白斑综合征病毒（WSSV）是危害克氏原螯虾养殖的重要病原。本研究旨在针对该病毒早期检测和诊断速度慢、灵敏度不高、不便捷等问题，建立新的WSSV一步式PCR检测方法。该方法基于WSSV主要囊膜蛋白VP19的基因保守序列设计引物，建立方法并针对分析特异性、分析灵敏度、诊断特异性、诊断灵敏度开展了与WOAH巢式PCR方法的比较评估。结果表明，本方法对WSSV具有高分析特异性，仅在阳性样本中扩增出196 bp条带，与传染性皮下和造血器官坏死病毒等其它常见水产病原无交叉反应。分析灵敏度测试显示，以WSSV标准质粒为模板时，本方法理论检出限低至1.83 copies/μL；以田间样品混合DNA为模板时，最低检出限达0.82 fg/μL，均优于WOAH推荐巢式PCR方法。同时，我们以WOAH Taqman qPCR方法为标准，比较了本方法和巢式PCR对317份田间样品的检测结果，本方法的诊断特异性为97.01%，诊断灵敏度为95.08%，均优于巢式PCR。综上所述，本研究建立的一步式PCR检测方法具有高特异性和高灵敏度的优点，适用于克氏原螯虾WSSV周年监测和快速诊断，能够为有效防控WSSV相关流行病提供重要的技术支持。