现今地球上估计有1500多万物种, 但已知的生物只有174万种, 其中动物有110多万种。而传统的物种鉴定主要通过形态学、解剖学和生理学等方法, 但由于表型可塑性和遗传变异性, 常导致传统分类无法准确鉴定^[1]。2003年, 加拿大生物学家Paul Herbert首次提出了以基因序列作为鉴别不同物种的“条形码”, 即DNA条形码^[2-4]。DNA条形码一经提出, 得到了许多学者的肯定, 并在很多物种中得到应用, 在物种鉴定、发现隐存种等方面为传统分类方法提供了科学的辅助数据。细胞色素C氧化酶I (cytochrome coxidase subunit I, CO I)基因, 作为重要的线粒体基因, 具有母系遗传、进化速度快、核苷酸替代率高等特点, 在物种鉴定、种群遗传以及系统发育等研究领域得到广泛应用。作为DNA条形码的发展之初, Herbert等^[8]分析了除刺细胞门外, 11个门13320个物种的COI基因序列, 发现其序列间的差异可以很好的区分开所有研究的物种; 而且在物种系统发育过程中, 它的变异速度刚好能使种内差异小于种间差异^[9-11], 因此在对大多数物种的研究中采用COI作为DNA条形码的首选基因^[12]。

软体动物门是动物界里仅次于节肢动物门的第二大门类, 据不完全统计, 迄今已记载现生贝类超过十万种, 化石种类约3.5万种^[13]。收集、保存贝类的实物和信息资源, 是人类认识贝类、合理保护和开发贝类资源的重要基础。软体动物按其体制是否对称, 贝壳、鳃、外套膜和神经等特征的异同进行分类, 但软体动物种类丰富, 许多种形态相似, 且环境对其形态影响较大(表型可塑性), 建立并保存不会随环境的变化而变化的DNA条形码信息对研究其分类地位和系统发育具有重要科学意义。

为进一步丰富COI在贝类分类及鉴定中的科学数据, 本研究通过PCR扩增获得了所收集的353个体贝类(隶属3个纲, 13个目, 33个科, 60个种)的COI基因的部分序列, 分析了其系统发育关系, 以验证COI基因在揭示贝类系统进化关系与传统分类关系的一致性, 同时对同一物种的不同地理群体进行了聚类分析, 为贝类DNA条码数据库的建设提供参考数据。

实验贝类主要采自于中国沿海, 均通过形态特征进行鉴定, 共426个个体, 属于13个目33个科60个物种。样品采集后, 剪取DNA提取组织并置于酒精中, 与标本材料低温运回实验室, –80℃保存备用。具体物种信息及采样地点如表 1所示。

表 1(Tab.1)

