扰中发现，igf3基因沉默后能够显著影响促性腺激素和性固醇类激素的分泌，从而抑制性腺的发育。
本研究拟通过RACE技术克隆cyp19a基因的全长cDNA序列，通过qRT-PCR技术探究cyp19a基因在草鱼性腺发育不同时期和成鱼各组织中的表达模式，注射dsRNA干扰后性别相关基因的表达和血清激素水平的测定，探讨cyp19a基因在草鱼性腺发育和靶基因沉默后的调控作用，为进一步探索cyp19a基因在草鱼性腺发育过程中对各性别基因间的调控作用奠定基础，为开展草鱼单性遗传育种研究提供支撑。
1 材料与方法 1.1 实验用鱼实验用鱼分别为3、12、24、36和48月龄草鱼，由中国水产科学研究院珠江水产研究所三水基地提供。根据年龄分别放入5个池塘网箱(2 m× 1 m×1.2 m)中暂养一周，暂养期间不间断充气增氧，每天投喂两次饲料，饲料购于广东省佛山市联大农牧科技有限公司。
1.2 组织样品采集根据刘筠等[23]草鱼性腺分期标准以及祁博等[16]对草鱼不同月龄性腺组织学观察结果，12、24、36和48月龄草鱼精巢和卵巢分别处于发育I、II、III、IV期。选取48月龄草鱼成鱼雌雄各5尾，禁食24 h后，浸泡在含有100 mg/L的MS-222 (Sigma，美国)中麻醉，分别采集脑、眼、鳃、心脏、脾脏、头肾、肝脏、中肠、肌肉、精巢和卵巢组织。取12、24、36和48月龄草鱼雌雄各5尾，禁食24 h，麻醉后，采集性腺组织。取样后迅速置于液氮中速冻后‒80 ℃冰箱保存，用于后续RNA的提取。所用草鱼均剪取尾鳍保存于无水乙醇中，后续使用Wang等[24]开发的草鱼雌雄特异性分子标记鉴定性别。
1.3 总RNA提取和cDNA的合成采用Tissue RNA Kit (OMEGA)试剂盒(广州威佳生物科技有限公司，广州)提取草鱼各组织总RNA，用1%琼脂糖凝胶和CytationTM ENO HTS多功能酶标仪(Biotek Cytation 5，美国)检测总RNA纯度和浓度，样品OD260/OD280在1.8~2.1之间，依照SMARTTM RACE cDNA Amplification扩增试剂盒(TaKaRa，日本)说明书，合成5ʹRACE和3ʹRACE cDNA。分别提取草鱼成鱼各组织、性腺发育各时期、对照组和dsRNA处理组性腺组织RNA, ‒80 ℃保存备用。利用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)合成并稀释cDNA第一链，样品cDNA浓度为200 ng/μL左右，‒20 ℃保存备用。
1.4 草鱼cyp19a cDNA的全长克隆和序列分析根据转录组数据和已知鲤科鱼类的保守序列，利用Primer 5软件设计特异性扩增引物cyp19a-F和cyp19a-R (表1)，以性腺cDNA第一链为模板进行基因保守序列片段的扩增。20 μL扩增体系为：DEPC水6 μL, Premix Taq™ 10 μL，上下游引物各1 μL, cDNA 2 μL；反应程序为：94 ℃ 3 min, 35个循环(94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min), 72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生物工程(上海)股份有限公司测序。通过测序结果设计cyp19a基因5ʹrace和3ʹrace巢式引物(表1)。利用Smarter Race5ʹ/3ʹ Kit Components (TaKaRa，日本)试剂盒进行5ʹ末端和3ʹ末端序列扩增，PCR产物纯化连入PBM 23 Vector中，再转化到DH5α感受态细胞中，37 ℃过夜后进行菌落PCR，筛选出阳性单克隆进行测序，通过软件Vector NTI分别将cyp19a的5ʹ端、3ʹ端及其中间核心序列拼接，从而获得草鱼完整的cyp19a cDNA序列。
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表1 本研究所用引物 Tab. 1 Primers used in this study |
