基于DNA条码基因的鳢科鱼类系统进化与物种鉴定

引用本文

赵建, 梁宏伟, 孙博, 李伟, 朱新平, 叶朝阳, 上官清, 陈昆慈. 基于DNA条码基因的鳢科鱼类系统进化与物种鉴定[J]. 中国水产科学, 2018, 25(4): 793-802. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.18062.

ZHAO Jian, LIANG Hongwei, SUN Bo, LI Wei, ZHU Xinping, YE Zhaoyang, SHANGGUAN Qing, CHEN Kunci. Phylogenetic and species identification analysis on the snakeheads (Channidae) based on the DNA barcoding sequence[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25(4): 793-802. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.18062.

基金项目

科技基础性工作专项（2013FY110700）；现代农业产业技术体系专项资金（CARS-46）；中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2014A11）；广州市珠江科技新星专项（201710010174）

作者简介

赵建(1982-), 副研究员, 研究方向为种质资源与遗传育种.E-mail:zj.8286@163.com

通信作者

陈昆慈, 研究员, 研究方向为种质资源与遗传育种. E-mail:chenkunci@aliyun.com

文章历史

收稿日期：2018-02-15
修订日期：2018-04-23

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

基于DNA条码基因的鳢科鱼类系统进化与物种鉴定

赵建 ¹, 梁宏伟 ², 孙博 ³, 李伟 ¹, 朱新平 ^1,4, 叶朝阳 ^1,4, 上官清 ^1,4, 陈昆慈 ¹

1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室, 广东广州 510380;
2. 中国水产科学研究院长江水产研究所, 湖北武汉 430223;
3. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所, 中国水产科学研究院特殊生境鱼类种质特性与抗逆育种重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150001;
4. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306

收稿日期：2018-02-15；修订日期：2018-04-23

基金项目：科技基础性工作专项（2013FY110700）；现代农业产业技术体系专项资金（CARS-46）；中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2014A11）；广州市珠江科技新星专项（201710010174）

作者简介：赵建(1982-), 副研究员, 研究方向为种质资源与遗传育种.E-mail:zj.8286@163.com.

通信作者：陈昆慈, 研究员, 研究方向为种质资源与遗传育种. E-mail:chenkunci@aliyun.com.

摘要：鳢科（Channidae）鱼类在亚洲分布广泛，其中中国的土著种类是重要养殖品种，国外很多种类主要作为观赏鱼引进我国。本研究利用线粒体COI基因序列，对分布于我国的鳢科鱼类不同种群样本序列，及在GenBank中获得其他鳢科鱼类的序列进行分析，探讨其作为DNA条形码基因对鳢科进行物种鉴定和系统进化分析的可行性。通过对本研究采集的149个鳢样本和122条GenBank中已有序列进行分析，结果显示，所研究的鳢科鱼类的COI基因576 bp片段中不存在碱基插入缺失现象，其平均碱基含量A+T（51.4%）高于G+C含量（48.6%），存在偏倚性；多态位点占47.2%。利用Mega 6.0软件基于Kimura’s 2-parameter模型计算25种鳢种内平均遗传距离为0.028，其中巴卡鳢（Channidae barca）种内遗传距离最大，为0.137，超过了某些种间遗传距离；种间遗传距离为0.030~0.302，平均为0.217。其中最大距离0.302为饰鳍鳢（Channidae ornatipinnis）和黑体鳢（Channidae melasoma）之间，甚至超过了与外群之间的距离。利用邻接法（Neighbour-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum Likelihood Tree，ML）分别构建系统进化树，同种个体获得较高支持率，而不同种间的关系支持率较低，同时发现存在由多个种组成的巴卡鳢和南鳢复合支系。本研究表明，进行我国土著鳢科鱼类物种鉴定时COI基因是有效的工具，而进行外来观赏鱼鉴定，尤其是巴卡鳢、斯氏鳢等物种进行鉴定时，需结合多方面信息；COI基因不适合鳢科鱼类种间遗传进化关系的研究。

关键词：鳢线粒体COI基因 DNA条码

Phylogenetic and species identification analysis on the snakeheads (Channidae) based on the DNA barcoding sequence

ZHAO Jian ¹, LIANG Hongwei ², SUN Bo ³, LI Wei ¹, ZHU Xinping ^1,4, YE Zhaoyang ^1,4, SHANGGUAN Qing ^1,4, CHEN Kunci ¹

1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China;
2. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China;
3. Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150001, China;
4. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

Corresponding author: CHEN Kunci. E-mail:chenkunci@aliyun.com.