表 1 用于分析COI序列的物种及其采样地点 Tab.1 Information on classification and collection of species used for COI sequences analysis 目order 科family 物种名species 采集地点location 原始腹足目 Archaeogastropoda 马蹄螺科 Trochidae 锈凹螺 Chlorostoma rustica 青岛Qingdao 单齿螺 Monodonta labio 青岛Qingdao 鲍科 Haliotidae 皱纹盘鲍 Haliotis discus hannai 海口Haikou 蝾螺科 Turbinidae 朝鲜花冠小月螺 Lunella coronata coreensis 青岛Qingdao 粒花冠小月螺 Lunella coronata granulata 青岛Qingdao 中腹足目 Mesogastropoda 凤凰螺科 Strombidae 篱凤螺 Conomurex luhuanus 海口Haikou 瓶螺科 Aillpullaridae 大瓶螺 Pomacea canaliculata 青岛Qingdao 田螺科 Viviparidae 坚环棱螺 Bellamya lapillorum 蓬莱Penglai 蛙螺科 Bursidae 棘蛙螺 Bufonaria echinata 厦门Xiamen 玉螺科 Naticidae 斑玉螺 Natica maculosa 厦门Xiamen 锥螺科 Turritellidae 强肋锥螺 Turritella fortilirata sowerby 荣成Rongcheng 新腹足目 Neogastropoda 骨螺科 Muricidae 黄口荔枝螺 Thais luteostoma 青岛Qingdao 脉红螺 Rapana venosa 青岛Qingdao 浅缝骨螺 Murex trapa 厦门Xiamen 梨形红螺 Rapana rapiformis 上海Shanghai 织纹螺科 Nassariidae 纵肋织纹螺 Nassarius variciferus 蓬莱Penglai 蛾螺科 Buccinidae 皮氏蛾螺 Buccinium perryi 青岛Qingdao 甲虫螺 Cantharus cecillei 青岛Qingdao 褐管蛾螺 Siphonalia spadicea 宁波Ningbo 略胀管蛾螺 Siphonalia subdilatata 烟台Yantai 方斑东风螺 Babylonia areolata 海口Haikou、厦门Xiamen、上海Shanghai 后鳃目Opisthobranchia 阿地螺科 Atyidae 泥螺 Bullacta exarata 宁波Ningbo 蚌目Unionoida 蚌科 Unionidae 背角无齿蚌 Sinanodonta woodiana 蓬莱Penglai 蚶目 Arcoida 蚶科 Arcidae 毛蚶 Scapharca kagoshimensis 连云港Lianyungang、烟台Yantai、威海Weihai、大连Dalian 魁蚶 Scapharca broughtoni 青岛Qingdao、统营Tongying、荣成Rongcheng、蓬莱Penglai、长岛Changdao 青蚶 Barbatia obliquata 宁波Ningbo、厦门Xiamen、上海Shanghai、长沙Changsha 贻贝目 Mytioida 江珧科 Pinnidae 栉江珧 Atrina pectinata 蓬莱Penglai、青岛Qingdao 贻贝科 Mytilidae 紫贻贝 Mytilus galloprovincialis 青岛Qingdao、上海Shanghai 沼蛤 Limnoperna fortunei 蓬莱Penglai 厚壳贻贝 Mytilus coruscus 宁波Ningbo、厦门Xiamen、上海Shanghai 翡翠贻贝 Mytilus coruscus 青岛Qingdao 海螂目 Myoida 海螂目 Myidae 砂海螂 Mya arenaria 烟台Yantai、上海Shanghai 海笋科 Pholadidae 东方海笋 Monothyra orientalis 长沙Changsha 篮蛤科 Corbulidae 焦河蓝蛤 Potamocorbula ustulata 宁波Ningbo 潜泥蛤科 Hiatellidae 太平洋潜泥蛤 Panopea abrupta 青岛Qingdao 笋螂目Pholadomyoida 鸭嘴蛤科 Laternulidae 鸭嘴蛤 Laternula anatina 宁波Ningbo 帘蛤目 Veneroida 蛤蜊科 Mactridae 中国蛤蜊 Mactra chinensis 青岛Qingdao 四角蛤蜊 Mactra veneriformis 宁波Ningbo 截蛏科 Solecurtidae 缢蛏 Sinonovacula constricta 青岛Qingdao、海口Haikou、上海Shanghai 帘蛤科 Veneridae 短文蛤 Meretrix petechialis 连云港Lianyungang、宁波Ningbo 薪蛤 Mercenaria mercenaria 连云港Lianyungang 等边浅蛤 Macridiscus multifarius 青岛Qingdao 日本镜蛤 Phacosoma japonicum 蓬莱Penglai 薪蛤 Mercenaria mercenaria 东营Dongying 伊萨伯雪蛤 Clausinella isabellina 温州Wenzhou 青蛤 Cyclina sinensis 宁波Ningbo、青岛Qingdao、长沙Changsha、上海Shanghai 波纹巴非蛤 Paphia undulata 厦门Xiamen 日本镜蛤 Phacosoma japonicum 烟台Yantai 琴文蛤 Meretrix lyrata 海南Hainan 文蛤 Meretrix meretrix 上海Shanghai 紫石房蛤 Saxidomus purpurata 上海Shanghai 鸟蛤科 Cardiidae 加州扁鸟蛤 Clinocardium californiense 荣成Rongcheng 蚬科 Corbiculidae 河蚬 Corbicula fluminea 上海Shanghai 樱蛤科 Tellinidae 彩虹明樱蛤 Moerella iridescens 舟山Zhoushan、上海Shanghai 竹蛏科 Solenidae 长竹蛏 Solen strictus 宁波Ningbo 大竹蛏 Solen grandis 长沙Changsha、上海Shanghai 紫云蛤科 Psammbiidae 缘雪蛤 Sanguinolaria virescens 海口Haikou 珍珠贝目 Pterioida 扇贝科 Pectinidae 栉孔扇贝 Chlamys farreri 青岛Qingdao 虾夷扇贝 Patinopecten yessoensis 大连Dalian 牡蛎目Osteroida 牡蛎科 Ostreidae 长牡蛎 Crassostrea gigas 青岛Qingdao 八腕目Octopoda 蛸科 Octopodidae 短蛸 Octopus ocellatus 青岛Qingdao 长蛸 Octopus variabilis 青岛Qingdao

