中国水产科学  2018, Vol. 25 Issue (2): 278-285  DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17202
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引用本文 

杨月静, 向梦斌, 叶祥益, 张争世, 罗辉, 叶华. 齐口裂腹鱼SNP标记与生长性状的关联分析[J]. 中国水产科学, 2018, 25(2): 278-285. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17202.
YANG Yuejing, XIANG Mengbin, YE Xiangyi, ZHANG Zhengshi, LUO Hui, YE Hua. Association analysis between SNP markers and growth-related traits in Schizothorax prenanti[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25(2): 278-285. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17202.

基金项目

国家自然科学基金资助项目（31402302）；中央高校基本科研业务费资助项目（XDJK2017B008）；西南大学荣昌校区青年基金资助项目（20700938）

作者简介

杨月静(1993-),女,硕士研究生,主要从事水产动物遗传育种与生物技术研究.E-mail:yangyuejing666@163.com

通信作者

叶华, 女, 副教授, 硕士生导师, 主要从事水产动物遗传育种与生物技术研究. E-mail:yhlh2000@126.com

文章历史

收稿日期：2017-05-27
修订日期：2017-10-19
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
齐口裂腹鱼SNP标记与生长性状的关联分析
杨月静 , 向梦斌 , 叶祥益 , 张争世 , 罗辉 , 叶华     
西南大学 鱼类繁育与健康养殖研究中心, 重庆 402460
收稿日期：2017-05-27；修订日期：2017-10-19
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31402302）；中央高校基本科研业务费资助项目（XDJK2017B008）；西南大学荣昌校区青年基金资助项目（20700938）
作者简介：杨月静(1993-),女,硕士研究生,主要从事水产动物遗传育种与生物技术研究.E-mail:yangyuejing666@163.com.
通信作者：叶华, 女, 副教授, 硕士生导师, 主要从事水产动物遗传育种与生物技术研究. E-mail:yhlh2000@126.com.
摘要：齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）是中国特有的冷水性经济鱼类，具有较高的营养和经济价值。为了研究齐口裂腹鱼生长性状关联的分子标记，本研究以114尾同批次繁殖、相同养殖条件的齐口裂腹鱼为研究材料，运用26个齐口裂腹鱼SNPs位点进行生长性状（体重、体高、全长、体长）关联分析。对齐口裂腹鱼生长性状的主成分分析表明，体重占解释方差的93.42%，且特征根大于1，累积方差大于85%，是齐口裂腹鱼生长性状的第一主成分。SNPs位点与生长性状相关分析结果显示：ug17711-0-2201与全长呈显著相关（P < 0.05），ug24013-0-3669对全长、体长有显著影响（P < 0.05），ug25050-0-1678对体重、体高、全长和体长都有显著影响（P < 0.05），ug22712-0-2452对体重、体高、全长和体长都有极显著影响（P < 0.01）。对与生长性状显著相关的4个SNPs位点进行多态性检测，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.2369和0.2110，平均多态信息含量为0.18，其中ug25050-0-1678具有中度多态性（0.25 ≤ PIC < 0.5）。综上所述，ug25050-0-1678和ug22712-0-2452与生长性状具有显著相关性，可作为候选位点用于齐口裂腹鱼的分子标记辅助育种。本研究旨为齐口裂腹鱼的遗传改良和选择育种提供基础资料。
关键词：齐口裂腹鱼    SNP标记    生长性状    关联分析    
Association analysis between SNP markers and growth-related traits in Schizothorax prenanti
YANG Yuejing , XIANG Mengbin , YE Xiangyi , ZHANG Zhengshi , LUO Hui , YE Hua     
Fisheries Breeding and Health Cultivation Research Center, Southwest University, Chongqing 402460, China
Corresponding author: YE Hua. E-mail:yhlh2000@126.com.
Abstract: Schizothorax prenanti, an economically important, cold-water fish species, has rich nutritional value and high economic value. With the increase in artificial breeding and breeding intensification, the germplasm resources of S. prenanti have been degraded, which is revealed in individual miniaturization, slow growth, and decreased disease resistance. Therefore, it is necessary to screen the molecular markers of growth traits and use molecular-marker-assisted breeding. In order to acquire some reliable molecular genetic markers for growth-related traits, the correlation analysis of 26 SNP markers and growth-related traits in S. prenanti were analyzed using 114 samples with the same growth conditions. A principal component analysis showed that body weight accounted for 93.42% of the variance, the eigenvalue was greater than 1 and the accumulative variance ratio was more than 85%, and it was the first principal component of the growth traits of S. prenanti. Correlation analysis between genotypes of SNPs and growth traits indicated that ug17711-0-2201 was significantly correlated with total length (P < 0.05), and ug24013-0-3669 showed a significant influence on total length and body length (P < 0.05). There was a significant association between ug25050-0-1678 and body weight, body height, total length, and body length (P < 0.05); ug22712-0-2452 and the body weight, body height, and body length were significantly associated (P < 0.01). We also estimated that the genetic diversity parameters for 4 loci were significantly correlated with the growth traits. The mean observed heterozygosity, expected heterozygosity, and polymorphism information content (PIC) were 0.2369, 0.2110 and 0.17 respectively. The polymorphism of ug25050-0-1678 was moderate (0.25 ≤ PIC < 0.5). In conclusion, ug25050-0-1678 and ug22712-0-2452 were significantly associated with growth traits, and could be used as important candidate molecular markers for breeding selection of S. prenanti. Our results could provide an effective basis for the study of genetic improvement and selective breeding in S. prenanti.
Key words: Schizothorax prenanti    SNP markers    growth traits    correlation analysis    