Abstract: Snakeheads are of important cultural value as ornamental fishes in China. In this study, the mitochondrial COI (cytochrome oxidase subunit I) gene fragments 576 bp long were used to analyze the phylogenetic and diversity of snakeheads in and out of China, to probe the probability of the COI gene to be used as a barcoding sequence for species identification. Including 149 specimens of different geographic populations of C. argus, C. maculata, C. asiatica, and C. gachua native to China, and 122 sequences of other species downloaded from GenBank, a total of 271 snakehead individuals of 25 species, were analyzed. Of all the sequences, no insertion-deletion sites existed. The average content of A+T (51.4%) was higher than that of G+C (48.6%). The average intraspecies genetic distance was 0.028, but reached 0.137 in C. barca, which was higher than some interspecies distances. The interspecies distances ranged from 0.030 to 0.302, with an average of 0.217. The largest distance exists between C. ornatipinnis and C. melasoma, exceeding some distances to outgroup. Phylogenetic trees based on the neighbor-joining and maximum likelihood method were constructed. Most individuals from the same species formed a monophyly, and high bootstrap values were obtained for them, but this was not the case for several other species. However, the relationships of species have low bootstrap values, indicating improper phylogenetic analysis of the COI gene for snakeheads. Furtherly, a C. barca compound and a C. gachua compound were formed according to the phylogenetic trees. The results of this research indicate that the COI gene is proper for the species identification of native species of snakeheads in China, but more information regarding imported ornamental snakeheads is needed.

Key words: snakeheads (Channidae) mitochondrial COI gene DNA barcoding

鳢科(Channidae)属鲈形目(Perciformes)鱼类, 因其头部形状与蛇头相似而被称为蛇头鱼(snake heads), 主要分布在亚洲和非洲。鳢科鱼类主要有两个属组成:鳢属(Channa)和副鳢属(parachanna)。其中, 副鳢属主要分布在西非中部, 共3种; 鳢属主要分布在亚洲, 共有26种, 西起中东的伊朗, 经南亚、东南亚、中国, 到朝鲜半岛、俄罗斯远东地区都有分布^[1]。

我国鳢科鱼类主要有乌鳢(Channa argus)、斑鳢(Channa maculata)、月鳢(Channa asiatica)和南鳢(Channa gachua)^[2]。在中国、南亚和东南亚国家, 鳢是重要经济鱼类。其中, 乌鳢、斑鳢及其杂交种是我国重要养殖对象, 年产量达50多万吨^[3]。乌鳢在我国分布广泛, 除高原外, 从长江流域往北一直到黑龙江都有分布; 斑鳢由于低温适应能力较差, 主要分布在珠江流域及以南地区。月鳢主要分布在长江流域及以南地区, 包括台湾、海南岛等^[4]。Zhang等^[4]报道我国广西一鳢科鱼类新物种黑月鳢(Channa nox), 认为其与月鳢相近但存在显著形态差异, 应为独立物种。南鳢分布非常广泛, 在南亚、东南亚和中国都有分布, 世界自然保护联盟(IUCN)认为其为分类地位并未完全厘清, 可能是复合物种, 并将其列入红色保护名录, 其保护级别为LC (Least Concern) (http://www. iucnredlist.org/details/166123/0)。

除我国的土著品种外, 原产南亚和东南亚的多种鳢科鱼类由于体色艳丽, 主要以观赏为目的引进我国, 被称为雷龙鱼。主要有巴卡雷龙(巴卡鳢Channa barca)、黄金眼镜蛇雷龙(橙斑鳢Cha nna aurantimaculata)、蓝宝石雷龙(斯氏鳢Channa stewartii)、七彩雷龙(布氏鳢Channa bleheri)、大铅笔(小盾鳢Channa micropeltes)等。南亚和东南亚鳢科鱼类种类众多, 有些种实际为复合种, 并不断有新种被发现和确认^[5-6]。由此可见对鳢科鱼类的分类学研究需要更加深入。