表 1 用于分析COI序列的物种及其采样地点 Tab.1 Information on classification and collection of species used for COI sequences analysis

DNA提取参照有机溶剂抽提法(苯酚氯仿法)^[14-15]方法稍作修改。具体是在1.5 mL灭菌离心管中加入400 μL TE抽提液, 无菌解剖刀取50~ 100 mg组织, 装入离心管中并将其剪碎; 每管加入40 μL 10% SDS, 10 μL 20 mg/mL蛋白酶K终浓度400 μg/mL, 充分混匀, 放入55~65℃恒温水浴锅中温浴3 h, 消化至溶液澄清；每管加300 μL 6 mol/L NaCl后, 在旋涡混匀器上快速离心混匀30 s, 12000 rpm离心20 min, 移取上清到另一离心管中；每管加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 缓慢颠倒混匀约8 min, 12000 rpm离心10 min, 将上清液移至另一离心管中, 重复抽提一次；每管加1/10体积的3 mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇, 混匀后置于–20℃中沉淀1 h, 12000 rpm离心15 min后弃上清；加入700 μL 70%乙醇, 缓慢颠倒30 min, 离心10 min, 洗两次；倒掉乙醇后, 在超净台上吹干, 然后加入灭菌水溶解沉淀。利用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性, NANO DROP 1000分光光度计检测其浓度和纯度。用三蒸水将DNA浓度稀释至50 μg/μL, 置于–20℃保存备用。

PCR扩增在Eppendorf仪器上进行。所用的通用COI-F和COI-R引物^[16-17]分别为引物L1490: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG, 以及H2198: TAAACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA；PCR反应体系为25 μL, 包括ddH₂O 16.8 μL, COI-F 1 μL, COI-R 1 μL, 模板1 μL, Taq Enzyme 0.2 μL, dNTP 2.5 μL, buffer 2.5 μL。反应程序为: 94℃预变性5 min；95℃变性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物送至上海生工有限公司进行测序, 序列拼接后, NCBI人工比对, 验证测序准确性。将每个物种随机选取一条序列, 通过MEGA 6.0截取了275 bp的同源序列, 采用基于距离的矩阵法构建了NJ进化树。为研究不同地理群体的遗传差异, 对不同地理群体的序列截取其同源序列并构建了NJ进化树。

本研究共利用COI通用引物L1490和F2198扩增60个物种426个个体, 共获得了353条序列, 有效扩增效率为82.7%。其中帘蛤目、蚶目、海螂目和贻贝目各物种的扩增效率较高, 达到90%以上；原始腹足目扩增效率较低, 仅有50%；在珍珠贝目中基本无法扩增获得片段, 只有10%。总体上, COI通用引物的扩增效率较高, 能够适用于多数贝类种类的扩增。

如图 1所示, 由进化树可以看出利用COI基因序列进行的聚类关系基本与传统的分类一致。首先, 除沼蛤、大竹蛏(Solen grandis)、长竹蛏(Solen strictus)、魁蚶、缢蛏(Sinonovacula constricta)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和太平洋潜泥蛤外, 双壳纲各物种聚为一支；其次, 腹足纲下的新腹足目、中腹足目和原始腹足目被分裂开, 存在交叉现象, 未能明显区分各目间遗传距离差异, 整个纲聚为两个分支, 而且八腕目与蛾螺科的褐管蛾螺、略胀管蛾螺聚为一支；除大竹蛏、长竹蛏和缢蛏外, 其他帘蛤目的物种聚为一支；最为特别的是太平洋潜泥蛤, 其传统个体分类为双壳纲海螂目的一种, 但其与中腹足目的斑玉螺聚为一支。

图 1(Fig. 1)

图 1 基于60种贝类COI序列构建的进化树 Fig.1 The phylogenetic tree of COI sequences from 60 species in molluscs