使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测ORF位置和氨基酸序列，ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质，WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)进行亚细胞定位预测，SignalP-4.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)和TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分别进行蛋白质信号肽和跨膜结构域预测，SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分别预测蛋白质的二级结构和三级结构，SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)工具分别分析氨基酸序列的保守结构域及其功能域位点，DNAMAN软件进行氨基酸多重序列比对分析，MEGA 7.0软件构建基于邻位相接法(NJ法)的系统进化树。
1.5 cyp19a-dsRNA的合成根据克隆得到的草鱼cyp19a cDNA序列，使用在线软件BLOCK-iT™ RNAi Designer (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)获得草鱼cyp19a基因沉默靶点所在的序列片段，利用Primer 5软件在包含cyp19a基因沉默靶点的序列片段设计用于制备cyp19a-dsRNA的引物，并在上下游引物5′端添加T7启动子序列(表1)。以性腺cDNA第一链为模板，进行cyp19a-dsRNA模板的扩增。50 μL扩增体系为：DEPC水15 μL, Premix 25 μL，上下游引物各2.5 μL, cDNA 5 μL；反应程序为：98 ℃ 30 s, 35个循环(98 ℃ 10 s, 63 ℃ 30 s, 72 ℃ 9 s), 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物目的片段大小。PCR产物经Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒(Promega，美国)纯化后，根据TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit试剂盒(Thermo Scientific，美国)合成并纯化cyp19a-dsRNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的dsRNA，酶标仪检测dsRNA浓度，‒80 ℃冰箱保存备用。
1.6 cyp19a-dsRNA干扰实验样品采集选取300尾3月龄体重为(9.97±0.96) g 健康草鱼放入池塘网箱(1.8 m×0.9 m×1.2 m)暂养一周，暂养期间不间断充气增氧，每天投喂两次饲料。为筛选注射所需cyp19a-dsRNA最适浓度，设置实验组和对照组，实验组分3组，采用腹腔注射依次注射浓度为1, 5, 10 μg/g的cyp19a-dsRNA，对照组注射等量生理盐水，每组注射草鱼30尾，注射后的实验鱼分组放入4个规格为0.8 m× 0.6 m×0.6 m的网箱中，24 h后，每组随机挑选草鱼20尾，麻醉后，采集性腺组织用于组织表达，分析不同浓度cyp19a-dsRNA对雌鱼卵巢组织cyp19a表达量变化及其靶基因的沉默效率，筛选最适浓度。后续实验组注射最适浓度的cyp19a-dsRNA，对照组注射等量的生理盐水，每组注射草鱼80尾，注射后的实验鱼分组放入2个规格为0.8 m×0.6 m×0.6 m的网箱中。在实验的1 d, 2 d, 3 d, 4 d和5 d，每组随机选取草鱼10尾，麻醉后，采集性腺和血液组织。性腺组织于RNA保存液(聚合美生物科技有限公司，北京)中暂存，后转移至‒80 ℃冰箱保存，用于基因组织表达。血液组织室温下静置4~6 h 后，4 ℃环境下，4000 r/min离心20 min，收集上层血清于‒80 ℃冰箱保存，用于检测雌二醇(E2)和睾酮(T)的含量。所用草鱼均剪取尾鳍保存于无水乙醇中，用于性别鉴定。
1.7 实时荧光总量PCR (qRT-PCR)根据克隆得到的草鱼cyp19a cDNA序列，设计用于实时荧光定量PCR的引物(表1)。以草鱼成鱼各组织、不同发育时期性腺组织以及dsRNA注射实验性腺组织cDNA为模板，β-actin作为内参基因[25]，每个样品设置3个重复。使用赛默飞荧光定量仪(QuantStudioTM 6 Flex，美国)进行qRT-PCR检测。20 μL反应体系为：DEPC水6 μL, Premix 10 μL，上下游引物各1 μL, cDNA 2 μL；反应程序为：50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min, (95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个循环), 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。