对鳢科鱼类的系统进化研究, 中外学者都有开展相关研究。Zhu等^[7]、朱树人等^[8]先后对COI和16S rRNA序列对乌鳢、斑鳢和月鳢进行了研究。陈晨等^[9]利用COI序列对乌鳢及其他18种鳢进行了进化分析, 认为乌鳢和斑鳢进化关系更近。薛丹等^[10]利用线粒体控制区序列分析了云南澜沧江和海南岛水系宽额鳢(南鳢)的遗传变异, 认为云南组群和海南组群间高度分化, 可能受云贵高原隆起和海南岛陆海分离影响。Li等^[1]利用NADH脱氢酶亚基2 (ND2)基因进行了20种鳢科鱼类系统进化研究。Lakra等^[11]利用COI序列重点对喜马拉雅山东部的鳢科鱼类进行了分析; Conte-Grand等^[12]又利用较大数量序列, 进行了更大范围分析, 解决了一些物种误判对系统分类带来的矛盾。

线粒体DNA是独立于核基因之外的母系遗传的遗传物质, 具有进化速率快的特点, 是进行系统进化分析的常用工具之一。其中的细胞色素氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I gene, COI)相对比较保守, 易于扩增, 在物种鉴定中被广泛使用^[13]。被越来越多的国内外学者用于构建DNA条形码数据库^[14], 用于物种鉴定和系统发育分析。本研究利用COI基因对我国鳢科鱼类土著种乌鳢、斑鳢、月鳢不同种群样品及其他鳢科鱼类进行分析, 检测其不同群体的多样性, 探讨其用于物种鉴定的可行性。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本研究采集分布于我国的鳢科鱼类乌鳢、斑鳢、月鳢、南鳢4种及引进观赏鱼小盾鳢样本, 共149个体样本。其中乌鳢样本包括黑龙江(抚远段)27个、湖北长江流域样本13个、湖南湘江样本8个; 斑鳢样本包括珠江流域桂江段、贺江、北江段、三角洲(花都)、茂名鉴江、福建九龙江各10个, 以及海南昌化江和万泉河各1个; 月鳢样本包括长江流域17个、茂名鉴江3个、阳江漠阳河7个; 南鳢为海南昌化江2个(CHJNL1, CHJNL2)、万泉河1个(WQHNL); 小盾鳢样本9个购于广州花地湾观赏鱼市场。从GenBank数据库中下载其他鳢科鱼类COI基因序列122条, 本研究共分析鳢科25种271个样本。另外采集同属攀鲈亚目的攀鲈10个、叉尾斗鱼5个, 鲤形目的鲤和鳙各8个样本作为鳢科鱼类系统进化分析的外群样本。标本的鳍条组织保存于无水乙醇中, 收藏于中国水产科学研究院珠江水产研究所。物种的形态学特征鉴定主要依据《中国淡水鱼类检索》^[15]、《广东淡水鱼类志》^[2]和《海南岛淡水及河口鱼类志》^[16]。研究样本信息如表 1所示。

表 1 样本名录及相关信息 Tab.1 Sampling information and GenBank accession numbers of COI genes

