三块鱼又名远东红鳍鱼、滩头鱼, 是雅罗鱼亚科三块鱼属(Tribolodon)几种土著经济种的统称。主要分布于太平洋西北部的日本海及一些内陆淡水河流, 包括俄罗斯的滨海省、哈巴罗夫斯克和萨哈林, 日本和朝鲜半岛, 在中国仅分布于绥芬河和图们江流域^[1-2]。绥芬河是日本海的注水河流之一, 三块鱼性腺发育成熟后, 分批溯河而上进入河口, 在急滩哨口处中产卵, 故此得名“滩头鱼”, 产卵后立即返回近海区^[2]。渔民根据其洄游时间和体色差异分为“金滩头”、“银滩头”和“黑滩头”。4月初游来第一批, 鱼身两侧各有数条橘红色条纹, 在阳光照耀下金光闪闪, 称“金滩头”; 5月第二批, 体侧条纹为银白色, 称“银滩头”; 6月第三批, 鱼身条纹浓黑, 称“黑滩头”, 数量比前两批多。

中国学者虽然已对三块鱼洄游群体的生物学、生殖结构组成、生态学、盐碱耐受性等方面进行了详细报道^[2-6], 但关于其分类地位一直存有争议。早期一些学者将金、银、黑3种滩头鱼归为3个不同的生态群体, 并且认为银滩头只是金、黑滩头的亚成体^[7-8]; 后续研究发现, 金、黑滩头在形态学、繁殖生物学、同工酶和RAPD基因型等方面存在比较明显的差异, 将二者归为两个不同的种, 即珠星三块鱼(Tribolodon hakonensis)和三块鱼(T. brandtii)^{[2, 9-11]}。由于三块鱼主要分布在俄罗斯和日本境内, 关于其种属划分及起源都进行了较为系统的研究。早期根据血清和肌肉蛋白谱带、同工酶及mtDNA的研究结果将三块鱼划分为4个有效种, 分别为珠星三块鱼(Günther, 1877)、三块鱼(Dybowski, 1872)、萨哈林三块鱼(T. sachalinensis)(Nikolsky, 1889)和T. nakamurai (Doi et Shinzawa, 2000)^[12-14]。但最新研究发现, 来自俄罗斯滨海区的珠星三块鱼和哈巴罗夫斯克、萨哈林及日本的珠星三块鱼在形态、核型、精子微观结构及mtDNA序列都存在明显分化^[15-18]。因此, 也有学者将俄罗斯滨海区的珠星三块鱼南方型(southern forms of T. hakonensis)视为一个隐秘的新种(T. sp)^{[15, 18]}。

DNA条形码技术(DNA barcoding), 即利用一个标准基因的DNA序列作为物种的鉴定手段, 首次由加拿大Guelph大学的Hebert教授及其研究团队于2003年提出, 并发现线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunit I, COI)靠近5 端的一段序列对物种鉴定十分有效^[19-20]。程磊等^[21]利用该技术分析了鲫属鱼类种与亚种的划分, 认为黑鲫(Carassius carassius)、白鲫(C. cuvieri)和鲫(C. auratus)为3个有效种, 而银鲫(C. auratus gibelio)只是鲫的一个亚种。刘璐等^[22]对17种鲻科鱼类进行了鉴定, 证实了该技术在物种鉴定方面的有效性。由于缺乏与来自日本或俄罗斯等产地三块鱼样本遗传学数据的直接比较, 目前中国绥芬河三块鱼的种属划分结果仍缺乏足够的分子证据。本研究利用DNA条形码技术, 对分布在中国绥芬河的珠星三块鱼和三块鱼及二者疑似杂交种与采自日本的珠星三块鱼进行系统发育分析, 同时与国外发表的三块鱼属鱼类的COI序列进行同源比较, 以明确中国三块鱼的种属划分, 同时探讨疑似杂交种产生的缘由, 避免人为因素造成的种质混杂, 为更好地保护和利用这些优异的种质资源提供科学依据。