1.8 血清激素的测定使用鱼雌二醇(E2)及睾酮(T) ELISA试剂盒(上海优选生物科技有限公司，上海)测定cyp19a-dsRNA干扰实验雌、雄草鱼血清中E2及T含量。在酶标仪450 nm波长下测定其吸光值(OD)，通过标准曲线计算各样品中的类固醇激素含量。
1.9 数据分析基因相对表达量以${2^{ - \Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}}$计算，各实验数据用平均值±标准误($\bar x \pm {\rm{SE}}$)表示，用SPSS 22.0软件进行统计分析，在One-way ANOVA进行方差分析的基础上采用Duncan’s多重比较检验组间差异，实验以P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 cyp19a基因全长cDNA序列分析克隆得到草鱼cyp19a cDNA全长为2219 bp (GenBank登录号：PQ 476203)，其中5′UTR为48 bp, 3′UTR为617 bp, ORF为1554 bp，共编码517个氨基酸，包含20种标准氨基酸，其中亮氨酸最多(14.7%)，丝氨酸(7.0%)次之，色氨酸(1.0%)最少。通过在线软件EXPASY预测CYP19a蛋白分子式为C2610H4181N713O741S25，半衰期为30 h，等电点pI为8.48，不稳定系数为43.08，总体平均亲水系数为0.014。通过在线软件WoLF PSORT亚细胞定位发现该蛋白在细胞质膜的概率为22%，在内质网的概率为10%。使用SignalP-4.1在线软件分析蛋白信号肽发现该蛋白无信号肽。利用TMHMM-2.0预测跨膜螺旋数量显示该蛋白无跨膜螺旋。使用SWISS-MODEL在线软件对草鱼cyp19a基因编码蛋白质三级结构的预测结果，发现该蛋白质二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成(图1)。通过SOPMA在线软件对草鱼CYP19a蛋白二级结构分显示α-螺旋、延伸链和无规卷曲所占的比例分别为47.58%、9.86%和42.55%。使用SMART和InterPro在线软件对蛋白质保守结构域分析发现，草鱼cyp19a编码的氨基酸序列在70~500之间，是P450蛋白保守结构域，有4个低复杂度区位于氨基酸序列第46~55位、第68~80位、第185~200位和第330~341位，在449~458位氨基酸之间存在亚铁血红素结合区(图2和图3)。
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图1 草鱼CYP19a蛋白三级结构 Fig. 1 The tertiary structure of CYP19a protein of Ctenopharyngodon idellus |
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图2 草鱼cyp19a基因CDS区及其编码的氨基酸序列红色的ATG为起始密码子. 黄色下划线表示保守结构域，亚铁血红素结合区以灰色背景显示. Fig. 2 CDS region of cyp19a gene of Ctenopharyngodon idellus and its encoded amino acid sequenceThe red ATG indicates the start codon. The conserved domain is underlined in yellow, and the heme-binding region is shown with a grey background. |
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图3 不同脊椎动物cyp19a编码氨基酸同源性分析包含草鱼PQ 476203，翘嘴鲌KAK9958479.1，团头鲂XP_048025102.1，银鲫XP_052438418.1，斑马鱼AAG12243.1，鲤ACB13197.1，遮目鱼XP_030648858.1，人NP_000094.2，小鼠 NP_001335100.1，热带爪蟾BAE93232.1. 深色阴影区域表示具有相同氨基酸位点的物种的例子，浅色阴影区域表示所列物种中有一半以上具有相同的氨基酸位点. 