序号 No.	物种species	样品数 number of samples	GenBank登录号GenBank No.
1	乌鳢Channa argus	52	本研究this study (n=48) KM077026, JX978723, KC823605, AP006041
2	阿萨姆鳢Channa andrao	1	MF496661.1
3	月鳢Channa asiatica	31	本研究this study (n=27) KU852442, MF496669, KC819602, KC819605
4	橙斑鳢Channa aurantimaculata	4	MF496671, HM117175, KJ847161, KJ937387
5	斑卡鳢Channa bankanensis	4	MF496694, MF496674, KJ937371, KJ937395
6	巴卡鳢Channa barca	7	MF496698, MF496699, HM117180, HM117181, KJ847151, KJ847149, KJ847150
7	布氏鳢Channa bleheri	5	MF496700, MF496704, EU924638, HM117182, HM117186
8	缅甸鳢Channa burmanica	2	MF496706.1, MF496707.1
9	红鳢Channa diplogramma	2	KJ937431, MF496709
10	南鳢Channa gachua	12	本研究this study (n=3) MF496738, MF496739, MF496741, KT960763, KJ936866, KT001932, KJ937429, KJ937358, KJ937342
11	茵列鳢Channa harcourtbutleri	6	MF496808, MF496809, LC190225, LC190210, LC190096, LC189620
12	红尾鳢Channa limbata	4	LC190112, LC190110, LC190123, LC190129
13	带鳢Channa lucius	6	MF496830, MF496832, KT001056, KT001933, KJ937433, JF781234
14	斑鳢Channa maculata	64	本研究this study (n=62) MC020011, KC823606
15	眼鳢Channa marulius	7	KY425557, KY425554, KY425553, KY425550, KY290039, KY290038, KY694512
16	黑体鳢Channa melasoma	3	MF496853, MF496860, KJ937380
17	小盾鳢Channa micropeltes	12	本研究this study (n=9) JN024961, KM213040, KJ937408
18	东方鳢Channa orientalis	11	MF496870, MF496868, KY290045, FJ459484, JN245991, KU667386, KT364793, KJ847131, KJ937436, KF742438, JX105474
19	饰鳍鳢Channa ornatipinnis	5	MF496875, KU667361, KJ937428, MF496872, KJ847165
20	帕瑙鳢Channa panaw	2	MF496877.1, LC190351.1
21	侧眼鳢Channa pleurophthalma	3	MF496881, KM213041, KJ937345
22	拟眼鳢Channa pseudomarulius	4	KY425566.1, KY425565.1, KY425568.1, MF496884.1
23	翠鳢Channa punctata	11	MF462277, MF496905, MG181947, KY867666, KY290125, KY290124, KU043334, EU417796, JN245992, JN245990, HM117201
24	斯氏鳢Channa stewartii	7	MF496932, MF496928, KU667366, KU667362, KJ937455, KF742419, KJ847152
25	线鳢Channa striata	6	MF462281, MF462282, MG438366, MF496970, LC190237, LC189770
26	攀鲈Anabas testudineus	10	本研究this study
27	叉尾斗鱼Macropodus opercularis	5	本研究this study
28	鲤 Cyprinus carpio	8	本研究this study
29	鳙Aristichthys nobilis	8	本研究this study

表 1 样本名录及相关信息 Tab.1 Sampling information and GenBank accession numbers of COI genes

1.2 COI基因序列测定

首先按照Omega组织DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit)操作程序提取样本DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测质量后于-20℃冰箱保存。

COI基因扩增使用鱼类通用引物FISH F1/ FISH R1和FISH F2/ FISH R2^[17], 引物序列如下:

FISH F1: 5′-TCAACCAACCACAAAGACAT TGGCAC-3′

FISH R1: 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAA GAATCA-3′

FISH F2: 5′-TCGACTAATCATAAAGATAT CGGCAC-3′

FISH R2: 5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGA ATCAGAA-3′

PCR扩增反应体系为20 μL, 包括: dNTP mix (0.25 mmol/L) 1 μL, 10×Taq buffer 2 μL, MgCl₂ 2 μL, 模板DNA 20 ng, 上下游引物(10 mmol/L)各1.0 μL, 加水补足20 μL。PCR扩增条件: 94℃预变性10 min; 然后94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 运行35循环; 最后72℃延伸8 min。PCR扩增后用1%琼脂糖电泳检测目标产物, 并用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek, Guangzhou, China)纯化回收, 委托广州艾基生物技术有限公司进行测序。

1.3 数据分析

首先对获得的149个鳢和31个外群物种COI基因序列进行拼接比对, 并进一步与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行Blast比对, 确保扩增序列的准确性。利用MEGA 6.0软件统计基因序列和相应氨基酸序列的变异, 利用Kimura’s 2-parameter^[18]模型对种间和种内的遗传距离进行计算, 用邻接法(Neighbour-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood Tree, ML)分别构建分子系统进化树。

