白鲑属鱼类(Coregonus)隶属于鲑科(Sal mo nidae)、白鲑亚科(Coregoninae), 世界上约有30余种, 广泛分布于北半球寒冷地区的淡水水域, 绝大多数集中于俄罗斯, 少数分布于加拿大和美国等国家^[1]。中国黑龙江也有分布, 如乌苏里白鲑(Coregonus ussuriensis)和卡达白鲑(C. chadary)^[2]。该属鱼类性情温和, 均以浮游动物或底栖动物为食, 具有适应能力强、生长速度快、生长期长等养殖特性, 非常适宜大水面的增养殖。正是因为这种生物学特性, 我国从1998年开始, 大规模从俄罗斯引进白鲑属鱼类, 目前引进的种类有高白鲑(C. peled)、贝加尔凹目白鲑(C. migratorius)、宽鼻白鲑(C. nasus)、湖白鲑(C. artedii)和图冈白鲑(C. tugun)等^[3]。

白鲑鱼类具有很强的生态适应性, 一旦移植到新环境, 能够改变其形态、生活史、遗传结构等达到对新环境的适应^{[1, 4]}。据报道, 移植2年后的湖白鲑的生命周期及生长速度远高于其原种, 且形体和大小相关参数发生显著性变化^[4]; 移植92年的欧白鲑(C. albula)在10个同工酶多态位点中有8个位点与原种存在显著差异^[5]。此外, 很多研究发现白鲑鱼类易杂交, 同水域不宜引进多种白鲑, 以免造成种质混杂^[6-7]。相较而言, 我国对土著种乌苏里白鲑在群体结构、生物学特性、生化和遗传等方面都开展了比较系统的研究^[8-12], 而对引进种白鲑的相关研究则很少, 目前仅对部分引进种的形态及线粒体DNA (mtDNA)部分区域的序列进行了分析和比较^[13-14]。

赛里木湖作为我国最大的白鲑属鱼类增养殖水体, 已先后从俄罗斯国家渔业中心引进了高白鲑、贝加尔凹目白鲑和宽鼻白鲑。虽然近期开展了3种白鲑的多变量形态分析^[14], 但对其适应新生态环境后的种源特性和遗传多样性未进行系统研究。mtDNA具有无重组、进化速率快、不同区域进化速度存在差异等特点, 是进化和群体学研究常用的分子标记^[15]; 其母系遗传特性更能指明物种的杂交方向, 也是杂种起源研究的重要技术手段^[16]。鉴于移植白鲑鱼类在形态、生态、遗传结构的可塑性, 本研究选用保守性更强的COI基因对来自于赛里木湖3种白鲑进行种质鉴定和遗传多样性分析, 以期为赛里木湖渔业的健康、持久发展提供科学指导。

3种白鲑鳍条样品均采自新疆赛里木湖, 由新疆赛湖渔业科技开发有限公司提供。贝加尔凹目白鲑16尾, 宽鼻白鲑30尾, 高白鲑29尾。所有样本鳍条于95%乙醇中保存备用。

剪取少量95%乙醇保存的鳍条, 滤纸吸干乙醇, 放入2 mL离心管中加入600 μL DNA提取裂解液(成分: 1 mol/L Tris pH 8.0、5 mol/L NaCl、0.5 mol/L EDTA pH 8.0、10% SDS和200 μg/mL Protein K)于55℃过夜消化; 次日加入等体积的酚/氯仿混合液(1 : 1)抽提1次, 12000 rpm室温离心10 min, 吸取上清(约550 mL)加入1 mL无水乙醇沉淀, 12000 rpm室温离心10 min, 70%酒精洗涤1次, 室温干燥10 min, 加入0.1 × TE溶解。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)测定DNA浓度后稀释至10 ng/µL, 4℃保存备用。

线粒体COI引物参照Prasanna等^[17]报道的通用引物(COI-F: 5′-TCAACCAACCACAAAGAC ATTGGCAC-3′; COI-R: 5′-TAGACTTCTGGGTG GCCAAAGAATCA-3′)。PCR反应总体积体系为25 μL, 其中包含自制PCR buffer mix 18 μL (50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.10% Triton X-100、1.5 mmol/L MgCl₂、0.10% NP-40、0.01% gelatin和200 μmol/L dNTP mix), 浓度10 μmol/L的上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.2 μL (Fermentas, 5 U/μL), 模板DNA 2 μL, 去离子灭菌水补至总体积25 μL。反应程序为95℃预变性3 min; 35个循环包括95℃15 s, 57.7℃ 30 s, 72℃ 30 s; 最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 送至北京诺赛基因公司进行双向测序。

