2021, Vol. 28 
2. 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266235
2. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China
虹鳟(Oncorhynchus mykiss)与硬头鳟(O. mykiss)为同一种的不同生态型[1], 其中虹鳟为陆封型, 硬头鳟为降海洄游性, 两类鱼有许多相似特性, 适合两者生长的水环境温度为10~18 ℃[2]。研究表明, 当水温高于20 ℃, 虹鳟和硬头鳟的生长都会受到限制[3,4], 同时高于鱼类适宜范围的温度还会导致鱼体产生疾病、代谢混乱、氧化危害等[5]。
大量研究表明, 高温致使生物体产生过多活性氧(ROS), 从而对细胞产生毒害作用[6,7,8], 生物体具有一套完整的抗氧化体系, 包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶, 这些抗氧化酶在清除活性氧和防止机体受损伤方面具有重要的作用, 可清除活性氧产生的危害, 维持机体的活性氧处于正常水平[9,10]。已有研究表明, 高温与抗氧化酶活性变化有显著相关性, 在南极鱼(Patagonotothen ramsayi)[8]、金鱼(Carassius auratus L.)[11]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5]、长牡蛎(Crassostrea gigas)[12]等水生动物的研究中发现, 高温显著影响其体内SOD、CAT等抗氧化酶的活性。因此, 抗氧化酶活性变化情况可作为鱼体在高温环境中氧化应激状态的重要指示物。
急性温度胁迫在鱼类养殖过程中经常出现, 因此受到学者的广泛关注及研究。强俊等[13]报道了急性温度应激能够明显改变尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼的抗氧化能力和非特异性免疫。高权新等[14]分析了银鲳(Pampus argenteus)幼鱼急性高温胁迫前后血清离子浓度以及离子酶、代谢酶活性, 表明其正常代谢受到高温应激的显著影响。目前, 关于急性高温对虹鳟的研究已有报道, 但主要集中于规格240 g以上成鱼[15,16], 对虹鳟幼鱼研究较少, 关于硬头鳟的研究鲜有报道。本研究通过检测不同温度梯度下虹鳟和硬头鳟幼鱼心脏、肝脏、鳃、肾脏、肌肉和脑抗氧化酶的分布情况, 分析两类鱼受高温胁迫时抗氧化酶活性的变化差异, 以期为鲑鳟鱼类深远海健康养殖技术提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料及暂养条件实验地点为日照市万泽丰渔业有限公司(山东日照)苗种繁育车间全自动控温循环水实验室。本实验所用虹鳟[体重(22.76±2.89) g]和硬头鳟[体重(23.2±1.22) g]取自日照市万泽丰渔业有限公司, 两类鱼为该公司购自Troutex鲑鳟鱼卵公司(丹麦)的发眼卵孵化并培育而成。实验前虹鳟和硬头鳟分别饲养于圆形玻璃钢养殖淡水池中(直径6 m、深度1.2 m、有效水体体积28.3 m³)。
实验前, 选取健康状况良好、体表无明显外伤且规格相近的虹鳟和硬头鳟分别暂养于方形水族箱(70 cm×50 cm×50 cm), 每个水族箱暂养30条鱼, 水温为16 ℃, 由自动控温系统控制, 误差小于0.5 ℃。暂养期间光暗比为12 h:12 h, 水中溶解氧、温度、pH和盐度分别为(8.2±0.3) mg/L、(16±0.5) ℃、7.1±0.3和0, 使用HB-211ATC手持式盐度计测定盐度, 其他指标由便携式多功能溶解氧测量仪(Yellow Spring Instrument Co., Yellow Spring, Ohio, USA)测定。每天换水一次, 并持续曝气, 保证水体溶解氧含量和氨氮水平在适宜范围内。暂养期间每日于7:00、12:00和17:00投喂至饱食状态, 饲料为鲑鳟鱼配合饲料, 正式实验开始前1天停止投喂。