红色文本框表示亚铁血红素结合区域. Fig. 3 Homology of cyp19a encoding amino acid sequence in different vertebratesIncluding Ctenopharyngodon idellus PQ 476203, Culter alburnus KAK9958479.1, Megalobrama amblycephala XP_048025102.1, Carassius gibelio XP_052438418.1, Danio rerio AAG12243.1, Cyprinus carpio ACB13197.1, Chanos chanos XP_030648858.1, Homo sapiens NP_000094.2, Mus musculus NP_001335100.1, and Xenopus tropicalis BAE93232.1. Dark shaded areas indicate examples of species with the same amino acid sites; light shaded areas indicate that more than half of the listed species have the same amino acid sites. The red textbox indicates heme-binding region. |
使用Mega7.0软件将草鱼cyp19a基因的氨基酸序列分别与其他物种进行比对并通过邻位相接法(NJ法)构建进化树。与其他物种CYP19a 氨基酸序列同源性比对显示(图4)，草鱼CYP19a氨基酸序列与硬骨鱼类具有同源性，其中，与翘嘴鲌(Culter alburnus, KAK9958479.1)的同源性最高，达99.81%，与其他鲤科鱼类同源性在89.75%~96.32%之间。与其他鱼类的同源性相对较低，如达里湖高原鳅(Triplophysa dalaica, XP_056621982.1) (83.82%)和点鳍红眼脂鲤(Colossoma macropomum, XP_036420492.1) (83.82%)。与两栖类的同源性较低，如非洲爪蟾(Xenopus laevis, BAA90529.1) (57.23%)。与哺乳动物如人类(Homo sapiens, NP_000094.2)和小鼠(Mus musculus, NP_001335100.1)的同源性分别为55.63%和56.07%。与鸟类动物如红原鸡(Gallus Gallus, NP_001001761.3)的同源性为57.77%。与爬行动物的同源性最远，如绿瘦蛇(Ahaetulla prasina, XP_058011942.1)(53.67%)。系统进化树可分为五个大支，分别是鱼类、两栖类、哺乳类、鸟类和爬行类，其中，硬骨鱼类cyp19a氨基酸序列聚为一支，草鱼cyp19a基因与鲤科鱼类亲缘关系较近，与两栖类、哺乳类、鸟类和爬行类同源性逐渐降低。系统发育树结果显示，草鱼cyp19a的系统进化关系与传统物种进化地位基本一致。
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图4 基于GenBank数据库cyp19a编码氨基酸序列构建草鱼与其他物种的邻位相接法(NJ法)系统发育树谱系节点中的数字表示引导值（%）. 底部的条形图表示序列中有5%的氨基酸差异. Fig. 4 Neighbor-joining algorithm phylogenetic tree of Ctenopharyngodon idellus and other species constructed based on the cyp19a encoded amino acid sequence from the GenBank databaseNumbers in the phylogram nodes indicate the bootstrap value (%). The bar at the bottom indicates 5% amino acid divergence in the sequences. |
通过qRT-PCR检测48月龄草鱼雌鱼和雄鱼组织中cyp19a基因的表达情况，结果如图5所示。cyp19a在卵巢组织中表达水平最高且极显著高于精巢(P<0.01)；在脑、心脏、肌肉组织中均有表达，其中雌鱼的脑和肌肉组织中的表达水平显著高于雄鱼(P<0.05)；在眼、肝脏、中肠等组织微量表达。