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti), 又名雅鱼, 是中国特有的名贵冷水经济鱼类, 主要分布于中国长江上游的金沙江、岷江、大渡河、青衣江及乌江等水域[1-2]。齐口裂腹鱼肉嫩味鲜, 具有较高的营养和经济价值, 深受消费者和养殖户的青睐, 目前已在四川、重庆等地实现了规模化养殖[3]。随着多代人工繁殖和养殖集约化程度的提高, 齐口裂腹鱼种质资源出现退化, 具体表现为个体小型化、生长缓慢和抗病力下降等, 因此, 开展生长性状关联分子标记筛选, 运用分子标记辅助育种极有必要。目前关于齐口裂腹鱼的研究主要集中于营养与生长、疾病防治以及种群遗传结构等方面[3-6], 而筛选与齐口裂腹鱼生长性状关联的分子标记的研究未见报道。

SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)是自1996年发展起来的第三代分子遗传标记, 具有数量大、遗传稳定性高、可靠性强的特点, 广泛应用于群体遗传学、遗传图谱构建及分子标记辅助育种研究中[7]。目前, 筛选与生长性状关联的SNP标记不仅在畜禽中广泛研究[8-10], 而且在水产动物中也陆续开展, 如多位研究者先后进行了SNP标记与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[11]、长牡蛎(Crassostrea gigas)[12]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[13]、大口黑鲈(Micrpterus salmoides)[14]、刺参(Apostichopus japonicus) [15]等水产动物生长性状的相关性分析。本研究随机挑选同批繁殖的齐口裂腹鱼作为研究对象, 分析了26个齐口裂腹鱼SNPs位点与生长性状的相关性, 以期为齐口裂腹鱼分子辅助育种和遗传改良提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究所用材料购自四川省峨眉山市冷水鱼养殖场, 随机挑选114尾同一批次人工繁殖的、饲养条件一致的13月龄的齐口裂腹鱼, 测定其体重、体高、全长和体长, 并剪取部分背鳍保存于无水乙醇中。

1.2 SNP标记

本研究所用26个SNPs位点由本实验室开发[16], 引物(表 1)由上海生工合成。

表 1 26个齐口裂腹鱼SNPs位点引物信息 Tab.1 The primer infomation of 26 SNPs in Schizothorax prenanti
1.3 实验方法 1.3.1 基因组DNA提取

剪取25 mg左右的鳍条, 采用上海生工“Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒”提取基因组DNA, 操作参照试剂盒说明进行。采用琼脂凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度, 并稀释成40 ng/μL, 4℃保存备用。

1.3.2 SNPs位点基因分型

提取的基因组DNA送至上海生工生物工程股份有限公司, 用Mass ARRAY® MALDI-TOF System对26个SNP位点进行基因分型。PCR扩增反应体系为10 μL, 包括1.25 μL 10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2), 0.65 μL 25mmol/L MgCl2, 2 μL 25 mmol/L dNTP, 2 μL正反引物0.5 μmol/L, 0.2 μL 5U/μL TaqDNA聚合酶(TaKaRa), 1.9 μL H2O和2 μL DNA模板。PCR反应程序为94℃预变性15 min; 94℃变性20 s, 退火温度56℃ 30 s, 72℃延伸60 s, 共45个循环; 72℃延伸3 min。在经PCR扩增后的产物中加入SNP序列特异性延伸引物, 在SNP位点上延伸一个碱基。延伸产物经纯化后与表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片共结晶, 将该晶体放入质谱仪的真空管中即可自动分析SNPs的位点信息。