2016年4—6月, 根据三块鱼不同繁殖群体在黑龙江东宁县绥芬河的洄游时间及形态学差异, 分别采集珠星三块鱼21尾、三块鱼19尾, 以及二者可能的疑似杂交种10尾(图 1); 日本珠星三块鱼3尾, 采自日本青森县宇曾利山湖(日本东京大学, Kaneko教授惠赠)。所有样本鳍条于95%乙醇中保存备用。

图 1(Fig. 1)

图 1 绥芬河三块鱼 Fig.1 Tribolodon species in Suifen River

剪取少量95%乙醇保存的鳍条, 滤纸吸干乙醇, 放入2 mL离心管中加入600 μL DNA提取裂解液(成分: 1 mol/L Tris pH 8.0、5 mol/L NaCl、0.5 mol/L EDTA pH 8.0、10% SDS和200 μg/mL蛋白酶K)于55℃过夜消化; 次日加入等体积的酚/氯仿混合液(1:1)抽提1次, 12000 r/min室温离心10 min, 吸取上清(约550 μL)加入1 mL无水乙醇沉淀, 12000 r/min室温离心10 min, 70%乙醇洗涤1次, 室温干燥10 min, 加入0.1× TE溶解。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)测定DNA浓度后稀释至10 ng/µL, 4℃保存备用。

线粒体COI引物参照Prasanna等^[23]报道的通用引物(COI-F: 5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'; COI-R: 5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3')。PCR反应总体积体系为25 μL, 其中包含自制PCR buffer mix 18 μL (包括50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.10% Triton X-100、1.5 mmol/ L MgCl₂、0.10% NP-40、0.01%明胶、200 μmol/L 4种d NTP), 浓度10 μmol/ L的上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.2 μL (Fermentas, 5 U/L), 模板DNA 2 μL, 去离子灭菌水补至总体积25 μL。反应程序为95℃预变性3 min; 35个循环包括95℃ 15 s, 57.7℃ 30 s, 72℃ 30 s; 最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 送至北京诺赛基因公司进行测序。

将测序得到的序列文件用DNASTAR. Lasergene 7.1中的EditSeq模块转换成fasta格式用于后续分析。采用ClustalX 1.83对COI基因序列进行多重比对, 获得对齐后的同源序列, 采用NCBI网站提供的Bankit提交到GenBank数据库中。利用DNAsp 5.10.01计算多态位点数(S)、单倍型数(H)、单倍型多样性(H_d)、核苷酸多样性(P_i)、平均核苷酸差异数(K)。使用MEGA7.0计算所得单倍型的碱基组成、单倍型间的转换/颠换R值; 从NCBI GenBank数据库中下载7条已发表的三块鱼COI序列, 包括来自俄罗斯萨哈林和哈巴罗夫斯克的珠星三块鱼北方型(isolate 4F & 5F, EU392225.1 & EU392226.1)、俄罗斯滨海区的珠星三块鱼南方型(isolate Vkk, EU392224.1)、俄罗斯萨哈林的萨哈林三块鱼(EU392231.1 & EU392 232.1)、俄罗斯滨海区的三块鱼(EU392229.1)和鄂霍次克海的T. nakamurai (EU392230.1)^[24-25]。将这些发表序列与本研究得到的序列合并后采用邻接法(neighbor-joining)构建基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter, K2P)的单倍型进化树, 并经1000次自展检验(bootstrap), 选用草鱼(Cteno pharyngodon idellus) COI基因相应片段(GenBank登录号: NC_010288.1)作为系统进化分析的外类群; 使用MEGA7.0计算基于K2P模型下各个类群内部的遗传距离及各类群间的平均遗传距离。

序列经比对处理后得到COI有效序列长度为637 bp。53条有效序列共检测到8种单倍型(图 2), 单倍型序列编辑后提交到GenBank数据库中(GenBank登录号: MF450497~MF450504)。其中三块鱼有4种单倍型(Hap1~Hap4), 珠星三块鱼有3种单倍型(Hap5~Hap7), 疑似杂交种有3种单倍型(Hap2、Hap3和Hap5), 日本珠星三块鱼独享1种单倍型(Hap8)(表 1)。单倍型碱基组成分析显示, A、T、C、G 4种碱基所占比例比较恒定, 平均含量分别为25.5%、28.2%、27.6%和18.8%, A+T含量(53.7%)明显高于C+G含量(46.4%)。平均碱基交换/颠换R值为16。遗传多样性参数分析表明, 三块鱼的遗传多样性高于珠星三块鱼(表 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 COI基因在三块鱼不同群体中的8种单倍型 Fig.2 Eight haplotypes of COI gene found in different populations of Tribolodon

