2021, Vol. 28 
2. 农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室, 上海 200009;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 200071;
4. 大洋渔业资源可持续开发省部共建教育部重点实验室, 上海 201306
2. Key Laboratory of Oceanic and Polar Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200009, China;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, 266071, China;
4. The Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China
软骨鱼类(Chondrichthytes)已在地球上生存超过4亿年, 是现存最古老的生物类群之一。软骨鱼纲由全头亚纲(Holocephali)和板鳃亚纲(Elasmobranchii)组成[1], 前者为银鲛类, 共49种, 基本上均是深海种, 后者分为鳐总目(共699种)和鲨总目(共503种)[2], 广泛分布在全球各大水域(绝大多数为咸水种，仅约50余种属淡水软骨鱼类)。中国海域分布软骨鱼类共约243种(鲨类148种, 鳐类89种, 银鲛类6种)[3]。软骨鱼类由于生长缓慢、成熟期晚和繁殖力低等生活史特征, 极易被过度捕捞[4,5]。近年来, 对软骨鱼类(尤其是鲨和鳐)资源保护的呼声越发强烈。然而目前国内对软骨鱼类基础生物学研究仍较少, 且主要集中在年龄[6]、生长[7]及生殖生物学[8]方面。对摄食及洄游行为等[9]仍停留在以描述性研究为主, 而此类生活史信息对于掌握鱼类种群结构和数量变动规律至关重要, 且可为资源管理和保护提供科学支撑。
软骨鱼类的脊椎骨主要起支撑鱼体的作用, 由钙化软骨组成, 主要成分为磷酸羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH], 并含有铝(Al)、钡(Ba)、镉(Cd)、铜(Cu)、铁(Fe)、镁(Mg)、锰(Mn)、铅(Pb)、锶(Sr)、锌(Zn)等多种微(痕)量元素[10]。随着鱼类生长, 脊椎骨在垂直向周期性增长一条不透明轮纹和一条半透明轮纹, 刻录了精确的时间序列[11,12], 多用于进行鱼类的年龄鉴定。随着微取样及微化学技术的兴起, 这些沉淀于脊椎骨轮纹上的时间序列信息可用来进一步解释鱼类的摄食及洄游动态。目前，通过脊椎骨微化学信息来探究软骨鱼类生活史过程的研究, 主要集中在应用稳定同位素和微(痕)量元素方面, 其通过分析各生长周期间稳定同位素值和微量元素值的变化规律, 追溯软骨鱼类生活史过程; 通过不同元素的沉积机制及与各环境因子间的关系反映栖息地的变迁。本文在梳理软骨鱼类脊椎骨相关研究的基础上, 整理了其应用于生长、摄食和洄游等方面的研究动态, 以期为今后国内学者开展相关研究工作提供参考。
1 生长 1.1 年龄鉴定Leeuwenhoek[13]最早发现硬组织上的轮纹可用于鱼类的年龄鉴定。硬骨鱼类多选用耳石、鳞片等硬组织鉴定年龄, 软骨鱼类无耳石, 通常基于脊椎骨和部分种类(角鲨和虎鲨类)的鳍棘进行年龄鉴定, 神经弓作为辅助性材料[14], 一般以第一背鳍下方的脊椎骨为最佳[4]。研究发现软骨鱼类脊椎骨上的轮纹沉积一般属年周期性, 分为不透明型和半透明型, 不透明轮纹的沉积与较高的海表温度密切相关, 一般在夏季沉积; 半透明轮纹则在生长较慢时期沉积, 一般在冬季形成[15]。如图1所示, 这些生长区由其光学属性而被命名, 故可以通过观察轮纹结构判断年龄和生长情况[16]。对于半径较大、轮纹清晰的脊椎骨样品可直接采取切片法观察, 切片厚度因物种而异, 一般在0.3~1.0 mm之间[17], 此外还可通过染色以增加轮纹的清晰度, 如硝酸银染色、硝酸钴染色等。