2 结果分析 2.1 鳢DNA条码COI基因序列多态性

本研究获得的149条COI基因序列与从GenBank下载的122条序列进行比对。为使所有序列具有可比性, 将较长序列进行裁剪, 最终长度为576 bp。所有物种中均未出现碱基插入和缺失现象。鳢科鱼类COI序列的碱基A、T、C、G分别为23.8%、27.7%、31.2%和17.4%, C+G含量为48.6%; 271条序列中, 多态性位点数总计272个, 多态位点比例为47.2%, 其中parsim-infor mative位点数为261个, 占45.3%。序列共编码192个氨基酸, 其中多态位点为59个, 多态比例为30.7%。

2.2 鳢种内、种间遗传距离

利用MEGA6.0软件的Kimura’s 2-parameter模型对鳢属及外群的种内和种间的遗传距离进行计算(表 2)。25种鳢的种内平均遗传距离为0.028, 其中橙斑鳢、侧眼鳢和拟眼鳢种内遗传距离为0, 巴卡鳢种内遗传距离最大为0.137, 超过了某些种间遗传距离。25种鳢的种间遗传距离为0.030~0.302, 平均为0.217。其中最大距离0.302为饰鳍鳢和黑体鳢之间, 甚至超过了与外群之间的距离。

表 2 基于K2P模型的鳢属25个物种及4个外群种间(对角线下)及种内遗传距离(对角线内) Tab.2 Genetic distance within-species 23 and between 28 Siluriformes species based on Kimura's 2-parameter distance