1.2 实验设计及取样暂养结束后, 随机选取5尾虹鳟和5尾硬头鳟, 使用MS-222将鱼麻醉, 经消毒后进行无菌解剖, 取心脏、肝脏、肾脏、肌肉、鳃和脑放于冻存管, 并于液氮中保存, 而后移至–80 ℃超低温冰箱保存, 用于组织抗氧化酶测定。实验开始后, 将暂养虹鳟随机放置于4个实验温度组, 分别为16 ℃ (R16), 20 ℃ (R20), 22 ℃ (R22)和24 ℃ (R24)。硬头鳟放置于4个实验温度组, 分别为16 ℃ (S16), 19 ℃ (S19), 21 ℃ (S21)和23 ℃ (S23)。虹鳟和硬头鳟每个处理设置3个平行, 每个平行放养30尾鱼, 养殖容器与暂养所用容器相同。
本实验使用自动控温系统对各水族箱升温, 升温速率为1 ℃/h, 直至达到实验目标温度, R16和S16温度保持不变。在达到设置温度的0 h、1 h、6 h、12 h、24 h分别取样, 每个平行取3尾鱼, 并使用麻醉剂MS-222麻醉, 经消毒后取其组织, 保存方法同上。高温胁迫实验之后, 使用该系统以1 ℃/h速率将各组水温降至16 ℃, 并将实验鱼在16 ℃进行恢复培养。在恢复实验的12 h (h12 h)和24 h (h24 h)分别取样, 方法同上。升温和降温速率参考史鲲鹏等[17]在温度胁迫实验改良的方法。
1.3 抗氧化酶活性测定方法在高温应激和恢复实验, 鱼体的心脏、肝脏、肾脏、肌肉、鳃和脑SOD活性均由南京建成总SOD测试盒(A001-3)采用water-soluble tetrazolium salt (WST-1)法测定。CAT、GPx活性均使用南京建成CAT测试盒(A007-2)和GPx测试盒(A005)采用可见光法测定。
1.4 数据统计分析实验数据以平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$)表示, 采用SPSS 19.0 (Chicago, Illinois, USA)中的One-way ANOVA进行单因素方差分析, 使用T检验对不同处理组之间进行差异性检测, P<0.05表示差异显著, 并使用GraphPad Prism 5.0做图。
2 结果与分析 2.1 虹鳟和硬头鳟幼鱼不同组织中抗氧化酶分布情况 2.1.1 虹鳟幼鱼抗氧化酶分布虹鳟幼鱼心脏、肝脏、肾脏、鳃、脑和肌肉中SOD活性见图1A。肝脏和鳃中SOD分布最为丰富, 且显著高于其他各组织(P<0.05); 肾脏和肌肉中分布略低, 心脏和脑中分布水平最低, 且显著低于其他组织(P<0.05)。
虹鳟幼鱼各组织中CAT活性见图1B, 肝脏中CAT分布最丰富, 显著高于其他组织; 肾脏和鳃中活性显著低于肝脏(P<0.05), 显著高于心脏、脑和肌肉(P<0.05); 心脏、脑和肌肉中活性较低, 其中肌肉中含量最低。
虹鳟各组织GPx活性见图1C, 肝脏活性最高, 显著高于其他5个组织(P<0.05); 鳃中活性次之。脑和肌肉中分布最少, 显著低于其他组织(P<0.05)。
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图1 虹鳟幼鱼不同组织中SOD、CAT和GPx活性图中标注不同的字母代表不同组织间抗氧化酶活性差异显著(P<0.05). Fig. 1 The activity of SOD, CAT and GPx in different tissues of juvenile rainbow trout Different letters indicate significant difference (P<0.05) in antioxidant enzyme activities between different tissues. |
硬头鳟幼鱼各组织中SOD活性见图2A。肝脏中SOD活性最高, 鳃中也较高, 但显著低于肝脏(P<0.05); 肌肉和肾脏中SOD活性处于中等水平; 心脏和脑中活性最低, 显著低于其他组织(P<0.05)。