选取了不同地理群体的7种贝类, 通过聚类关系研究了其进化关系。物种名称和采集地点如表 2所示。通过MEGA 6.0构建了NJ进化树, 图 2~图 8分别为方斑东风螺(Babylonia areolata)、魁蚶、毛蚶(Scapharca kagoshimensis)、青蚶(Barbatia obliquata)、厚壳贻贝(Mytilus coruscus)、缢蛏、青蛤(Cyclina sinensis)不同地理群体聚类图。方斑东风螺全部个体主要聚为两个分支, 上海群体单独聚为一支, 厦门和海口群体整体聚为一支, 其内存在群体交叉现象；魁蚶蓬莱和荣成群体聚为一支, 其中5号蓬莱个体和5号荣成个体聚为一支, 其他蓬莱和荣成个体聚类, 统营、长岛和胶南群体聚为一支, 除2号统营个体外, 其余群体聚在一起；毛蚶大连群体单独聚为一支, 连云港、烟台和威海群体聚为一支, 除4号烟台个体外, 首先连云港群体聚为一支, 再与烟台群体聚在一起, 最后与威海群体聚在一起；青蚶上海和厦门群体聚为两支, 宁波群体的个体分别与上海和厦门群体聚在一起, 最后和长沙群体相聚；厚壳贻贝厦门群体单独聚为一支, 上海群体先聚为一支, 再与宁波群体聚在一起；缢蛏青岛和上海群体分别聚为两支, 海口群体的2号个体与上海群体聚为一支, 3号个体与青岛群体聚为一支。青蛤宁波群体聚为一支, 再与上海群体相聚, 最后与青岛群体相聚。所有这些结果表明, COI基因基本能对同一物种不同地理群体进行聚类。

表 2(Tab.2)

表 2 用于分析不同地理群体遗传距离的物种名和采集地点 Tab.2 Species used to analyze genetic distance of different geographical populations and its extracted. 物种名species 采集地点location 方斑东风螺Babylonia areolata 海口Haikou、厦门Xiamen、上海Shanghai 毛蚶Scapharca kagoshimensis 连云港Lianyungang、烟台Yantai、威海Weihai、大连Dalian 魁蚶Scapharca broughtoni 青岛Qingdao、统营Tongying、长岛Changdao、荣成Rongcheng、蓬莱Penglai 青蚶Barbatia obliquata 宁波Ningbo、厦门Xiamen、上海Shanghai、长沙Changsha 厚壳贻贝Mytilus coruscus 宁波Ningbo、厦门Xiamen、上海Shanghai 缢蛏Sinonovacula constricta 青岛Qingdao、海口Haikou、上海Shanghai 青蛤Cyclina sinensis 宁波Ningbo、青岛Qingdao、上海Shanghai

表 2 用于分析不同地理群体遗传距离的物种名和采集地点 Tab.2 Species used to analyze genetic distance of different geographical populations and its extracted.

图 1(Fig. 1)

图 2 方斑东风螺不同地理群体构建的进化树 1、2、3和4表示不同地理群体中个体的编号. Fig.2 The phylogenetic tree of Babylonia areolata from different geographical populations 1, 2, 3 and 4 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 3 魁蚶不同地理群体构建的进化树 1、2、3、4和5表示不同地理群体中个体的编号. Fig.3 The phylogenetic tree of Scapharca broughtoni from different geographical populations 1, 2, 3, 4 and 5 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 4 毛蚶不同地理群体构建的进化树 1、2、3和4表示不同地理群体中个体的编号. Fig.4 The phylogenetic tree of Scapharca kagoshimensis from different geographical populations. 1, 2, 3 and 4 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 5 青蚶不同地理群体构建的进化树 1、2、3、4和5表示不同地理群体中个体的编号. Fig.5 The phylogenetic tree of Barbatia obliquata from different geographical populations. 1, 2, 3, 4 and 5 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 6 厚壳贻贝不同地理群体构建的进化树 1、2、3、4和5表示不同地理群体中个体的编号. Fig.6 The phylogenetic tree of Mytilus coruscus from different geographical populations 1, 2, 3, 4 and 5 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 7 缢蛏不同地理群体构建的进化树 1、2、3、4和5表示不同地理群体中个体的编号. Fig.7 The phylogenetic tree of Sinonovacula constricta from different geographical populations 1, 2, 3, 4 and 5 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

图 1(Fig. 1)

图 8 青蛤不同地理群体构建的进化树 1、2、3和4表示不同地理群体中个体的编号. Fig.8 The phylogenetic tree of Cyclina sinensis from different geographical populations 1, 2, 3 and 4 indicate the numbers of individuals in different geographical groups.

