长蛸(Octopus minor)属于八腕目(Octopoda), 蛸科(Octopodidae), 蛸属, 分布于渤海、黄海、东海、南海和日本列岛水域, 肉质鲜嫩, 蛋白质丰富且营养均衡^[1], 是中国沿海重要的经济蛸类^[2]。在运输过程中, 长蛸在狭小空间里会强烈挣扎, 导致体表破损、自残(断腕)和喷墨, 死亡率较高。在实验操作中长蛸剧烈挣扎甚至喷墨, 导致实验无法顺利进行。同时, 欧盟要求在科学研究过程中需要考虑头足类的动物福利, 规定所有适用于脊椎动物的手术和实验操作也同样适用于头足类, 尽量减少疼痛和持久伤害^[3-5]。根据这一规定, 头足类的实验操作应在麻醉和镇痛下进行, 当必须杀死实验样本时, 需要尽可能降低死亡过程的痛苦程度。因此, 筛选头足类适宜的麻醉剂, 并探明相应的麻醉复苏过程对于头足类的产业发展和科学研究具有重要意义。

在已有头足类麻醉剂研究中, 7.5%六水氯化镁溶液能够有效麻醉乌贼(Sepia officinalis)、福氏枪乌贼(Loligo forbesii)、锥异尾枪乌贼(Alloteuthis subulata)、真蛸(Octopus vulgaris)和尖盘爱尔斗蛸(Eledone cirrhosa)^[6]。乙二醇苯醚麻醉爱尔斗蛸(Eledone moschata)的有效浓度为1.2 mL/L、1.4 mL/L和1.6 mL/L^[7]。1%~3%乙醇作为乌贼手术时的麻醉剂^[8], 1.5%乙醇可以有效麻醉真蛸^[9]。在使用氯化镁、苯佐卡因、乙醇和丁香油麻醉皮氏枪乌贼(Doryteuthis pealeii)时, 乙醇和氯化镁具有麻醉作用^[10]。丁香油浓度为200 mg/L时适宜作为长蛸的麻醉剂^[11]。使用乙二醇苯醚、MS-222、氯化镁、乙醇和丁香油麻醉乌贼时, 氯化镁、乙醇和丁香油能够麻醉乌贼, 氯化镁溶液麻醉乌贼的适宜浓度为27 g/L^[12]。使用乙醇、氯化镁、硫酸镁、氯仿和水合氯醛麻醉拟乌贼(Sepiotethis sepioidea)时, 1%~3%乙醇、1.5%~2%氯化镁和3%~4%硫酸镁具有麻醉效果^[13]。氨基甲酸乙酯曾在真蛸和乌贼中用作麻醉剂^[14-15], 但由于氨基甲酸乙酯属于致癌物质, 不再使用其作为麻醉剂^{[4, 16-17]}。目前在头足类麻醉和复苏过程中对行为的描述^{[12, 18-19]}相对较少, 且关于长蛸麻醉的研究较少。

综上所述, 本研究在参考前人研究工作的基础上, 挑选12种具有潜在麻醉作用的化学试剂对长蛸进行麻醉实验, 旨在筛选出适宜的长蛸麻醉试剂, 掌握长蛸麻醉和复苏的方法, 为实验操作和生产运输提供参考依据。

长蛸来自于威海裕隆水产开发有限公司, 体质量范围为138~151 g。

经过砂滤的天然海水, 盐度为28~30, 水温为(18±0.3) ℃, pH为8.0~8.2, DO > 6 mg/L。

实验的麻醉剂有氯化锰、硫酸镁、乙二醇苯醚、乙醇、薄荷醇、利多卡因、氯化镁、MS-222、丁香酚、三氯叔丁醇、盐酸普鲁卡因和苯佐卡因。由于将长蛸放入带有麻醉剂的水体中及实验捞取、转移等操作, 会引起应激反应, 导致长蛸出现剧烈挣扎、四处游动、向水体外爬、喷墨等现象, 干扰实验准确性, 本研究采用向带有长蛸的水体中加入麻醉剂的方法开展实验。