表 1(Tab.1)

表 1 COI基因的8种单倍型在三块鱼不同群体中的分布 Tab.1 Distribution of eight haplotypes of COI gene in different populations of Tribolodon 单倍型 haplotype 三块鱼 Tribolodon brandtii 珠星三块鱼 Tribolodon hakonensis 疑似杂交种 suspected hybrid 日本珠星 三块鱼 Tribolodon hakonensis Hap1 6 Hap2 12 1 Hap3 2 1 Hap4 1 Hap5 17 8 Hap6 1 Hap7 1 Hap8 3 总个体数 total number 21 19 10 3

表 1 COI基因的8种单倍型在三块鱼不同群体中的分布 Tab.1 Distribution of eight haplotypes of COI gene in different populations of Tribolodon

表 2(Tab.2)

表 2 珠星三块鱼和三块鱼群体的遗传多样性参数 Tab.2 Genetic parameters in populations of Tribolodon hakonensis and Tribolodon brandtii 物种species 样本数N 多态性位点S 单倍型数目H 单倍型多样性Hd 核苷酸多样性Pi 平均核苷酸差异数K 三块鱼 Tribolodon brandtii 21 3 4 0.595 0.00107 0.684 珠星三块鱼 Tribolodon hakonensis 19 3 3 0.205 0.00005 0.316

表 2 珠星三块鱼和三块鱼群体的遗传多样性参数 Tab.2 Genetic parameters in populations of Tribolodon hakonensis and Tribolodon brandtii

分别计算了8种单倍型间的序列分歧度(表 3)。结果显示, 三块鱼4种单倍型间(Hap1~Hap4)的分歧度只有0.001~0.002, 珠星三块鱼的3种单倍型间(Hap5~Hap7)的分歧度也只有0.001~0.002, 而两种三块鱼间的分歧度则达到0.035~0.038;珠星三块鱼和日本珠星三块鱼的分歧度为0.013~ 0.014, 三块鱼和日本珠星三块鱼的分歧最大, 为0.040~0.043。从单倍型间的分歧可以看出, 中国绥芬河珠星三块鱼和日本珠星三块鱼亲缘关系较近, 次之为三块鱼和珠星三块鱼, 再者为三块鱼和日本珠星三块鱼。

表 3(Tab.3)

表 3 8个单倍型间的序列分歧 Tab.3 The sequence divergence between eight haplotypes Hap1 Hap3 Hap4 Hap2 Hap8 Hap7 Hap5 Hap6 Hap1 0.002 0.002 0.001 0.017 0.015 0.015 0.015 Hap3 0.002 0.002 0.001 0.017 0.016 0.016 0.015 Hap4 0.002 0.002 0.001 0.018 0.016 0.016 0.015 Hap2 0.001 0.001 0.001 0.017 0.015 0.015 0.015 Hap8 0.040 0.043 0.043 0.042 0.007 0.007 0.006 Hap7 0.036 0.038 0.038 0.037 0.014 0.002 0.002 Hap5 0.036 0.038 0.038 0.037 0.014 0.002 0.001 Hap6 0.035 0.037 0.037 0.036 0.013 0.003 0.001 注:对角线下方是序列间的分歧度, 对角线上方是1000次bootstrap得到的相应的标准误差。 Notes: The sequence divergence between haplotypes is below the diagonal; the corresponding standard error obtained by the 1000 bootstrap is above the diagonal.