胡灯进[18]利用硝酸钴染色法对条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)进行了年龄鉴定, 由此判断闽南近海条纹斑竹鲨种群的年龄结构、生长特性以及全长和体重的相对生长率和生长指标, 并通过Von-Bertalanffy (VB)生长方程描述条纹斑竹鲨的生长特征。Bubley等[11]在尾棘深海鳐(Bathyraja parmifera)的年龄鉴定中使用了改良型苏木素依红染色技术, 大大提高了年龄鉴定的精确度, 并发现脊椎骨比第二背鳍硬棘所读取的年龄精确度更高。舒黎明等[19]对黑梢真鲨(Carcharhinus limbatus)的年龄鉴定过程中发现, 脊椎骨在苯、二甲苯等试剂中反复浸泡也可提高轮纹清晰度。近年来X射线的投射显影技术也逐渐被应用到脊椎骨轮纹读取中[20]。Liu[21]使用硝酸银染色法对大眼长尾鲨(Alopias superciliosus)脊椎骨轮纹进行观察, 发现染色后的脊椎骨边缘轮纹依然不够清晰, 使用X射线技术对年龄重新鉴定解决了这一问题。因此, 在年龄鉴定中可选用多种方法来提高读数准确度。
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图1 脊椎骨模式图[22,23]a. 双斑鳐完整脊椎骨, b. 锤头双髻鲨脊椎骨切片. Fig. 1 Vertebrae pattern diagram[22,23]a. The vertebrae of Raja binoculata; b. The section of the vertebrae of Sphyrna zygaena. |
随着鱼类年龄增长, 脊椎骨半径增大, 靠近外缘的轮纹逐渐密集, 甚至重叠[24]。且不同种类的脊椎骨钙化程度不同, 一些深海种类甚至由于钙化程度太低而难以通过染色技术准确读取年龄信息, 如灰六鳃鲨(Hexanchus griseus)[25]、叶鳞刺鲨(Centrophorus squamosus)[26]等。Hale等[27]利用激光剥蚀–电感耦合等离子质谱法(LA-ICP-MS)测定正刺魟(Urobatis halleri)脊椎骨各轮纹Mg、Sr等多种微量元素含量以及44Ca稳定同位素含量, 并重新估算了正刺魟年龄, 发现通过脊椎骨人工读数为5龄以下的样品与校正年龄较为吻合, 但读数超过11龄的样品则出现较大差异, 这与高龄鱼脊椎骨新增轮纹紧凑, 读数难度较大有关; Harry[28]通过四环素类药物化学标记鱼体和放射性碳同位素验证了共计188尾软骨鱼脊椎骨年龄信息, 其中共有53尾个体年龄被低估, 年龄的低估范围在5~34龄之间，平均低估18龄，其中被低估的部分主要出现在高龄鱼新增轮纹上, 这与脊椎骨外缘轮纹密集有关, 也有可能是由于部分种类达到成熟后在某一阶段身体停止生长, 轮纹沉积不明显, 从而造成读数误差。不仅如此, 温度、盐度和光照等环境因子的周期性改变[29]、饵料的缺乏[30]都可能影响鱼体的生理活动, 从而影响脊椎骨轮纹的形成。此外, Wintner等[31]研究发现低温及乙醇溶液保存也会降低脊椎骨轮纹的对比度, 从而增加年龄读数的难度, 因此除读取轮纹外, 对年龄的校正更为必要。
年龄校正主要是验证年龄估计的准确性和轮纹形成的周期性[32]。目前采用较多的是微量元素法、放射性同位素法(bomb carbon dating)、边际增量分析法(Marginal Increment Analysis, MIA)和边缘分析法(Edge Analysis)。