分析天平、塑料箱(47 cm×34 cm×32 cm)、电子温度计、1000 mL烧杯、增氧泵、电子秤。

无水氯化镁易溶于水, 溶解过程中放出大量热, 用海水配制质量浓度为320 g/L的氯化镁溶液作为母液。MS-222、乙醇、氯化锰、盐酸普鲁卡因、硫酸镁和乙二醇苯醚易溶于水, 称取药品于烧杯中, 用海水溶解后按比例加入实验水体。丁香酚、利多卡因、苯佐卡因、三氯叔丁醇和薄荷醇微溶于水, 丁香酚使用时以1:5的比例溶于无水乙醇; 利多卡因和苯佐卡因使用时以1:4的比例溶于无水乙醇; 三氯叔丁醇10 g和薄荷醇晶体0.5 g分别溶解于100 mL无水乙醇中配制成母液。每种麻醉剂用于麻醉效果测定的浓度水平如表 1所示。

表 1(Tab.1)

表 1 麻醉剂用于麻醉效果测定的浓度水平 Tab.1 Levels of anesthetic concentration for the anesthesia effect test 麻醉剂anesthetic 浓度concentration 硫酸镁/(g/L) magnesium sulphate 5 10 25 30 40 50 丁香酚/(μL/L) eugenol 1 3 10 20 30 40 乙二醇苯醚/(mL/L) ethelene glycol monophenyl ether 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 氯化镁/(g/L) magnesium chloride 2 6 10 20 30 35 乙醇/(mL/L) ethanol 2 6 10 25 35 40 薄荷醇/(g/L) L-menthol 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 氯化锰/(g/L) manganese(Ⅱ) chloride 2 3 4 6 8 10 利多卡因/(mL/L) lidocaine 1 2 4 6 8 10 苯佐卡因/(g/L) benzocaine 0.01 0.04 0.08 0.1 0.3 0.5 盐酸普鲁卡因/(g/L) procaine hydrochloride 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 三氯叔丁醇/(g/L) 2-trichloromethyl-2-propanol 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 MS-222/(mL/L) 5 15 25 50 100 500

表 1 麻醉剂用于麻醉效果测定的浓度水平 Tab.1 Levels of anesthetic concentration for the anesthesia effect test

实验前选择体表无损伤、有活力的健康长蛸, 停食24 h。每个浓度实验设置3个平行组, 每组长蛸3只, 实验水体20 L。塑料箱中加正常海水, 放入长蛸稳定10 min, 观察长蛸的活动状态。对长蛸活动稳定的组进行实验, 将配置好的麻醉剂按比例加入实验水体, 发现长蛸完全麻醉后, 立即将其转移到正常海水中进行复苏。记录在此过程中出现的各种行为特征及时间点。

根据麻醉效果实验结果, 设计4 mL/L、6 mL/L、8 mL/L、10 mL/L、15 mL/L、25 mL/L、35 mL/L、40 mL/L 8个乙醇浓度梯度和4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、15 g/L、25 g/L、30 g/L、40 g/L 8个氯化镁溶液梯度, 每个浓度长蛸1只, 平行重复3次以上, 进行观察记录。

依据麻醉分期结果, 设计4 mL/L、6 mL/L、8 mL/L、10 mL/L、15 mL/L、20 mL/L、25 mL/L、35 mL/L、40 mL/L 9个乙醇浓度梯度和3 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L 9个氯化镁溶液梯度, 每个浓度长蛸1只, 平行重复3次以上, 测定24 h内长蛸达到的最终麻醉程度。

根据麻醉与复苏分期结果, 设计4 mL/L、6 mL/L、8 mL/L、10 mL/L、25 mL/L、35 mL/L、40 mL/L 7个乙醇浓度梯度和3 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、35 g/L 7个氯化镁溶液梯度, 每个浓度长蛸1只, 平行重复3次以上, 分别测定长蛸达到最终麻醉和转入正常海水到复苏的时间。

实验结果(表 2)表明, 硫酸镁、丁香酚、MS-222、氯化锰、利多卡因、盐酸普鲁卡因、乙二醇苯醚、薄荷醇、苯佐卡因和三氯叔丁醇溶液在实验浓度下对长蛸无麻醉作用, 稍高浓度中长蛸出现高盐胁迫反应或中毒现象。长蛸在6~40 mL/L浓度乙醇和6~35 g/L浓度氯化镁溶液中出现麻醉现象。