硬头鳟幼鱼6种组织CAT活性见图2B。其中肝脏中活性显著高于其他组织; 肾脏和鳃中活性次之, 且此二者活性并无显著差异(P>0.05); 心脏中CAT活性显著低于肾脏和鳃, 而脑和肌肉显著低于心脏(P<0.05)。
硬头鳟不同组织GPx活性见图2C, 肝脏中活性最高, 显著高于其他各组织(P<0.05); 心脏和鳃中活性较高; 脑和肌肉中活性最低。
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图2 硬头鳟幼鱼不同组织中SOD、CAT和GPx活性图中标注不同的字母代表不同组织间抗氧化酶活性差异显著(P<0.05). Fig. 2 The activity of SOD, CAT and GPx in different tissues of juvenile steelhead trout Different letters indicate significant difference (P<0.05) in antioxidant enzyme activities between different tissues. |
急性高温胁迫对虹鳟幼鱼肝脏SOD活性的影响情况见图3A。R20组SOD活性在应激开始后略高于对照组R16, 而后恢复正常, 整个过程未出现显著的差别(P>0.05)。R22组和R24组SOD活性在高温应激前12 h显著升高(P<0.05), 且R24组水平高于R22组; 24 h时R24组SOD活性降低到显著低于对照组的水平(P<0.05)。恢复阶段R22组逐渐下降, 24 h处于略高于对照组的水平; R24组SOD活性在恢复阶段与对照组差异不显著(P>0.05)。
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图3 急性高温胁迫对虹鳟幼鱼肝脏SOD、CAT和GPx活性的影响图中不同的字母代表同一时间点不同处理组间酶活性差异显著(P<0.05). Fig. 3 The effect of acute heat stress on SOD, CAT and GPx activities in the liver of juvenile rainbow trout Different letters indicate significant difference (P<0.05) in enzyme activities between different treatments at the same time. |
急性高温胁迫下虹鳟幼鱼肝脏CAT活性如图3B所示。整体而言, CAT活性升高幅度低于SOD。R20组在应激前12 h变化不显著, 24 h时显著升高(P<0.05), 且同R22和R24组相比差异不显著(P>0.05)。R24组CAT活性水平整体上高于R22组。恢复阶段R22和R24组仍显著高于对照组(P<0.05)。
急性高温胁迫对虹鳟幼鱼肝脏GPx活性的影响如图3C所示。3个高温处理组(R24、R22和R20组) GPx活性在应激1 h时未出现显著变化, 在6 h均显著升高, 12 h时达到峰值, 而在24 h时出现降低的趋势, R24组降低到同对照组相同的水平, R22和R20组GPx活性仍显著高于对照组。恢复阶段R20和R22组均呈下降趋势, 24 h时恢复至正常水平; R24组依然处于较高水平, 甚至高于应激24 h时。
2.2.2 急性热应激对硬头鳟幼鱼肝脏抗氧化酶的影响如图4A所示, 硬头鳟中S19组SOD活性在应激过程出现上调, 其中24 h时达到最大值, 恢复阶段回落到正常水平。S21组在整个热应激过程均显著高于对照组(P<0.05), 恢复阶段呈下降趋势, 但仍显著高于对照组。S23组在应激12 h时显著高于其他组(P<0.05), 24 h急剧下降至低于对照组水平, 经过24 h恢复也未达到对照组水平。