将测序得到的序列文件用DNASTAR Lasergene 7.1中的EditSeq模块转换成fasta格式, 采用ClustalX 1.83对COI基因序列进行多重比对, 获得对齐后的同源序列, 采用NCBI网站提供的Bankit提交到GenBank数据库中。利用DNAsp 5.10.01计算多态位点数(S)、单倍型数(H)、单倍型多样性(H_d)、核苷酸多样性(P_i)、平均核苷酸差异数(K); 使用MEGA7.0计算所得单倍型的碱基组成、单倍型间的转换/颠换R值及序列分歧度; 于2018年1月25日从GenBank数据库中下载已发表的高白鲑(HQ960660~HQ960663, JX960896)、宽鼻白鲑(KT630722、KT630724、KU867881、KU867882、EU523973、EU523976、EU523979、JQ390058、JX960893)、贝加尔凹目白鲑(JX960891)及其近缘种秋白鲑(C. autumnalis) (KX958407、KX958408、EU523946~EU523951、EU202649)的COI序列共计24条, 与本研究测得的序列进行同源比对后, 利用MEGA7.0采用基于Kimura双参数模型(Kimura's 2-parameter, K2P)的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育进化树, 并经1000次自展(bootstrap)检验, 选用虹鳟(Oncor hynchus mykiss) COI基因片段(GenBank登录号: LC050735)作为系统进化分析的外类群。基于K2P模型估算各类群内及各类群间的平均遗传距离。

序列经比对处理后得到COI有效序列长度为631 bp。75条有效序列共检测到15种单倍型(图 1), 单倍型序列编辑后提交到GenBank数据库中(GenBank登录号: MF632312~MF632325)。其中贝加尔凹目白鲑独享5种单倍型(Hap1~Hap5), 高白鲑有5种单倍型(Hap11~Hap15), 宽鼻白鲑共有7种单倍型(Hap6~Hap10、Hap13、Hap15), 宽鼻白鲑和高白鲑共享2种单倍型(表 1)。单倍型碱基组成分析显示, A、T、C、G 4种碱基所占比例比较恒定, 平均含量分别为21.2%、29.4%、30.1%和19.3%, A+T含量(50.6%)略高于C+G含量(49.4%)。平均碱基交换/颠换R值为7.03。遗传多样性参数分析表明, 宽鼻白鲑的遗传多样性高于贝加尔凹目白鲑, 高白鲑最低(表 2)。

图 1(Fig. 1)

图 1 COI基因在3种白鲑中的15个单倍型的序列信息 Fig.1 Sequences of 15 haplotypes of COI gene found in three whitefish species

表 1(Tab.1)

表 1 COI基因的15种单倍型在3种白鲑群体中的分布 Tab.1 Distribution of 15 haplotypes of COI gene in three Coregonus species 单倍型 haplotype 贝加尔凹目白鲑 C. migratorius 高体白鲑 C. peled 宽鼻白鲑 C. nasus H1 1 H2 1 H3 1 H4 10 H5 3 H6 1 H7 2 H8 2 H9 7 H10 10 H11 7 H12 3 H13 4 3 H14 1 H15 14 5 总个体数 total number 16 29 30

表 1 COI基因的15种单倍型在3种白鲑群体中的分布 Tab.1 Distribution of 15 haplotypes of COI gene in three Coregonus species

表 2(Tab.2)

表 2 3种白鲑的遗传多样性参数 Tab.2 Genetic parameters of three Coregonus species 物种 species 样本数N 多态性位点S 单倍型数目H 单倍型多样性Hd 核苷酸多样性Pi 平均核苷酸差异数K 贝加尔凹目白鲑 C. migratorius 16 5 5 0.600 0.00211 1.333 高白鲑C. peled 29 3 5 0.680 0.00155 0.976 宽鼻白鲑C. nasus 30 16 7 0.826 0.0089 5.359

表 2 3种白鲑的遗传多样性参数 Tab.2 Genetic parameters of three Coregonus species

以Kimura双参数为模型计算了3种白鲑15种单倍型间的序列分歧度(表 3)。从单倍型在不同群体的分布来看:贝加尔凹目白鲑独享5种单倍型Hap1~Hap5, 其序列分歧度为0.002~0.008;宽鼻白鲑共有7种单倍型, 除与高白鲑共享的2种外, 其独享5种单倍型Hap6~Hap10的序列分歧度也只有0.002~0.011;高白鲑5种单倍型Hap11~ Hap15的序列分歧度为0.002~0.005。按单倍型顺序可以将Hap1~Hap5、Hap6~Hap10和Hap11~Hap15分为3组。从表 3可以看出, 组间分歧度有所增加, 其中组1 (Hap1~Hap5)和组2 (Hap6~ Hap10)的分歧度为0.006~0.018, 其次为组2 (Hap6~ Hap10)和组3 (Hap11~Hap15), 0.014~ 0.019, 最高的是组1和组3, 其分歧度为0.0014~ 0.026。即, 贝加尔凹目白鲑和宽鼻白鲑亲缘关系最近, 其次为宽鼻白鲑和高白鲑, 而贝加尔凹目白鲑和高白鲑亲缘关系最远。