表 2(Tab.2)

表 2 12种麻醉剂对长蛸麻醉效果 Tab.2 The anesthesia effect of 12 anesthetics on Octopus minor 麻醉剂anesthetic 麻醉效果anesthesia effect 硫酸镁 magnesium sulphate 6个浓度下未麻醉, 40 g/L和50 g/L浓度时体表失水出现褶皱. No anesthesia was observed under six concentrations, and the body surface of specimens wrinkled at 40 g/L and 50 g/L due to dehydration. 丁香酚 eugenol 6个浓度下未麻醉, 40 μL/L浓度时出现全身僵直和喷墨现象. No anesthesia was observed under six concentrations, and specimens stiffened and ink-jet appeared at 40 g/L. 乙二醇苯醚 ethelene glycol monophenyl ether 6个浓度下未麻醉, 0.2 mL/L浓度出现抽搐, 0.3 mL/L浓度出现喷墨, 0.4 mL/L、0.5 mL/L和0.6 mL/L浓度出现全身僵直和喷墨现象. No anesthesia was observed under six concentrations, and convulsions occurred at 0.2 mL/L, ink-jet appeared at 0.3 mL/L, stiffness and ink-jet appeared at 0.4 mL/L, 0.5 mL/L and 0.6 mL /L. 氯化镁 magnesium chloride 2 g/L浓度无麻醉现象, 6–35 g/L浓度出现体色逐渐变白、呼吸频率逐渐降低、活动逐渐减少和对外界刺激的反应逐渐丧失等麻醉现象. No anesthesia was detected at 2 g/L. Anesthesia characteristics such as gradual whitening of body color, decrease of respiratory rate, reduced activity and loss of response to external stimuli were observed at 6–35 g/L. 乙醇 ethanol 2 mL/L浓度无麻醉现象, 6 mL/L浓度以上出现麻醉现象, 40 mL/L浓度剧烈挣扎后麻醉. No anesthesia was detected at 2 mL/L, and anesthesia occurred above 6 mL/L, anesthesia was detected at 40 mL/L after intense struggle. 薄荷醇 L-menthol 6个浓度下未麻醉, 0.05 g/L和0.06 g/L浓度出现全身僵直和喷墨现象. No anesthesia was observed under six concentrations, specimens stiffened and ink-jet appeared at 0.05 g/L and 0.06 g/L. 氯化锰 manganese(Ⅱ) chloride 6个浓度下未麻醉, 3 g/L浓度出现剧烈挣扎现象, 8 g/L和10 g/L体表失水出现褶皱. No anesthesia was observed under six concentrations, violent struggle occurred at 3 g/L, and body surface wrinkled at 8 g/L and 10 g/L due to dehydration. 利多卡因 lidocaine 6个浓度下未麻醉, 10 mg/L浓度出现眼睛下陷, 紧闭漏斗现象. No anesthesia was observed under six concentrations, the eyes were sunken and the funnel was closed at 10 mg/L. 苯佐卡因 benzocaine 6个浓度下未麻醉, 0.1 g/L浓度出现眼睛下陷, 紧闭漏斗现象, 0.5 g/L出现全身僵直和喷墨现象. No anesthesia was observed under six concentrations, the eyes sank and the funnel was closed at 0.1 g/L, and stiffness and ink-jet appeared at 0.5 g/L. 盐酸普鲁卡因 procaine hydrochloride 6个浓度下未麻醉, 0.5 g/L和0.6 g/L浓度出现眼睛下陷, 紧闭漏斗现象. No anesthesia was observed under six concentrations, the eyes sank and the funnel was closed at 0.5 g/L and 0.6 g/L. 三氯叔丁醇 2-trichloromethyl- 2-propanol 6个浓度下未麻醉, 0.3 g/L浓度出现眼睛下陷, 0.5 g/L和0.6 g/L浓度出现剧烈挣扎现象. No anesthesia was observed under six concentrations, the eyes sank at 0.3 g/L and violent struggle was observed at 0.5 g/L and 0.6 g/L. MS-222 6个浓度下未麻醉, 50 mg/L、100 mg/L和500 mg/L浓度出现抽搐和喷墨现象. No anesthesia was observed under six concentrations, convulsions and ink-jet appeared at 50 mg/L, 100 mg/L and 500 mg/L.