表 3 8个单倍型间的序列分歧 Tab.3 The sequence divergence between eight haplotypes

将本研究得到的8种单倍型与国外发表的三块鱼属鱼类的单倍型序列合并^[24], 重新构建了三块鱼属鱼类的系统进化关系图(图 3)。由图 3可以看出, 绥芬河珠星三块鱼(Hap5~Hap7)与珠星三块鱼南方型(EU392224)聚在一起, 日本珠星三块鱼(Hap8)与珠星三块鱼北方型(EU392225, EU39 2226)聚在一起; 绥芬河三块鱼(Hap1~Hap4)则与三块鱼(EU392229)聚为一支; 另外两种三块鱼分别单独聚类。根据聚类结果得知, 中国绥芬河的珠星三块鱼实为珠星三块鱼南方型, 三块鱼与早期的分类结果一致。将珠星三块鱼南方型、珠星三块鱼北方型与三块鱼划分为3个类群, 各个类群内和类群间的平均K2P遗传距离如表 4所示。

图 1(Fig. 1)

图 3 三块鱼属鱼类COI基因单倍型的系统发育进化NJ树 节点上数字显示1000次重复的bootstrap验证结果, 标尺代表序列分歧度. Fig.3 Neighbour-joining tree of COI gene in genus Tribolodon Bootstrap values in 1000 replications are shown on branches; the scale bar represents the sequence divergence.

表 4(Tab.4)

表 4 三块鱼各类群间和各类群内平均遗传距离 Tab.4 Mean genetic distance between and within each groups in Tribolodon 类群 group 类群间平均遗传距离 mean distance between groups 类群内平均遗传距离 mean distance within group 珠星三块鱼南方型 southern form of T. hakonensis 珠星三块鱼北方型 northern form of T. hakonensis 珠星三块鱼南方型 southern form of T. hakonensis 0.002 珠星三块鱼北方型 northern form of T. hakonensis 0.023 0.005 三块鱼T. brandtii 0.06 0.067 0.002

表 4 三块鱼各类群间和各类群内平均遗传距离 Tab.4 Mean genetic distance between and within each groups in Tribolodon

早期国内外学者对三块鱼的属名和分类一直存有争议。依据外部形态特征, 有些学者将其划分为雅罗鱼属(Leuciscus), 有些学者则划分为三块鱼属(Tribolodon)^[25], 而中国学者陈宜瑜等^[26]将鳞片是否具有放射肋、口位及侧线鳞数作为雅罗鱼属和三块鱼属的鉴别特征, 重新将三块鱼划分为三块鱼属。随着现代分子生物学的发展, 国内外学者分别采用RAPD、mtDNA和基因标记分析了三块鱼和瓦氏雅罗鱼的系统发育关系, 认为二者存在非常明显的遗传分化, 证实将二者划分为不同属是合理的^{[1, 10, 27]}。

三块鱼是鲤科鱼类仅有的存在不同生态类型群体的物种, 如T. sachalinensis和T. nakamurai为淡水种, 珠星三块鱼北方型为洄游种, 三块鱼和珠星三块鱼南方型为溯河产卵型种群^[12-15]。因此, 开展其物种起源、进化及与相近物种亲缘关系的研究吸引了国内外学者的关注。但是中国三块鱼的分布范围窄, 仅在产卵期才形成规模, 这在一定程度上限制了对此物种长期系统的研究, 尤其在种属划分上游与下游产地(如俄罗斯和日本)缺乏比较, 导致种属划分不清, 命名混乱。相较而言, 国外学者系统地从形态学、同工酶和遗传学进行了研究, 对三块鱼的种属划分还是比较清楚的。前已述及, 只有分布在俄罗斯滨海区的珠星三块鱼南方型和三块鱼为溯河产卵型群体。而据文献报道, 中国绥芬河的三块鱼是由日本海大彼得湾经俄罗斯滨海区溯河到中国河区产卵的^[2]。因此可以推测, 溯河到中国绥芬河产卵的三块鱼应为珠星三块鱼南方型和三块鱼。

进一步与国外发表的三块鱼序列比较发现, 珠星三块鱼与日本珠星三块鱼又划分为两个不同的分支, 绥芬河珠星三块鱼与珠星三块鱼南方型聚在一起, 日本珠星三块鱼与珠星三块鱼北方型聚在一起(图 3), 这与它们的地理分布也是吻合的。因此, 本研究进一步从分子角度证实了中国绥芬河珠星三块鱼实为珠星三块鱼南方型。COI基因作为物种鉴定的有效基因, 主要基于该基因在种间的遗传变异显著大于种内的遗传变异^[19]。不同生物类群该基因的保守性存在很大差异, 物种分化阈值的界定由生物类群自身的特性决定^[20]。但大量研究表明, 大部分物种内COI基因的序列分歧介于1%~2%^[20]。由表 4可以看出, 珠星三块鱼南方型和北方型种内遗传距离均小于1%, 而类群间遗传距离大于2%, 表明这两个类群已出现明显分化, 不能视为同一个种, 结合国外学者在形态、核型和细胞学结构差异的研究结果, 将珠星三块鱼南方型和北方型划分为两个有效种或亚种是合理的。