物种species	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29
1.外群叉尾斗鱼 outgroup Macropodus opercularis	0.000
2.外群鳙 outgroup Aristichtys nobilis	0.229	0.000
3.外群鲤 outgroup Cyprinus carpio	0.273	0.169	0.003
4.外群攀鲈 outgroup Anabas testudineus	0.264	0.266	0.271	0.000
5.阿萨姆鳢Channa andrao	0.246	0.259	0.283	0.281	N/C
6.乌鳢Channa argus	0.289	0.276	0.251	0.242	0.260	0.001
7.月鳢Channa asiatica	0.242	0.240	0.231	0.238	0.235	0.184	0.021
8.橙斑鳢 Channa aurantimaculata	0.261	0.270	0.277	0.271	0.168	0.225	0.226	0.000
9.斑卡鳢Channa bankanensis	0.261	0.244	0.231	0.259	0.257	0.193	0.206	0.235	0.041
10.巴卡鳢Channa barca	0.293	0.286	0.299	0.308	0.181	0.241	0.242	0.136	0.263	0.137
11.布氏鳢Channa bleheri	0.268	0.269	0.283	0.274	0.171	0.226	0.219	0.145	0.245	0.130	0.040
12.缅甸鳢Channa burmanica	0.266	0.271	0.294	0.288	0.181	0.248	0.239	0.124	0.256	0.157	0.150	0.002
13.红鳢Channa diplogramme	0.259	0.239	0.223	0.233	0.218	0.213	0.201	0.219	0.196	0.245	0.249	0.240	0.009
14.南鳢Channa gachua	0.282	0.259	0.284	0.265	0.158	0.245	0.227	0.128	0.246	0.173	0.159	0.156	0.224	0.038
15.茵列鳢 Channa harcourtbutleri	0.287	0.265	0.272	0.269	0.158	0.254	0.234	0.132	0.242	0.185	0.167	0.161	0.227	0.054	0.016
16.红尾鳢Channa limbata	0.281	0.271	0.280	0.265	0.155	0.252	0.233	0.132	0.250	0.178	0.161	0.155	0.229	0.053	0.030	0.031
17.带鳢Channa lucius	0.242	0.242	0.216	0.251	0.261	0.192	0.199	0.251	0.110	0.268	0.255	0.261	0.201	0.268	0.258	0.261	0.042
18.斑鳢Channa maculata	0.271	0.263	0.233	0.222	0.254	0.101	0.198	0.243	0.215	0.253	0.243	0.254	0.186	0.251	0.252	0.253	0.200	0.001
19.眼鳢Channa marulius	0.275	0.249	0.257	0.250	0.234	0.201	0.196	0.240	0.223	0.242	0.220	0.218	0.183	0.239	0.253	0.243	0.212	0.190	0.024
20.黑体鳢Channa melasoma	0.285	0.262	0.251	0.270	0.255	0.234	0.204	0.262	0.224	0.267	0.260	0.267	0.181	0.254	0.254	0.259	0.252	0.217	0.214	0.001
21.小盾鳢 Channa micropeltes	0.269	0.254	0.246	0.244	0.238	0.203	0.200	0.237	0.204	0.253	0.253	0.260	0.094	0.247	0.244	0.253	0.194	0.193	0.189	0.186	0.002
22.东方鳢Channa orientalis	0.252	0.246	0.264	0.268	0.200	0.235	0.251	0.164	0.257	0.194	0.169	0.177	0.228	0.192	0.182	0.185	0.252	0.234	0.240	0.267	0.232	0.060
23.饰鳍鳢 Channa ornatipinnis	0.285	0.277	0.307	0.311	0.239	0.263	0.241	0.220	0.252	0.233	0.209	0.243	0.254	0.236	0.233	0.231	0.240	0.246	0.239	0.302	0.249	0.199	0.059
24.帕瑙鳢Channa panaw	0.253	0.246	0.272	0.272	0.270	0.209	0.215	0.229	0.225	0.245	0.234	0.236	0.198	0.233	0.239	0.237	0.229	0.216	0.216	0.221	0.220	0.234	0.261	0.003
25.侧眼鳢 Channa pleurophthalma	0.261	0.241	0.254	0.248	0.232	0.219	0.211	0.246	0.224	0.256	0.244	0.259	0.145	0.198	0.218	0.221	0.242	0.207	0.244	0.209	0.163	0.239	0.253	0.203	0.000
26.拟眼鳢 Channa pseudomarulius	0.267	0.249	0.261	0.226	0.233	0.188	0.210	0.222	0.211	0.245	0.231	0.224	0.191	0.225	0.248	0.236	0.211	0.213	0.096	0.205	0.201	0.229	0.263	0.219	0.223	0.000
27.翠鳢Channa punctata	0.252	0.269	0.246	0.242	0.218	0.212	0.209	0.206	0.232	0.230	0.202	0.234	0.203	0.220	0.227	0.227	0.233	0.209	0.185	0.208	0.199	0.197	0.252	0.219	0.228	0.179	0.018
28.斯氏鳢Channa stewartii	0.285	0.272	0.280	0.287	0.163	0.234	0.236	0.124	0.247	0.138	0.160	0.134	0.228	0.109	0.105	0.240	0.229	0.253	0.245	0.188	0.239	0.231	0.230	0.220	0.230	0.220	0.218	0.099
29.线鳢 Channa striata	0.247	0.244	0.264	0.256	0.215	0.225	0.186	0.233	0.246	0.255	0.246	0.255	0.219	0.225	0.237	0.211	0.198	0.127	0.206	0.245	0.263	0.226	0.210	0.188	0.210	0.188	0.186	0.235	0.023

2.3 鳢属种间系统进化关系

以鲤形目的鲤、鳙和与鳢同属攀鲈亚目的攀鲈和叉尾斗鱼为外群, 基于邻接法(Neighbour-Joining, NJ)和最大似然法(Maximum likelihood, ML)构建的鳢属种间系统进化树(图 1, 图 2)。两种方法构建的进化树中, 多数物种种内个体均以较高支持率聚为一支, 然而巴卡鳢的7个样本分成3个差异极大的类群, 分别与橙斑鳢、斯氏鳢、布氏鳢组成不同的进化支系, 这4种鳢与缅甸鳢组成了一个巴卡鳢复合支系(图 3A); 斯氏鳢的7个样本中4个在巴卡鳢复合支系中, 而另外3个样本与南鳢、红尾鳢和茵列鳢组成南鳢复合支系(图 3B)。基于两种方法构建的进化树中, 作为外群的攀鲈都被归入了鳢属内, 而且与乌鳢、斑鳢、月鳢较近。鳢科鱼类种内个体间聚类支持率均较高, 包括巴卡鳢和南鳢复合支系内, 而种间或姊妹群间相互关系支持率均较低。

图 1 基于COI基因序列构建的鳢属种间NJ进化树节点上数字显示1000次重复的bootstrap验证分析支持率, 标尺代表遗传距离单位为0.02/百万年. Fig.1 Neighbour-joining tree based on the COI gene sequences of Channa Bootstrap values in 1000 replications are shown on branches. Scale represents the genetic distance of 0.02/million years.