表 2 12种麻醉剂对长蛸麻醉效果 Tab.2 The anesthesia effect of 12 anesthetics on Octopus minor

根据长蛸的体表颜色变化, 根据游泳活力强弱、呼吸频率变化、腕部活动能力强弱、吸盘吸力强弱、腕部对玻璃棒刺激的反应和将头部翻转眼睛向下是否能够恢复正常这6个指标, 将其区分为5个麻醉时期(表 3)和4个复苏时期(表 4)。

表 3(Tab.3)

表 3 长蛸麻醉程度分期及行为特征 Tab.3 Stages and behavior characteristics of Octopus minor under anesthesia 麻醉程度分期 stage of anesthesia 行为特征behavior characteristic 体色 body color 呼吸频率/ (次/min) respiratory rate 游动活力 swimming activity 腕部活动 wrist activity 吸盘吸力 sucker suction 腕部对刺激反应 wrist response to stimuli 将头部翻转眼部向下后反应 turn the whole body upside down 正常 normal 浅棕色 light brown 18–22 游动自如 swimming freely 频繁 frequent 强 strong 敏感 sensitive 迅速恢复 recover quickly 第1期 stage1 浅棕色 light brown 14–17 不游动 no swimming 减弱 reduced 强 strong 敏感 sensitive 迅速恢复 recover quickly 第2期 stage 2 浅棕色变淡 light brown 10–13 不游动 no swimming 无活动 adiaphoria 弱 weak 迟缓 insensitive 挣扎后恢复 recover after struggle 第3期 stage 3 苍白 white 6–9 不游动 no swimming 无活动 adiaphoria 弱 weak 无反应 adiaphoria 挣扎后恢复 recover after struggle 第4期 stage 4 苍白 white 4–6 不游动 no swimming 无活动 adiaphoria 无 no suction 无反应 adiaphoria 不能恢复 irreparability 第5期 stage 5 苍白 white 0 不游动 no swimming 无活动 adiaphoria 无 no suction 无反应 adiaphoria 不能恢复 irreparability

表 3 长蛸麻醉程度分期及行为特征 Tab.3 Stages and behavior characteristics of Octopus minor under anesthesia

表 4(Tab.4)

表 4 长蛸复苏分期及行为特征 Tab.4 Recovery stages and behavior characteristics of Octopus minor 复苏分期 stages of recovery 行为特征behavior characteristic 体色 body color 呼吸频率/ (次/min) respiratory rate 腕部活动 wrist activity 吸盘吸力 sucker suction 腕部对刺激反应 wrist response to stimuli 将头部翻转眼部向下后反应 turn the whole body upside down 第1期 stage1 苍白 white 4–7 无 adiaphoria 无 no suction 无 adiaphoria 无 adiaphoria 第2期 stage 2 苍白 white 8–11 少量 a little 弱 weak 迟缓 insensitive 无 adiaphoria 第3期 stage 3 浅棕色加深 light brown deepening 12–17 增强 enhanced activity 强 strong 敏感 sensitive 挣扎后恢复 recover after struggle 第4期 stage 4 浅棕色 light brown 18–22 频繁 frequent 强 strong 敏感 sensitive 迅速恢复 recover quickly

表 4 长蛸复苏分期及行为特征 Tab.4 Recovery stages and behavior characteristics of Octopus minor

随着乙醇和氯化镁浓度的增加, 长蛸达到的最终麻醉程度增大(图 1, 图 2)。10~40 mL/L乙醇溶液和15~35 g/L氯化镁溶液对长蛸麻醉均能够达到第4期麻醉, 此时期能够有效麻醉长蛸, 进行观察和测量等操作而不伤害长蛸。长蛸在40 mL/L乙醇和35 g/L氯化镁中达到5期麻醉, 表现为呼吸停止, 应及时转移进行复苏否则死亡, 表明过高浓度乙醇和氯化镁导致长蛸死亡。

图 1(Fig. 1)

图 1 长蛸在9种乙醇浓度中达到的最终麻醉程度 Fig.1 Final anesthetic stages of Octopus minor under nine ethanol concentrations