表 3(Tab.3)

表 3 15种单倍型间的序列分歧度 Tab.3 Sequence divergences between 15 haplotypes Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap6 Hap7 Hap8 Hap9 Hap10 Hap11 Hap12 Hap13 Hap14 Hap15 Hap1 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 Hap2 0.002 0.001 0.003 0.003 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 Hap3 0.003 0.002 0.002 0.003 0.004 0.004 0.005 0.004 0.004 0.006 0.005 0.006 0.006 0.006 Hap4 0.006 0.005 0.003 0.002 0.004 0.003 0.004 0.004 0.003 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap5 0.008 0.006 0.005 0.002 0.003 0.003 0.004 0.003 0.003 0.005 0.004 0.005 0.005 0.005 Hap6 0.016 0.014 0.013 0.010 0.008 0.002 0.004 0.004 0.003 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap7 0.014 0.013 0.011 0.008 0.006 0.002 0.004 0.003 0.003 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap8 0.018 0.016 0.014 0.011 0.010 0.011 0.010 0.002 0.002 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap9 0.016 0.014 0.013 0.010 0.008 0.010 0.008 0.002 0.002 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap10 0.014 0.013 0.011 0.008 0.006 0.008 0.006 0.003 0.002 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 Hap11 0.024 0.023 0.021 0.018 0.016 0.018 0.016 0.016 0.014 0.016 0.003 0.002 0.003 0.002 Hap12 0.023 0.021 0.019 0.016 0.014 0.016 0.014 0.018 0.016 0.014 0.005 0.002 0.002 0.002 Hap13 0.024 0.023 0.021 0.018 0.016 0.018 0.016 0.016 0.014 0.016 0.003 0.002 0.002 0.002 Hap14 0.026 0.024 0.023 0.019 0.018 0.019 0.018 0.018 0.016 0.018 0.005 0.003 0.002 0.002 Hap15 0.026 0.024 0.023 0.019 0.018 0.019 0.018 0.018 0.016 0.018 0.002 0.003 0.002 0.003 注:对角线下方是序列间的分歧度, 对角线上方是1000次bootstrap得到的相应的标准误差. Notes: The sequence divergence between haplotypes is below the diagonal; the corresponding standard error obtained by the 1000 bootstrap is above the diagonal.

表 3 15种单倍型间的序列分歧度 Tab.3 Sequence divergences between 15 haplotypes

将GenBank数据库中下载的3种白鲑及秋白鲑的COI基因序列与本研究单倍型数据进行同源比对后, 采用MEGA7.0软件中的邻接法构建了系统发育进化树(图 2)。由图 2可以看出, 进化树很明显地划分为4个小分支, 秋白鲑所有发表序列单独聚为一支, 其余3个分支所属白鲑分别由本研究获得的单倍型与其相应的已发表序列组成, 表明本研究获得的3种白鲑的单倍型数据是正确的。各类群内和类群间的平均K2P遗传距离如表 4所示。由表 4可以看出, 贝加尔凹目白鲑和宽鼻白鲑的遗传距离最近, 次之为宽鼻白鲑和高白鲑, 而贝加尔凹目白鲑和高白鲑遗传距离最远。该结果与基于单倍型序列分歧度分析的结果是一致的。

图 1(Fig. 1)

图 2 白鲑鱼类的系统发育进化NJ树 节点上数字显示1000次重复的bootstrap验证结果, 标尺代表序列分歧度. Fig.2 Neighbor-joining tree of Coregonus species Bootstrap values in 1000 replications are shown on branches; the scale bar represents the sequence divergence.

表 4(Tab.4)

表 4 白鲑各类群间和各类群内平均遗传距离 Tab.4 The mean genetic distance between groups and within each group in Coregonus species 类群 group 类群间平均遗传距离 mean distance between groups 类群内平均遗传距离 mean distance within group 贝加尔凹 目白鲑 C. migratorius 秋白鲑 C. autumnalis 高白鲑 C. peled 贝加尔凹目白鲑 C. migratorius 0.004 秋白鲑 C. autumnalis 0.027 0.000 高白鲑 C. peled 0.023 0.02 0.003 宽鼻白鲑 C. nasus 0.014 0.022 0.019 0.004

表 4 白鲑各类群间和各类群内平均遗传距离 Tab.4 The mean genetic distance between groups and within each group in Coregonus species