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图5 cyp19a基因在草鱼多种组织的表达不同字母表示差异显著（P<0.05）. Fig. 5 cyp19a gene expression in various tissues of Ctenopharyngodon idellusDifferent letters indicate significant differences (P<0.05). |
如图6所示，在发育不同时期性腺，cyp19a在卵巢中的表达水平均显著高于精巢(P<0.05)，随着性腺发育，卵巢中cyp19a的表达水平呈上升趋势，48月龄时表达水平达到最高且极显著高于精巢(P<0.01)。精巢中cyp19a基因的表达一直处于较低水平，在36龄时表达量最高且极显著低于卵巢(P<0.01)。
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图6 cyp19a基因在草鱼不同时期性腺的表达不同字母表示差异显著（P<0.05）. Fig. 6 Expression of cyp19a gene in gonads of Ctenopharyngodon idellus at different stagesDifferent letters indicate significant differences (P<0.05). |
利用Wang等[24]开发的草鱼雌雄特异性分子标记鉴定草鱼性别后，以正常雌性草鱼卵巢组织为对照组，分析不同浓度cyp19a-dsRNA注射组雌鱼卵巢组织cyp19a的表达量变化，结果显示(图7)，注射不同浓度cyp19a-dsRNA后cyp19a基因的表达量均显著下降(P<0.05)。分别注射1 μg/g、5 μg/g和10 μg/g浓度cyp19a-dsRNA后，cyp19a的表达量无显著差异(P>0.05)，两个浓度组的基因沉默效率相似，且5 μg/g浓度下的基因沉默效率最高，以5 μg/g的cyp19a-dsRNA为最佳注射浓度进行注射实验。
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图7 草鱼卵巢cyp19a基因在注射不同浓度cyp19a dsRNA后的表达情况不同字母表示差异显著（P<0.05）. Fig. 7 Expression of cyp19a gene in Ctenopharyngodon idellus ovary after injection with different concentrations of cyp19a dsRNADifferent letters indicate significant differences (P<0.05). |
以正常雌雄草鱼性腺组织为对照组，注射组卵巢组织在注射cyp19a-dsRNA后5天qRT-PCR结果显示(图8)，与雌鱼相比，干扰后cyp19a的表达量均显著性降低(P<0.05), cyp19a基因的表达水平在干扰后5天内呈先下降后上升的趋势，注射后1 d表达量最低，沉默效率达59.72%，且显著高于雄鱼(P<0.05)。cyp19a-dsRNA干扰后，注射组foxl2a基因表达水平呈先上升后下降再缓慢上升的趋势，在2 d时表达量最高且显著高于雌鱼和雄鱼(P<0.05), 3 d时表达量最低显著低于雌鱼且高于雄鱼(P<0.05)，后上升至与雌鱼无显著差异(P>0.05)。注射组foxl2b基因表达水平呈先上升后下降的趋势，在2 d时表达量大幅上升，显著高于雄鱼和雌鱼(P<0.05)，后表达水平下降至与雌鱼无显著差异(P>0.05)。注射组dmrt1基因表达水平在干扰后呈先下降后上升的趋势，3 d时表达量最低，与雌鱼相比无显著差异(P>0.05)，且均显著低于雄鱼(P<0.05)。注射组amh基因表达水平呈先下降后升高的趋势，2 d时表达量最低且显著低于雌鱼和雄鱼(P<0.05)，后上升与雌鱼无显著差异(P>0.05)。
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图8 草鱼注射cyp19a-dsRNA后性腺组织性别相关基因的表达情况C-F：对照组雌鱼；dsRNA-F：注射组雌鱼；C-M：对照组雄鱼. 不同字母表示差异显著（P<0.05）. Fig. 8 Expression of sex-related genes in gonadal tissue after cyp19a-dsRNA injection in Ctenopharyngodon idellusC-F: control female, dsRNA-F: dsRNA female, C-M: control male. Different letters indicate significant differences (P<0.05). |