图 1(Fig. 1)

图 2 长蛸在9种氯化镁浓度中达到的最终麻醉程度 Fig.2 Final anesthetic stages of Octopus minor under nine magnesium chloride concentrations

图 3表明, 以4~35 mL/L浓度的乙醇作为长蛸麻醉剂, 随着浓度增加, 麻醉时间从128 min到8 min逐渐缩短, 复苏时间从5 min到26 min逐渐增加。在40 mL/L乙醇中出现剧烈挣扎, 麻醉时间明显增加, 可见乙醇浓度过高容易导致长蛸产生应激反应。图 4表明, 以3~35 g/L的氯化镁溶液作为长蛸麻醉剂, 随着浓度增加, 麻醉时间从176 min到13 min逐渐缩短, 复苏时间从6 min到116 min逐渐增加。

图 1(Fig. 1)

图 3 长蛸在7个乙醇浓度梯度下的麻醉与复苏时间 不同小写字母表示不同乙醇浓度下麻醉时间差异显著(P < 0.05), 不同大写字母表示不同乙醇浓度下复苏时间差异显著(P < 0.05). Fig.3 Anesthesia time and recovery time of Octopus minor under 7 ethanol concentrations Different small letters indicate significant differences on anesthesia time (P < 0.05) and capital letter indicate significant differences on recovery time (P < 0.05).

图 1(Fig. 1)

图 4 长蛸在7个氯化镁浓度梯度下的麻醉和复苏时间 不同小写字母表示不同乙醇浓度下麻醉时间差异显著(P < 0.05), 不同大写字母表示不同乙醇浓度下复苏时间差异显著(P < 0.05). Fig.4 Anesthesia time and recovery time of Octopus minor under 7 magnesium chloride concentrations Different small letters indicate significant differences on anesthesia time (P < 0.05) and capital letter indicate significant differences on recovery time (P < 0.05).

本研究中, 麻醉效果的判定基于长蛸的体色、活动量、呼吸频率和对外界刺激反应变化, 以及麻醉过程中是否产生高盐胁迫或中毒现象。基于上述标准, 发现乙醇和氯化镁对长蛸有麻醉作用, 综合比较长蛸在不同浓度作用下的最终麻醉状态、麻醉及复苏时间, 得出乙醇和氯化镁麻醉的有效浓度为10~40 mL/L和15~35 g/L。已有研究表明, 乙醇和氯化镁能够有效麻醉真蛸^[20]、皮氏枪乌贼^[10]、乌贼^[12]和拟乌贼^[13]。本研究中乙醇和氯化镁能够有效麻醉长蛸, 说明乙醇和氯化镁可作为头足类潜在的通用麻醉剂, 其余10种麻醉剂对其他头足类具有麻醉作用, 因物种、生活方式与实验方法的不同, 有待进一步进行探究。

本研究表明, 10 mL/L的乙醇对长蛸产生快速的麻醉作用, 没有明显的痛苦迹象。结果与乙醇麻醉乌贼、真蛸、皮氏枪乌贼和拟乌贼效果相似, 使用乙醇做麻醉剂无不良反应^{[9-10, 13, 19, 21]}。实验通过麻醉与复苏最短总时间对乙醇和氯化镁的麻醉效果进行比较, 乙醇的最短总时间为26 min (浓度10 mL/L), 氯化镁为40 min (20 g/L), 在麻醉和复苏的效率上, 乙醇好于氯化镁。根据上述结果, 当长蛸的麻醉操作时间短于15 min时, 使用乙醇作为麻醉剂, 而MgCl₂溶液更适合超过15 min的麻醉操作。图 3和图 4结果表明, 在一定浓度范围内, 随着麻醉剂浓度的增加, 长蛸麻醉所需时间不断缩短, 同时复苏时间不断增加, 这与圆斑星鲽(Verasper variegates)^[22]、许氏平鲉(Sebastes schlegeli)^[23]、日本对虾(Penaeus japonicus)^[24]和大口黑鲈(Micropterus salmoides)^[25]等的研究结果一致。