目前有40种鲑科鱼类发表了线粒体全基因组序列, 系统发育研究发现白鲑亚科最早分化, 是鲑科鱼类进化的鼻祖^[18]。因此, 白鲑鱼类在形态、生态、基因等方面存在较大的遗传分歧, 这些差异可能导致白鲑属鱼类种间界限不清晰, 种内结构复杂^[1]。如真白鲑(C. lavaretus)复合体, 大部分研究发现同水域种群或类型存在显著的形态差异, 但却具有相似的mtDNA谱系, 因而在系统进化和分类上存有很大争议^[19-20]; 相反地, 一些土著西伯利亚白鲑则形态相似而mtDNA起源不同, 具有不同的系统类群^[19]。如贝加尔凹目白鲑和秋白鲑的分类学地位, 早期有些学者根据栖息生境和形态特征的相似性, 将凹目白鲑视为秋白鲑的亚种(C. autumnalis migratorius)^[21]; 但是, 随着分子标记的发展, 众多证据表明贝加尔凹目白鲑与秋白鲑的亲缘关系较远。Politov等^[22]利用15个同工酶的38个编码区分析发现, 二者在等位基因组成和频率存在显著不同, 认为贝加尔凹目白鲑应从秋白鲑中单独划分出来; 随后, Sukhanova等^[23-24]借助于线粒体Cyt b、D-loop及rDNA ITS1分子标记技术构建的分子系统进化树发现, 贝加尔凹目白鲑其实属于许多真白鲑复合体的一员, 支持其为一个独立种。我国学者通过比较赛里木湖贝加尔凹目白鲑和GenBank上该物种已发表的Cyt b基因序列发现二者完全相同, 表明我国引进的确为贝加尔凹目白鲑^[13]。COI基因是物种鉴定的有效基因, 主要基于该基因在种间的遗传变异显著大于种内的遗传变异^[25]。大量研究表明, 利用COI基因鉴定, 种内遗传距离不超过2%^[25-26]。由表 4可以看出, 各类群内的遗传距离均小于1%, 而贝加尔凹目白鲑和秋白鲑的遗传距离为0.027, 从本研究白鲑鱼类的系统进化树(图 2)也可以看出, 贝加尔凹目白鲑与秋白鲑分别单独聚类, 支持二者为两个独立种, 这与前人的研究结果是一致的。

据报道, 栖息在大型湖泊中的白鲑是源于其产地较远的后代, 这种移植会加剧其生态-形态类型的转变, 并且分化成适于当地的新形式。因此, 同水域或相邻水域不同类型的白鲑呈现出生殖隔离的程度也不同^[1]。例如, 在贝加尔湖发现贝加尔凹目白鲑和高白鲑存在杂交, 而在其他湖泊未发现^{[1, 7]}; 在芬兰和奥地利的一些高山湖泊也发现高白鲑、波罗的海白鲑(C. sp.)和真白鲑存在广泛的杂交和回交^{[6, 27]}。从本研究的系统聚类图可以看出, 移植到赛里木湖的高白鲑和贝加尔凹目白鲑未发生杂交, 和产地原种相比, mtDNA遗传组成亦未发生显著变化, 依然保持着原种良好的种源特性(图 2)。然而, 从3种白鲑的单倍型分布来看(表 1), 宽鼻白鲑与高白鲑共享2种单倍型, 其共享单倍型属于高白鲑特有单倍型(图 2), 表明二者可能存在不同程度的基因交流, 高白鲑可能将其基因通过杂交渐渗到宽鼻白鲑群体内。当然, 这还需要其他方面的证据证实, 如核基因。建议湖区今后应提高不同种的表型鉴定准确率, 或者辅以基因检测, 避免繁殖期人工杂交的发生, 以保持不同种的种源特性。

引进种很容易由于引进数量少而发生奠基者效应造成种质衰退。如大鳞鲃(Barbus capito), 引进数量不足百尾, 最后用于生产的个体只有十几尾, 累代繁殖导致的种质衰退现象十分明显:体色分化、生长缓慢、病害频发^[28]。赛里木湖作为白鲑商品鱼最大的养殖基地, 为避免种质衰退, 采取了积极地保种措施, 如每隔3~4年引进新的发眼卵, 同时每年保持繁殖群体数量2000尾以上。从本研究的数据也可以看出, 高白鲑和贝加尔凹目白鲑的遗传多样性适中, 但由于宽鼻白鲑群体存在杂交的可能性, 因而其遗传多样性高于前两种。建议赛里木湖渔业生产部门继续在繁殖、捕鱼等生产方式上进行科学规划, 同时引进先进的种质检测技术, 维持和提高白鲑属鱼类的遗传多样性, 保证湖区特色渔业的可持续发展。