图4B 为硬头鳟S19组CAT活性变化情况, S19组在整个实验阶段与对照组相比未出现显著差异(P>0.05)。S21组略有升高, 但与对照组差异不显著(P>0.05)。S23组CAT活性在应激6 h至24 h阶段出现显著升高(P<0.05), 之后回落至正常水平。
图4C 为急性高温应激对硬头鳟肝脏GPx活性的影响。各升温组(S19、S21和S23组) GPx活性在应激1 h即出现升高, 6 h至24 h显著高于对照组(P<0.05)。在恢复阶段, S19和S21组恢复较快, 24 h恢复至正常水平; S23组恢复较慢, 始终处于较高水平。
3 讨论不同规格虹鳟和硬头鳟的最大临界温度存在较大差异, 而同规格的两类鱼, 虹鳟高温临界温度却高于硬头鳟[18], 因此对某一规格鱼类进行热应激实验, 应根据其规格所对应的热耐受能力设置暴露温度。根据此原则, 本研究在高温胁迫实验中设置虹鳟温度梯度上限略高于硬头鳟。比较虹鳟和硬头鳟同一种抗氧化酶在不同组织的分布发现, 两类鱼抗氧化酶的组织分布模式极为相似, 推测这可能与两类鱼同属一种有关。本研究发现SOD、CAT和GPx这3种抗氧化酶均在肝脏中活性最高, 这与肝脏的功能密切相关。肝脏是硬骨鱼类机体新陈代谢的主要场所, 从血液中获取原料, 加工后输送回血液[19]。高温胁迫会引起鱼类肝细胞结构变化, 肝脏功能受损, 进而导致机体代谢紊乱并损害健康[20], 因此, 肝脏在鱼体适应高温维持正常代谢过程中尤其重要。
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图4 急性高温胁迫对硬头鳟幼鱼肝脏SOD、CAT和GPx活性的影响图中不同的字母代表同一时间点不同处理组间酶活性差异显著(P<0.05). Fig. 4 The effect of acute heat stress on SOD, CAT and GPx activities in the liver of juvenile steelhead rainbow trout Different letters indacate significant difference (P<0.05) in SOD、CAT and GPx activities between different treatments at the same time. |
本研究结果显示, 16 ℃组虹鳟幼鱼各组织抗氧化酶活性水平普遍高于硬头鳟。抗氧化酶在鱼类抑制和分解自由基以及预防氧化损伤方面发挥着举足轻重的作用[21]。本研究中, 虹鳟比硬头鳟具有更多的抗氧化酶储备, 从一定程度上说明处于正常机体状态的虹鳟具有更强的应对氧化损伤能力, 从而能够更好地应对高温胁迫。Miura等[22]研究表明, 当环境温度在30 min内下降3 ℃, 硬头鳟体温下降速度比虹鳟更快, 这说明硬头鳟对环境温度的感应更加敏感。就最高临界温度而言, 虹鳟高于硬头鳟[18]。
高温胁迫会使鱼类产生氧化应激, 导致氧化损伤。机体的应对措施主要是调节基因表达水平, 调控多种蛋白质的合成。酶是受调控蛋白质之一, 其中SOD、CAT和GPx是机体应对氧化应激的关键抗氧化酶, SOD是三种酶中最初级、最重要的清除剂[9], 其活性的改变对维持氧化剂和抗氧化剂的平衡作用十分重要。本实验结果显示, SOD、CAT和GPx活性在高温应激前期均出现升高的趋势, 具有一致性。王国成[20]报道了相似结果, 温度升高对白梭吻鲈(Sander lucioperca)肝脏抗氧化酶影响显著, 升温初期SOD、CAT和GPx活性均升高。Lushchak等[11,23]发现高温胁迫促进金鱼SOD和CAT基因表达, 进而提高SOD和CAT酶活性。杨健等[24]研究表明军曹鱼(Rachycentron canadum)幼鱼SOD和CAT活性随温度升高而提高。另外, 在其他水生生物也有类似现象, 栉孔扇贝(Chlamys farreri)在经历高温胁迫1 h后, SOD活性显著升高[25], 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)和鸡帘蛤(Chamelea gallina)中也有相似报道[26,27]。以上研究表明, 高温胁迫致使生物体内活性氧增多, 生物体为防止活性氧产生的损害, 其体内抗氧化酶活性升高以清除过多活性氧。