1.2.1 微量元素法元素沉积速率与个体生长速率相关, 一般夏季快冬季慢[33], 微量元素法是指通过观察脊椎骨边缘微量元素峰的变化次数达到校正年龄的目的, 最常采用的是Sr元素, 如图2为一尾6龄的白点扁鲨(Squatina albipunctata)脊椎骨边缘Sr和Ca元素变化趋势, 其中Sr元素峰个数与年龄相匹配。在Raoult等[23]的研究中发现, 在短鳍真鲨(Carcharhinus brevipinna)、灰色真鲨(C. obscurus)等6种鲨中, 锶(Sr)元素含量波峰的形成与不透明轮纹的沉积相对应, 这种对应关系比钙(Ca)更为密切, 在居氏鼬鲨(Galeocerdo cuvier)的脊椎骨外缘, 镁(Mg)和钡(Ba)浓度最高, 其浓度比变化规律与脊椎骨轮纹沉积模式也存在对应关系。研究表明, Sr元素沉积与体内蛋白质基质(proteinaceous matrix)形成有关[34], 故Sr元素相比于海洋环境中其他微量元素优先沉积, 一般Sr峰出现在生长缓慢的不透明轮纹上[35], 因此Sr元素可能适合于大多数具有高度洄游性物种的年龄校正, 但某些物种可能也存在其他更适于做年龄校正的微量元素, 如Mg、Ba等。
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图2 白点扁鲨脊椎骨微量元素含量图[23]图中蓝色为Sr浓度变化, 红色为Ca元素浓度变化, 箭头和星形分别指出了每一个峰, 虚线处为出生纹位置, 大约在900 μm处. Fig. 2 Trace elements in vertebrae of Squatina albipunctata[23]The blue line is the change of Sr concentration, the red line is the change of Ca concentration. The arrow and star point out each peak. The dotted line is the birth line position, about at 900 μm. |
放射性碳同位素法是根据14C半衰期, 通过测量脊椎骨最外缘和出生纹处14C含量之差, 根据14C的年衰变率, 推算出生时14C含量衰变至最外缘含量的时间, 从而估算年龄。Campana等[36]首次通过使用14C对尖吻鲭鲨(Isurus oxyrinchus)年龄进行测定, 发现轮纹中14C确有沉积，并有一定的年度变化规律, 证实了该方法的可行性; McFarlane等[37]应用14C校正了双斑鳐(Raja binoculata)和长吻鳐(R. rhina)的年龄, 校正后, 样品中最大年龄可达26龄, 而之前所有样品普遍被低估3~10龄, 通过建立Logistic和VB生长模型发现, 校正后建立的生长曲线更加符合物种实际生长规律。但由于价格昂贵, 且只适合应用于寿命较长的种群, 使该方法使用率较低。
1.2.3 边际增量法和边缘分析法边际增量法是一定时间周期内对同一年龄段鱼种进行连续取样, 测量硬组织(脊椎骨和鳍棘)上各轮纹的半径, 计算和分析采样周期内的边际增长率(marginal increment rate, MIR), 从而确定轮纹的形成规律[2], Romine等[38]对铅灰真鲨(C. plumbeus)脊椎骨轮纹进行了边际增长率月度变化趋势分析, 发现其增长率呈月增长趋势, 而各月增长幅度存在差异, 这一差异在各年中表现类似, 从而推断轮纹形成有明显的年周期性, 随后通过建立VB、Gompertz和Logistic三种生长模型, 对比发现VB生长模型更符合基本生物学信息。边缘分析法是根据目标鱼种脊椎骨边缘增长的不透明轮纹和半透明轮纹个数的周期性(月或季)变化绘制函数模型, 以确定轮纹形成的周期模式。但由于边际增量法和边缘分析法需要一年内多次采样, 而大多数软骨鱼类属大洋性种类, 多次重复捕获难度大, 且不具备实验室饲养能力[39], 且多适用于低龄鱼年龄校正[30], 故边缘分析法和边际增量法对软骨鱼类实际操作难度很大且应用较少。
年龄与生长作为基础的生活史特征, 是资源评估所需的关键种群信息。最新研究表明, 传统的脊椎骨切片法可能大大低估软骨鱼类的实际年龄[28], 且脊椎骨中轮纹所代表的周期性也可能存在种间差异。同时根据物种类型选取多种校正方法读取年龄, 并增加实验室投喂试验以检验不同种类的轮纹周期性, 将可大大增加年龄数据的准确性。