注射cyp19a-dsRNA后5天干扰的血清激素结果显示(图9)，对照组雌鱼睾酮(T)含量均显著低于雄鱼(P<0.05)，与雌鱼相比，注射组血清中T含量呈先上升后下降的趋势，注射后3 d时含量最高，显著高于雌鱼(P<0.05)，且与雄鱼无显著差异(P>0.05)，后下降至与雌鱼无显著差异(P>0.05)。对照组雌鱼雌二醇(E2)含量均显著高于雄鱼(P<0.05)，与雌鱼相比，注射组血清中E2含量呈先下降后上升的趋势，在注射后前3天血清中E2含量与雄鱼无显著差异(P>0.05)，且显著低于雌鱼(P<0.05)，在注射后4 d上升至与雌鱼无显著差异(P>0.05)。
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图9 草鱼注射cyp19a-dsRNA后睾酮(a)和雌二醇(b)的浓度C-F：对照组雌鱼；dsRNA-F：注射组雌鱼；C-M：对照组雄鱼. *表示与对照组雌鱼有显著差异（P<0.05）. Fig. 9 Concentrations of testosterone (a) and estradiol (b) after cyp19a-dsRNA injection in Ctenopharyngodon idellusC-F: control female, dsRNA-F: dsRNA female, C-M: control male. The * indicate significant differences (P<0.05) with control female group. |
通过RACE技术克隆获得草鱼cyp19a基因cDNA全长，氨基酸序列比对发现草鱼cyp19a基因属于性腺型芳香化酶基因，与鲤科鱼类翘嘴鲌、团头鲂等同类型且同源性较高，与传统依据形态学分类结果一致。氨基酸组成分析显示，草鱼CYP19a氨基酸序列中亮氨酸等碱性氨基酸的占比较高，这类氨基酸产生的静电相互作用可增强底物与蛋白功能域结合的稳定性，保证芳香化化反应顺利进行[26]。α-螺旋作为最常见的二级结构在蛋白质互作中发挥着关键作用[27]，草鱼CYP19a蛋白的α-螺旋占比为47.58%，是构成功能域的重要组成部分，在催化雄激素转化为雌激素的过程中起重要作用。通过信号肽预测和亚细胞定位发现草鱼CYP19a蛋白有可能存在于内质网上且不存在信号肽序列，与芳香化反应大多发生在内质网上的特性相吻合。此外，草鱼CYP19a蛋白保守结构包含血红素结合位点，与斑马鱼[28]、翘嘴鳜(Siniperca chuasti)[29]、兰州鲇(Silurus lanzhouensis)[30]保守结构类似，表明草鱼CYP19a蛋白与其他鱼类P450芳香化酶一样都具有血红素分子活性中心，有利于芳香化反应的进行。
3.2 cyp19a基因在草鱼不同组织和性腺发育时期的表达变化硬鱼类中，cyp19a基因的表达模式具有明显的性别二态性，在雌性中高表达，雄性中少量表达。本研究表明，cyp19a基因在草鱼成鱼性腺、脑和肌肉组织中呈现明晰的性别二态性，在卵巢中极显著高于精巢，这与尼罗罗非鱼[31]、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)[32]和花鲈(Lateolabrax maculatus)[33]等鱼类研究结果一致，cyp19a基因的高表达可以促进雄激素转化成雌激素，而雌激素在鱼类卵巢发育和维持中起重要作用。同时，本实验中，cyp19a在草鱼脑和肌肉组织中均呈现显著的性别二态性，这与印度囊鳃鲇(Heteropneustes fossilis)[34]、乌鳢(Channa argus)[35]等在雌鱼脑中表达量高于雄鱼的结果一致。推测cyp19a基因可能不仅对草鱼卵巢的分化起到调控作用，也可能参与脑-垂体-性腺轴的调控。此外，本实验中草鱼肌肉中cyp19a的表达量较高，仅次于性腺组织，推测与肌肉的发育有关，但具体作用需进一步研究。
cyp19a基因的表达在硬骨鱼类繁殖期和非繁殖期也表现出不同的雌雄差异，本研究中通过cyp19a基因在草鱼性腺不同发育阶段的表达结果观察到48月龄草鱼卵巢中 cyp19a mRNA的表达水平最高，其次是36月龄，12月龄表达量最低，表明cyp19a基因在卵巢的发育和成熟过程中发挥着重要作用。在鱼类早期卵黄发生的过程中，卵巢cyp19a基因的表达量会显著上升，如斑马鱼[36]。齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)精巢成熟阶段cyp19a转录水平在精母细胞中显著表达，表明可能与该时期精巢的发育以及精子的发生有关[37]。36月龄草鱼精巢中cyp19a mRNA水平显著高于其他时期，推测在草鱼精巢发育过程中cyp19a基因的表达可能是对精巢的成熟发挥促进作用。