1.4 数据分析 1.4.1 遗传特性分析

采用POPGENE 3.1[17]计算观测杂合度、期望杂合度和代表Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)偏差的P值。多态信息含量(PIC)由Botstein等[18]提出的公式计算：

$ {\rm{PIC = 1 - }}\left\{ {\sum\limits_{i = 1}^n {{P_i}^2} } \right\} - \left\{ {\sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {\sum\limits_{j = i + 1}^n {2{P_i}^2{P_j}^2} } } \right\} $

式中, n为某一位点上的等位基因数, Pi、Pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率, j=i+1。

1.4.2 SNPs与性状的关联分析

采用SPSS19.0进行检验体重、体高、全长、体长的正态分布, 并用correlate菜单检测各性状的相关性。然后进行该群体的生长性状的主成分分析, 按累计贡献率达85%的原则提取主成分。

采用一般线性模型(general linear model, GLM)中的多元方差分析和独立样本T检验分析各SNP位点以及不同基因型和等位基因与数量性状的相关性, 并采用Duncan法进行多重比较分析。

2 结果分析 2.1 生长性状分布

对114尾齐口裂腹鱼测量其体重、全长、体长、体高几个生长性状, 运用SPSS19.0对其进行正态分布检验, 结果显示各性状的P值都大于0.05, 符合正态分布, 均具有连续遗传变异的特点(表 2)。

表 2 齐口裂腹鱼体重、全长、体长、体高的正态分布检验 Tab.2 Normal distribution of body weight, total length, body length, body height of Schizothorax prenanti
2.2 各性状相关性和主成分分析

对体重、全长、体长、体高进行相关性检验(表 3)。体长与全长的相关系数最高, 为0.974;体重与全长的相关系数为0.943;体高与体长的相关系数最低, 为0.846;各性状间有极显著的相关性(P < 0.01)。

表 3 齐口裂腹鱼体重、全长、体长、体高的相关性检验 Tab.3 Correlation test on body weight, total length, body length, body height of Schizothorax prenanti

对114尾齐口裂腹鱼的生长性状进行降维处理, 结果显示体重占方差的93.42%, 全长占方差的4.66%, 体长和体高则低于2%。根据主成分提取原则, 选择特征根大于1的因子作为主成分, 体重的初始特征值为3.74, 而全长、体长和体高均小于1, 因此体重是齐口裂腹鱼的生长性状的第一主成分, 并且累积方差达93.42%, 累积贡献率超过85%(表 4)。

表 4 齐口裂腹生长性状的主成分分析 Tab.4 Principle component analysis on growth traits of Schizothorax prenanti
2.3 SNPs位点与生长性状的相关性

运用SPSS软件进行26个SNPs位点与体重、体高、全长、体长的连锁显著性分析(表 5), 一般线性模型中的多元方差分析结果显示, ug24013-0-3669对全长、体长有显著影响(P < 0.05), ug24013-0-3669的TT基因型在体长和全长的均值都显著高于CC基因型(P < 0.05), CT基因型也高于CC基因型, 但差异并不显著。ug25050-0-1678的CC基因型在体重、体高、全长、体长的均值都显著高于AA、AC基因型(P < 0.05), 说明ug25050-0-1678对体重、体高、全长和体长有显著影响(P < 0.05)。T检验分析结果表明：ug17711-0-2201对全长有显著影响(P < 0.05), ug22712-0-2452在体重、体高、全长和体长差异极显著(P < 0.01), ug22712-0-2452的CC基因型在4个性状上都极显著高于AC基因型(P < 0.01)。通过等位基因的效应值发现, 等位基因C在全长和体长显著高于等位基因A(P < 0.05), 在体重和体高极显著高于等位基因A(P < 0.01), 说明CC基因型为优势基因型(表 6)。

表 5 齐口裂腹鱼SNPs位点基因型与生长性状的关联分析 Tab.5 Correlation analysis between genotypes of SNPs and growth traits of Schizothorax prenanti
表 6 齐口裂腹鱼SNPs位点的等位基因与生长性状的关联分析 Tab.6 Correlation analysis between allelic genes of SNPs and growth traits of Schizothorax prenanti
2.4 SNPs位点多态性分析

SNPs位点的多态性检测结果见表 7。4个SNPs位点的观测杂合度为0.0877~0.4649, 期望杂合度为0.0842~0.3767, 平均值分别为0.2369和0.2110。除了ug25050-0-1678显著偏离了哈代温伯格平衡(P < 0.05), 其他位点都符合哈代-温伯格平衡定律(P > 0.05)。4个位点多态性水平都较低, 其中仅ug25050-0-1678具有中度多态性(0.25≤PIC < 0.5)[18]。