2 摄食和洄游脊椎骨用于软骨鱼类摄食研究, 主要是利用其结构的稳定性和生长的不可逆性, 且生长贯穿整个鱼类生活史过程。通过脊椎骨(轮纹)上的碳、氮和氧稳定同位素比值来反映鱼类一定时期内的摄食信息。碳和氧稳定同位素比值［δ13C(13C/12C)和δ18O(18O/16O)］主要用于判断食物来源和栖息环境, 氮稳定同位素比值［δ15N(15N/14N)］用于估算营养级[9]。相对于肌肉和肝脏等软组织, 脊椎骨的代谢率低, 因此稳定同位素比值所表达的摄食信息的时间周期较长(一般以年计)。除测定稳定同位素外, 脊椎骨上的微(痕)量元素测定是近年来兴起的新方法, 多用于了解鱼类的洄游行为。海水中的化学元素通过鳃的呼吸进入血液, 经过细胞传递进入淋巴结晶并沉积于硬组织中[40], 大部分微(痕)量元素通过取代体内Ca元素实现元素沉积[41]。一般认为, 脊椎骨中的微(痕)量元素含量受鱼类栖息环境元素含量的影响较大, 还受pH[42]、温度[43]、盐度[44]等环境因子及鱼类自身生理需求[16]影响。通过比对鱼体和环境中微量元素含量推断鱼类的栖息地变化及洄游环境史[45], 已成为除物理标记物外最有效的软骨鱼类洄游行为研究手段。
2.1 生长发育过程中的食性转换相比于胃含物, 稳定同位素反映的是捕食者较长时间的摄食信息[9]。脊椎骨轮纹间包含有各年龄阶段的稳定同位素信息。对其连续取样, 可反映软骨鱼类整个生命周期内的摄食情况。Estrada等[46]首次利用噬人鲨脊椎骨, 通过从脊椎骨距中心间隔5 mm连续取样, 测得半径5 mm和25 mm处分别出现δ15N值的显著降低和快速升高。噬人鲨营卵胎生, 母体的卵黄囊供给幼鲨生长发育。因此, 5 mm处为幼鲨孵化, 独自摄食, 直至发育成熟, 出现食性改变(25 mm处)。脊椎骨的δ15N值合理地解释了噬人鲨生活史过程的食性转化。根据不同组织周转率的差异, Raoult等[47]对澳大利亚东部无沟双髻鲨(Sphyrna mokarran)脊椎骨、肌肉和肝脏的稳定同位素应用混合模型(mixing model)分析发现, 牛鼻鲼(Rhinoperon neglecta)在无沟双髻鲨整个生活史过程中能量供给比例一直维持占比最高(40%±7%), 表明无沟双髻鲨针对性捕食牛鼻鲼, 是其最重要的食物来源。Estupñán- Montaño等[48]对东太平洋热带海区大青鲨脊椎骨生长纹间隔1 mm连续取样, 发现其生活史中δ15N值存在显著的先升高后降低的过程, 且成年鲨鱼间存在较大的性别间差异, 这是因为幼鲨生活在生产力较高的近岸并捕食大量活动能力较低的头足类, 成年后亦在资源相对匮乏的远海, 而雌性会因生殖需求返回近岸从而导致雌性δ15N值高于雄性, 这一摄食区域的改变也可应用δ13C值得到解释, 这一结果与MacNeil等[49]利用大青鲨胃含物和脊椎骨稳定同位素获得结论一致。
2.2 营养级的确定软骨鱼类一般处于海洋食物网的顶端或近顶端, 通过其下行效应在海洋生态系统中起着至关重要的作用[9], 因此了解软骨鱼的营养级(trophic level, TL)具有十分重要的意义。应用稳定同位素可以较为准确地获得营养级信息。一般是利用15N判别值Δ15N来估算：
TL=λ+(δ15Nconsumer–δ15Nbase)/Δ15N
式中, λ是选定的基线生物的营养级, δ15Nconsumer是软骨鱼的δ15N值, δ15Nbase是食物网中基线生物δ15N值, Δ15N为判别值[44]。Estrada等[46]通过噬人鲨脊椎骨稳定同位素计算营养级分析, 其在脊椎骨半径5 mm体长90 cm处时营养级最低, 并低于大青鲨等大部分鲨鱼平均水平, 这是由于卵胎生鲨鱼幼年时过分依赖母体因而脱离母系影响后摄食等级降低所至, 而在脊椎骨15 mm体长150 cm后, 营养级水平将超过尖吻鲭鲨等位于食物链顶端的鲨鱼; Kim等[50]对噬人鲨脊椎骨研究结果得到类似结论, 发现噬人鲨在成年阶段营养级最高, 在幼年和衰老阶段营养级会有所下降, 反映了不同年龄阶段噬人鲨物种摄食偏好、捕食策略变化; 王洁[51]通过分析大青鲨脊椎骨锥心、中部、外缘的稳定同位素值, 发现大青鲨生活史中营养级在3.66~4.05之间, 跨度约为1个营养级; Marcus等[52]在对鲸鲨(Rhincodon typus)脊椎骨的研究中也有类似的发现, 鲸鲨各年龄间拥有相似的营养级(始终小于3), 说明鲸鲨具有稳定的摄食选择性。