遗传多样性(genetic diversity)是生物所携带的遗传信息的总和, 是生态多样性和物种多样性的基础, 而物种多样性也就显示了基因遗传的多样性, 基因遗传多样性代表生物种群之内和种群之间的遗传结构的变异^[18-19]。DNA碱基序列分析可以准确的检测出遗传结构的变异(碱基互换、插入和缺失等)信息, 可以准确地揭示种群间的进化关系, 更准确地鉴别不同个体^[20-21]。DNA条形码就是使用一段短DNA标准序列来实现物种鉴别的, 线粒体基因因为没有内含子, 不会发生等位基因重组现象, 其遗传信息完全来自母本, 因此比核基因更具优势, 所以对动物而言, 一般采用线粒体细胞色素C氧化酶I作为DNA条形码标准基因。据已有的报道, COI基因序列对龙虾属^[22]和文蛤属^[24]等的分类鉴定具有一定的可行性。

由于贝类鉴别难度大, 而且贝类幼体较小, 发育过程中存在变态现象, 更难用传统方法鉴定其物种信息, 而条形码DNA序列分析能更好地解决这个问题。通过对上述60个物种的COI基因序列的总结研究, 发现COI基因对贝类通用性较好, 扩增效率高, 方便各种贝类COI基因序列的获得, 这为贝类物种的鉴定提供了先提条件；其次进化树中大多数物种聚类关系与传统分类一致, 虽然腹足纲同目之间未能明显聚类, 但这可能是由于整个研究物种跨度较大, 导致截取的同源片段较少, 从而导致其中包含的遗传信息有限, 不足以区分所有的物种, 或由于地理环境的不同, 导致同一物种在表观形态上有一定的差异, 使原始分类鉴定时不够准确, 太平洋潜泥蛤未能明显聚类, 原因还需要进一步研究。由不同地理群体聚类分析, 同一地理群体基本能够聚在一起, 之后再与其他群体聚类, 这可能由于长期的地理隔离, 缺少基因交流, 从而产生了一定的基因差异。但有的地理群体间存在群体交叉现象, 此现象的原因可能为受到人为因素的干扰或距离较近未存在明显的遗传分化, 如进口外来苗种培育时产生的幼苗逃逸而产生外来物种的污染, 或在自然海区中存在基因交流。本研究推测魁蚶的胶南和统营群体存在交叉互换, 可能由于该地魁蚶育种时所选的种贝同为韩国进口品种, 而毛蚶的烟台威海群体存在群体交叉就可能由于两地距离较近未产生明显分化。上述情况出现的原因还需要进一步探究, 虽然COI基因在鉴别同一物种不同地理群体间有一定的作用, 但尚不能作为鉴别不同地理群体的依据。

对于COI基因的探索和分析已经有了很多的报道, 如孟学平等^[25]发现COI基因可以鉴定福建西施舌, 但不能鉴定其余群体；张迪等^[26]发现COI基因适于银鱼科鱼类物种鉴别和系统发育研究。但物种鉴定中的很多方面还处于初级阶段, 仍有许多后续深入研究等待开展。一个基因序列没有变化在分类鉴别上是没有意义的, 而快速变异的基因序列虽然在鉴定近源物种具有一定的优势, 但其由于碱基的突变导致不能区分远源物种, COI序列片段包含一定的变异速度相对较快的系统发育信息, 因而可以用以探讨属级以下的系统发育关系, 对低阶元的系统发育研究具有重要意义。一个位点有4种碱基组成, 只需要14 bp的序列就可以产生2.68亿种组合方式, 虽然有些位点因为物种进化选择压力将会保持稳定, 但适当延长DNA片段长度便足以鉴别大多数物种。本研究需要进一步的总结分析, 发现其中的规律和特殊性, 为以后鉴别动物物种的种类和系统发育规律提供一定的依据, 从而探索更多的隐存种, 了解更多的遗传多样性。