丁香油作为一种麻醉化合物在长乌贼(Sepia elongata)、皮氏枪乌贼和长蛸中已经得到了应用, 麻醉后死亡率极低, 麻醉和复苏时间短^{[10-11, 26]}。然而, 部分学者在丁香油中添加乙醇以促进其在海水中的溶解^{[11, 26]}, 由于乙醇对长蛸具有麻醉作用, 乙醇的添加干扰了对丁香油是否具有麻醉作用的判定。Mooney等^[10]在使用不添加乙醇的丁香油麻醉皮氏枪乌贼时, 出现了喷墨、体色剧烈变化和死亡的现象。Estefanell等^[9]和Escánez等^[20]在使用丁香油麻醉真蛸时, 真蛸未麻醉并出现喷墨等应激反应。本研究中, 长蛸在低浓度丁香酚中无麻醉作用, 在稍高浓度丁香酚中出现全身僵直和喷墨现象, 结论为丁香酚不能作为长蛸的麻醉剂。

Butler-Struben等^[18]和Winlow等^[27]总结了在头足类麻醉研究中常用的麻醉状态判定参考依据, 包括呼吸频率变化、体色变化和对按压刺激有无反应。Andrews等^[4]对头足类麻醉状态判定标准进行了探讨, 包括呼吸频率、体色变淡、腕部活动、吸盘吸力、身体平衡的失去与恢复和对有害刺激的反应。本研究在参考前人工作的基础上, 选择长蛸的体色变化、游泳活力强弱、呼吸频率高低变化、腕部活力大小、吸盘吸力强弱、腕部对玻璃棒刺激的反应和将头部翻转眼睛向下的反应作为长蛸麻醉和复苏程度的判定标准。

长蛸麻醉初期四处爬行和游动, 随后吸附于容器的一处, 腕部活动频繁。用玻璃棒刺激腕部, 腕部反应迅速, 将长蛸头部翻转眼部向下能够迅速恢复至原状态。随着麻醉时间延长, 体色由浅棕色逐渐变白, 呼吸频率逐渐降低, 腕部活动频率由有到无, 腕部对玻璃棒刺激的反应逐渐迟钝直至无反应, 吸盘吸力不断减弱直至无吸力, 长蛸头部翻转眼部向下的反应从迅速恢复到挣扎后恢复到最后不能恢复。复苏时, 外套膜的收缩舒张幅度由大变小, 呼吸频率逐渐变快后稳定, 腕部开始活动并支撑身体平衡, 体色逐渐恢复为浅棕色。

长蛸的最终麻醉状态是确定运输过程适宜麻醉剂量的重要参考标准。在鱼类麻醉研究中, 视觉与触觉丧失, 呼吸频率略减, 并且能够维持自身平衡是适宜运输的最佳状态^[28]。长蛸达到第2期麻醉时, 腕部对外界刺激反应迟缓, 呼吸频率降低, 能够保持身体平衡, 可作为运输的最适麻醉阶段。若麻醉程度达到第4、5期, 长蛸将失去平衡, 沉到容器底部, 易造成个体间的挤压, 增加死亡率。本研究初步测得24 h内长蛸达到的最终麻醉时期:在乙醇浓度为6 mL/L和氯化镁浓度为5 g/L、8 g/L时为2期, 乙醇浓度为8 mL/L和氯化镁浓度为10 g/L时为3期, 可以作为长蛸运输过程中麻醉剂使用的参考标准。

头足类的年龄、性别、生长阶段、体重、生理与健康状况之间的差异对麻醉剂有效性的影响, 以及麻醉剂与环境参数之间的相互作用, 仍有待探索。乙醇产生镇静效果似乎与水温有关:在较低温度下乙醇麻醉枪乌贼(Loligo pealii)的效果会下降^[29], 在19~26 ℃下麻醉乌贼、皮氏枪乌贼、福氏枪乌贼和真蛸的效果稳定^[19]。在整个麻醉过程中, 需要控制溶液的盐度变化, 因为添加MgCl₂会引起盐度改变, 盐度改变可能影响头足类的生理与健康状态, 从而影响麻醉效果。目前头足类已筛选出多种药物或试剂作为麻醉剂(如氯化镁和乙醇), 麻醉剂对头足类的生理影响^{[18, 30-31]}和麻醉作用的机制有待进一步探究。