图 2 基于COI基因序列构建的鳢属种间ML进化树节点上数字显示1000次重复的bootstrap验证分析支持率, 标尺代表遗传距离单位为0.05/百万年. Fig.2 Maximum likelihood tree based on the COI gene sequences of Channa Bootstrap values in 1000 replications are shown on branches. Scale represents the genetic distance of 0.05/million years.

图 3 巴卡鳢(A)和南鳢(B)复合支系中物种的进化关系 Fig.3 Phylogenetic relationship of the C. barca and C. gachua complex lineage

3 讨论 3.1 鳢科鱼类COI基因遗传多样性

鳢科鱼类的COΙ基因序列GC含量为48.6%, 比AT含量稍少, 与线粒体全序列^[19]和科鱼类^[20]的GC含量相当, 显著高于鲷科鱼类^[21], 存在偏倚现象但不明显。在所有271条序列中, 未出现碱基插入和缺失位点, 多态性位点数总计272个, 多态位点比例为47.2%, 编码氨基酸多态比例为30.7%。多态性显著高于其他鱼类^[20-21], 而低于对虾类^[22]。

基于Kimura’s 2-parameter模型的种间和种内遗传距离显示, 乌鳢和斑鳢虽在我国分布广泛, 但其种内多样性并不高, 两个物种间的遗传距离也比较小。而其他分布于东南亚和南亚的鳢, 如巴卡鳢、斯氏鳢等种内遗传距离很大, 甚至超过了一些种间的距离。造成这种情况的原因可能是由于物种鉴定的误判^[12]。不同鳢种间的遗传距离较大, 有些种间遗传距离(如饰鳍鳢和黑体鳢之间达到0.302)甚至超过了与外群的遗传距离。这说明鳢科鱼类种间COI基因序列遗传多样性较高。

3.2 利用COI基因进行鳢科鱼类的系统进化和物种鉴定

利用邻接法和最大似然法分别构建鳢的系统进化树, 其种内个体和部分种间的聚类支持率较高, 而且对巴卡鳢和南鳢复合支系内的支持率也较高, 这与其他同类研究的结果一致^{[7, 11, 23-26]}。而不同种或姊妹群间的支持率较低, 而且两种方法获得的进化树的拓扑结构也存在一定的差异, 这说明利用COI基因不能很好地体现鳢科鱼类的进化关系。

Hebert等^[13]提出的物种间遗传变异高于种内变异10倍, 可以作为物种鉴定的DNA条形码标准。Zhu等^[7]利用COΙ序列作为DNA条码对乌鳢、斑鳢、月鳢和线鳢进行鉴定, 种间距离最小为0.091, 种内距离最大为0.027, 可以进行准确鉴定。本研究对不同地理种群的乌鳢、斑鳢、月鳢及南鳢进行分析, 其种间距离均显著大于种内距离, 在进化树中聚类支持率很高, 按照以上标准, 我国土著的鳢科鱼类通过COI序列进行物种鉴定是准确的。

由于南鳢和巴卡鳢复合支系的存在, 对相关物种的鉴定造成了影响。Conte-Grand等^[12]注意到了鳢科鱼类间的物种鉴定的不一致, 进行了较大规模重新分析和鉴定, 利用较大数据量解决了一些种类的物种鉴定问题, 但对于一些样本较稀少的种类如巴卡鳢等, 数据积累还不够。本研究的结果也表明不同研究人员获得的巴卡鳢样本聚类时分别与橙斑鳢、布氏鳢和斯氏鳢聚为一支, 但它们之间的遗传距离也达到0.13以上, 遗传分化明显。由于这两个复合支系的物种在我国主要以观赏鱼存在, 在对观赏鱼市场采集的样本进行鉴别时, COI序列结果并不准确, 需要根据样本的形态分类特征进行鉴别。另一方面, 由于观赏鱼市场种质引进和保种规范性问题, 其种质可能存在混杂, 进行物种鉴定时需要进行多方面的调查和研究。

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