珠星三块鱼在俄罗斯和日本分布十分广泛, 而且生态类型丰富多样, 有淡水种群、溯河产卵型种群和酸性种群^{[15, 28]}。Semina等^[18]曾利用mtDNA的4个基因片段检测发现来自库页岛鄂霍次克海岸的珠星三块鱼和来自日本海海岸的珠星三块鱼存在显著的遗传分化, 推测分布在南方一带的珠星三块鱼是一个隐秘种; 随后, Brykov等^[29]分析俄罗斯境内的珠星三块鱼发现, 该物种由于地理隔离存在3个不同的线粒体谱系A、B、C, 其中谱系A和B分布在北方区, 谱系C分布在俄罗斯滨海区。近期, Polyakova等^[24]研究发现, 珠星三块鱼南方型在生长激素基因位点为杂合型, 推测可能是珠星三块鱼北方型和三块鱼历史上的杂交种。鱼类线粒体DNA是母性遗传, 根据Brykov等^[29]和本文的研究结果可以看出, 珠星三块鱼南方型具有自己独特的线粒体谱系, 与三块鱼和珠星三块鱼北方型有明显的分化, 因此并不支持珠星三块鱼南方型可能是珠星三块鱼北方型和三块鱼的杂交种的观点。

已有报道显示, 三块鱼之间极易发生杂交, 包括自然杂交和人工杂交^[30]。中国绥芬河是三块鱼溯河产卵的重要场所。虽然早期认为有三批产卵群体出现, 但是根据国外对三块鱼属鱼类的分类和分布情况来看, 洄游到中国的只有珠星三块鱼南方型和三块鱼。然而, 在实际采样过程中发现, 有些洄游个体的表型特征不明显, 难以判别, 暂且将其归为疑似杂交种。根据本研究mtDNA的分析结果, 有8个疑似杂交种与珠星三块鱼南方型的主效单倍型一致(Hap5, 表 1), 有2个个体与三块鱼的单倍型一致(Hap2, Hap3), 表明正反杂交产生的可能性都有。为弥补mtDNA是母系遗传的不足, 作者随后采用5个微卫星标记研究发现, 10个疑似杂交种中有2个个体确实是杂交产生(与三块鱼单倍型Hap2和南方型珠星三块鱼Hap5一致的2个个体) (待发表), 为三块鱼杂交种的产生提供了有力的分子证据。

人工增殖放流是增加和保护水生生物野生种群资源量的有效措施。中国从2006年颁布《中国水生生物资源养护行动纲要》以来, 大力开展水生生物增殖放流行动, 产生了良好的生态、经济和社会效益。但增殖放流行动大多是由基层部门完成, 缺乏系统性地科学指导, 放流活动的盲目性及科学评估工作的严重缺位, 致使水域生态环境破坏、土著种濒危、种质混杂等问题日趋严重。例如, 云南大头鲤(Cyprinus (C.) Pellegrini)与外来鲤的渐渗杂交已在星云湖野生种群中广泛发生, 能够采集到的“大头鲤”形态介于土著大头鲤和普通鲤之间, 不合理的增殖放流正是导致其灭绝的重要因素之一^[31]。三块鱼属的鱼类在形态方面非常相近, 且洄游至绥芬河产卵的三块鱼不同群体在洄游时间和场所存在交集, 因此在人工繁殖过程中易发生形态判别错误造成种质混杂。本研究已经发现表型判定错误个体及杂交种的产生, 这对三块鱼属鱼类野生种质资源造成了严重污染。建议有关部门暂缓三块鱼增殖放流活动, 科学评估增殖放流带来的种质混杂及杂交种污染程度, 以保证该物种合理永续的利用。