表 7 齐口裂腹鱼4个SNPs位点的特征 Tab.7 The features of four SNPs in Schizothorax prenanti
3 讨论 3.1 齐口裂腹鱼生长性状的主成分分析

主成分分析是利用降维的思想, 将原来的指标重新组合成一组彼此无关、信息互不重叠的新的综合指标, 同时, 根据一定原则和实际需要, 从中抽取较少的几个综合指标, 来反映原来指标所携带的较高比例的信息量[19]。根据Meyer[20]的研究, 当原来的指标高度相关时, 前几个主成分可以解释大部分变化, 从而可以消除冗余信息。目前该方法在水产动物中主要用于研究群体系统分类[21-23]以及形态学分析[24-26]等。对齐口裂腹鱼生长性状的主成分分析表明, 体重是齐口裂腹鱼生长性状的第一主成分, 占解释方差的93.42%, 高于全迎春等[14]对大口黑鲈生长性状的体重作为主成分分析的结果, 也高于王兰梅等[27]对福瑞鲤(Cyprinus carpio)生长性状的体重作为主成分分析的结果。因此, 在齐口裂腹鱼生长性状选择育种中, 体重能够准确反映齐口裂腹鱼的生长情况, 是主要的评估指标。体高、全长、体长与体重的相关性极显著(P < 0.01), 这3个性状可作为间接指标反馈齐口裂腹鱼的生长情况。

3.2 SNP位点的多态性及偏分离分析

遗传杂合度和多态信息含量是测量和评价遗传标记效用的参数, 一般认为遗传杂合度(H)是度量群体遗传变异的参数之一, 而多态性信息含量(PIC)是衡量基因变异程度高低的较好指标[28-29]。遗传多样性分析表明, 4个位点的平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.2369和0.2110, 远低于Wu等[30-31]采用微卫星标记对齐口裂腹鱼野生群体的分析结果。这主要是因为本研究所用养殖群体遗传多样性本身就很低, 另外是SNP标记仅有两个等位基因, 而Wu等[31]获得的微卫星标记的等位基因数为2~23个, 其多态信息含量低于微卫星标记。本研究中除ug25050-0-1678具有中度多态性, 其余都为低多态性位点。

偏分离是指某一群体中观察到的基因型比例明显偏离孟德尔频率的一种现象, 不同的种群有不同的孟德尔频率, 但在子二代中典型的孟德尔频率为1:2:1[32]。本研究中与生长性状相关的4个SNPs位点都出现了偏分离现象, 其中的优势基因型的频率明显低于理论值。导致偏分离的主要原因可能是：(1)该养殖群体种群规模萎缩导致近交, 而近交则会导致杂合子缺乏; (2)测试群体的样本数量较少; (3)无效等位基因的出现。关于SNP标记偏分离现象的报道较多, 如俞菊华等[33]在做建鲤(Cyprinus carpio var. jian)的SNPs基因型检测时也发现了偏分离现象。

3.3 齐口裂腹鱼SNP与生长性状的关联

单核苷酸多态性(SNP)是位于生物体中最丰富的多态性, 适用于高通量检测, 并且可以揭示未被其他标记和方法检测到的隐性多态性[34]。当SNP导致经济性状产生差异或与产生差异的突变相关联时, 这些SNP就显得尤其重要[35]。通过筛选候选基因的方法, 已经揭示一些SNP与各种水产动物的经济性状相关, 特别是体重。Ren等[36]的研究结果表明, 鲫(Cyprinus carpio)的Δ6Fad-a、Δ6Fad-b和Elovl5-a与鱼体体重存在显著性关性。吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的GHR1内含子3-A612G、3-A989T、7-A599C和GHR2内含子3-G687T, 以及IGF-1内含子3-C6T与增重具有相关性[37]。在甲壳动物中, 马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的prismalin-14基因的A376C SNP位点与壳宽、壳高、铰合部长、总重显著相关[38]。在本研究中, ug25050-0-1678和ug22712-0-2452对体重、体高、全长和体长都有显著影响, 体重是齐口裂腹鱼生长性状的第一主成分, 因此这两个位点可作为候选位点用于齐口裂腹鱼的分子标记辅助育种, 研究结果为齐口裂腹鱼的遗传改良和选择育种提供了基础资料。但由于生长性状受多种因子影响, 如鱼类的摄食效率、饲料利用率等, 因此筛选的标记仍需通过不断检验运用到生产中。

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