在本研究中, 恢复阶段12 h虹鳟和硬头鳟SOD活性分别在22 ℃和21 ℃高温胁迫组升高, 而CAT和GPx活力相比于SOD上升却略有下降。徐冬冬等[9]报道在褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)高温实验中, 敏感性最高的SOD活性在恢复实验中出现了显著回升, 与本研究不同的是, 胁迫停止后的褐牙鲆CAT活性也出现了回升趋势, 这可能是由于不同鱼类酶的活性存在差异, 但作为对活性氧最敏感的SOD在两类鱼中也出现类似情况。另外, Wang等[28]发现虹鳟经过25 ℃高温胁迫12 h, 之后在适宜水温恢复6 h, 机体呼吸爆发(活性氧快速释放)水平仍处于很高状态。而呼吸爆发是机体炎症的重要体现形式[29]。因此, 虹鳟和硬头鳟在恢复阶段SOD升高, 这可能与机体受到高温胁迫产生的炎症有关。
本研究显示, 20 ℃组和19 ℃组分别对虹鳟和硬头鳟抗氧化酶活性的变化影响有限, 且两类鱼抗氧化酶活性变化趋势基本相同。在虹鳟研究结果中, 24 ℃组SOD活性在应激前12 h大幅升高, 24 h又急剧下降, 恢复实验中没有回升, 而CAT、GPx活力与SOD变化相反, 出现了升高的趋势。硬头鳟在23 ℃组中也出现了与虹鳟24 ℃组相似的结果。24 ℃和23 ℃的高温应激组前期SOD、CAT和GPx活性快速升高与ROS增多, 激活抗氧化免疫系统有关。孟广玮等[12]在高温胁迫对长牡蛎(Crassostrea gigas)免疫指标影响的研究中得出了相似的结果, 高温胁迫12 h后, CAT和SOD活性发生显著上升。然而, 本高温胁迫实验24 h引起虹鳟和硬头鳟SOD活性显著降低。刘石林等[30]在刺参(Apostichopus japonicus)中也发现随着高温胁迫时间的延长, 抗氧化酶的活性降低。另外, 有研究报道, 氧化应激强度过高或持续时间过长, 机体内氧自由基不断累积, 抗氧化酶难以应付细胞内的氧化损伤, 细胞即进入凋亡过程, 抗氧化酶活性随即降低[31]。但本实验中, 胁迫24 h后CAT和GPx却出现了上升趋势, 这可能是CAT和GPx对氧化危害敏感性较低, 其次SOD活性被抑制, CAT和GPx发挥其代偿作用。
虹鳟22 ℃组恢复实验中, SOD和GPx变化趋势相同, 在24 h明显下降。硬头鳟在21 ℃胁迫组恢复实验中, SOD和GPx在24 h也有下降, 但SOD仍然处于很高水平。就三种酶中敏感性最高的SOD而言, 虹鳟22 ℃组恢复程度优于硬头鳟21 ℃组。Keefer等[32]对3985尾硬头鳟研究发现, 当水温达到21 ℃, 超过70%标记鱼类迁移躲避高温, 可见硬头鳟对21 ℃高温有较强反应。本研究结果发现, 22 ℃组虹鳟与21 ℃硬头鳟抗氧化酶波动于恢复阶段12 h之前, 24 h已逐渐呈下降趋势, 这说明鱼体调整自身抗氧化机制产生高温胁迫。由此推测, 随着恢复时间延长, 鱼体抗氧化酶可能会逐渐恢复到对照组水平, 这说明此温度对虹鳟和硬头鳟而言, 是在可耐受范围内, 但是在逐渐适应高温过程中, 22 ℃组虹鳟优于21 ℃硬头鳟, 这说明了前期设置温度梯度可得出虹鳟和硬头鳟耐热性的差距。
4 结论急性高温胁迫实验显示虹鳟和硬头鳟具有极为相似的抗氧化酶分布模式。两类鱼幼鱼肝脏、鳃和肌肉SOD分布较丰富; 肝脏、肾脏和鳃CAT分布较为丰富; 心脏、肝脏、肾脏和鳃GPx分布较多。总体而言, 两类鱼肝脏中抗氧化酶活性最高。
急性高温应激对两类鱼的抗氧化防御系统均产生影响, 引起体内SOD、CAT和GPx抗氧化酶活性升高。虹鳟和硬头鳟分别在20 ℃组和19 ℃组应激较轻微, 虹鳟22 ℃组耐高温能力优于硬头鳟21 ℃组, 但在24 ℃组和23 ℃组引起强烈应激, 24 h时SOD活性大幅降低。
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