3.3 cyp19a-dsRNA干扰下各性别基因在卵巢中的变化芳香化酶作为雌激素合成的终末端酶，cyp19a基因的激活还受多方基因的调控，为了探索cyp19a基因在草鱼性腺发育过程中的分子调控机制，挑选性别特异性基因foxl2a、foxl2b、dmrt1和amh基因进行辅助验证。本研究通过dsRNA连续5天干扰草鱼cyp19a基因，达到一定的敲降效果，注射组cyp19a基因的表达显著下调。foxl2基因是雌性决定通路中的一个关键基因，通过转录激活可介导类固醇生成基因，进而参与卵巢发育[38]。目前，foxl2基因在鱼类中存在不同的拷贝形式，即foxl2a和foxl2b[39]。金钱鱼(Scatophagus argus)中，cyp19a基因的激活依赖上游基因foxl2, foxl2基因的高表达可使cyp19a基因表达上调，促使雌激素的合成[40]。本研究发现，短时间内草鱼cyp19a基因的转录水平和E2的含量显著下降后， foxl2a和foxl2b基因的表达均显著上调，形成负反馈调控。foxl2基因的表达产物可与cyp19a基因启动子结合从而转录合成芳香化酶mRNA，本研究表明foxl2a和foxl2b基因的表达上调，可能是为了激活上调草鱼cyp19a基因的转录水平，以维持鱼体E2正常水平，从而确保卵巢的正常分化和发育。dmrt1基因是目前发现的较保守的性别决定基因，参与雄性性腺的分化和发育，其产生具有锌指结构的转录调控因子可以与特异的DNA序列结合，通过控制下游基因的表达来调控性腺发育方向[41]。有研究发现，罗非鱼中dmrt1基因可结合cyp19a基因启动子中ACATATGT回文序列，下调cyp19a基因的表达[42]。本研究中，短期的干扰沉默下，卵巢中dmrt1基因的表达无显著变化，有一定的降低，表明短时间内为了调节鱼体cyp19a基因的表达恢复正常水平，dmrt1基因的转录得到一定的抑制，但其中的具体调控机制还需进一步的探索。amh基因在哺乳动物中可以调节生殖细胞的发育和分化，长期以来参与雄性性腺分化，硬骨鱼类不存在缪勒氏管，但广泛存在amh和amhr2的同源基因，且与鱼类的生殖能力和生殖细胞增殖有关[43]。cyp19a缺失的斑马鱼中，amh基因与多个性别决定基因的表达水平显著下调，性腺分化和发育延迟[44]。本研究发现，cyp19a基因短时间内沉默，卵巢中amh基因的表达水平显著降低，amh基因的表达水平和T的含量呈负反馈调节，表明cyp19a基因转录水平与E2水平的下调所引发T水平的上调，可能是抑制amh基因转录发生的原因。本研究探讨了草鱼cyp19a基因在早期性腺发育中与各性别决定基因及性类固醇之间的调控作用，但其中更深层次的作用机制还有待进一步研究。
3.4 cyp19a-dsRNA干扰下血清激素的变化鱼类芳香化酶参与脑-垂体-性腺轴相关繁殖活动，既能决定鱼类性别分化，又能影响性腺发育。芳香化酶由cyp19基因编码，催化雄激素转化为雌激素，而硬骨鱼类存在两种编码形式的芳香化酶异构体，分别由cyp19a和cyp19b基因编码，目前还未从草鱼性腺中发现并克隆得到cyp19b基因。cyp19a单突变和cyp19a/cyp19b双突变的雌性斑马鱼在整个发育阶段均为雄性表型，且E2水平显著降低[45]。本研究通过注射dsRNA 5天干扰草鱼cyp19a基因，注射组cyp19a基因的表达显著下调，与之对应的注射组E2水平显著下降，同时注射组T水平显著上升，证实草鱼cyp19a基因转录水平与E2水平呈正向调控，表明在cyp19a基因转录水平下调的情况下，T转化为E2的芳香化反应可能被削弱，使得T含量的上升，E2含量降低。在注射dsRNA后4~5 d cyp19a基因的表达还处于干扰状态，表达被沉默，而E2和T水平均逐步恢复与对照组雌鱼无显著差异，表明单个基因的干扰下，草鱼E2和T的合成短期内有较为明显的变化，后恢复正常水平，可能引发了其他的激素合成通路对其进行调控。
4 结论本研究克隆得到草鱼cyp19a基因cDNA 全长序列及其在性腺发育过程中的表达模式，并利用dsRNA技术对cyp19a基因进行沉默干扰，引发foxl2a、foxl2b、dmrt1和amh基因表达水平及性类固醇激素含量的动态变化，为深入研究cyp19a基因对草鱼性别分化、性腺发育和卵巢维持过程中的作用奠定基础，为开发草鱼单性育种技术提供支撑。
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