值得注意的是营养级间富集度(判别值)和基线选择对营养级的计算结果影响显著[53]。Hussey等[54]发现营养级间富集度随生物所处营养级的升高而递减。因此, 选用等值富集度可能会低估软骨鱼营养级, 基于大数据整合推荐使用以下公式：
δ15NTL=δ15Nlim–(δ15Nlim–δ15Nbase) e–k×TL
TL=[log (δ15Nlim–δ15Nbase) –log (δ15Nlim–δ15NTL)]/k
k=–log[(β0–δ15Nlim)/–δ15Nlim], δ15Nlim=–β0/β1
式中, δ15NTL是指定营养级下消费者的15N值，δ15Nlim是随着稳定同位素富集饱和15N的极限值, δ15Nbase是基线生物δ15N值, k是δ15NTL接近其极限值的速率, 但目前尚未有应用于脊椎骨的案例。这些问题的解决将更有利于稳定同位素在海洋生态研究中应用。
2.3 营养生态位(trophic niche)营养生态位可反映物种自身营养来源特征及其在生态系统中所处的营养位置和功能，在评估物种对资源利用状况、解释种间营养关系和食物网结构具有重要指示作用[9,48,55]。脊椎骨生长纹的δ13C值可用于追溯食物来源, 进而解释其栖息环境; δ15N可用于计算营养级, 揭示摄食“质量(quality)”, 加之年龄数据, 可反映软骨鱼类整个生活史过程中的营养生态位动态[9]。Loor-Andrade等[55]测定了同域锤头双髻鲨和路氏双髻鲨(S. lewini)肌肉及脊椎骨稳定同位素含量, 发现不同发育阶段营养生态位宽度差异显著, 但并不存在性别间差异。说明虽然生长过程中发生了摄食转换, 但食性并未出现性别间分化; Estupñán-Montaño等[48]对大青鲨脊椎骨同位素序列分析同样发现了类似的结果, 即各生长阶段均有一定的生态位重叠, 但2~3龄间的幼鲨营养生态位宽度显著降低, 性成熟个体与1龄鲨营养生态位重叠面积较大, 而与2~3龄幼鲨无重叠, 这可能是由于季节性变化和生殖及索饵洄游引起的摄食场所改变所致。
2.4 洄游及栖息地利用 2.4.1 基于稳定同位素对洄游的分析由于海洋环境及营养物质分布不均, 食物网基线生物的稳定同位素比值常具有显著的空间异质性, 并将随食物链传递到食物网捕食者体内[52]。脊椎骨轮纹上的稳定同位素比值多为年周期性均值, 反映了软骨鱼类更长期的摄食信息及不同时期栖息地环境特征, 因此可构建鱼类生活史中栖息地变化模式[56]。Carlisle等[57]对太平洋鼠鲨(Lamna ditropis)脊椎骨生长轮纹连续取样并测定稳定同位素比值, 证明了太平洋鼠鲨生活史过程中存在长距离的索饵洄游和生殖洄游行为。幼鲨主要栖息在近海, 随体型增大逐渐向远洋迁徙, 在长到6龄后, 成熟雌鲨将再次游向近岸, 进行生殖洄游, 而雄性则仍主要栖息在远洋。Estupñán-Montaño等[48]对大青鲨脊椎骨稳定同位素分析发现了类似的生殖洄游习性, 而成年大青鲨的捕食对象绝大多数来自远洋。由于鲨鱼脊椎骨稳定同位素的周转率仍然未知, 其所表达的时间信息仍有待确定。
2.4.2 基于微量元素对洄游及栖息地的研究通过鱼类某些代谢惰性硬组织(如耳石[58]、鳍条[11]、鳞片[59]和脊椎骨[46])和海洋环境中微(痕)量元素含量的比对, 可用于重建其洄游环境史, 软骨鱼类多依赖于脊椎骨[17]。Tillett等[60]应用LA-ICP-MS对低鳍真鲨(C. leucas)脊椎骨外缘的Sr、Mg和Ba等11种元素含量进行测定, 通过分析Sr/Ba元素比的变化模式, 认为雌性低鳍真鲨在成熟后会定期进行生殖洄游, 而雄性没有明显洄游规律; Scharer等[61]对栉齿锯鳐(Pristis pectinata)脊椎骨进行元素分析, 通过Sr/Ca元素比的动态变化, 推测其存在定期向远海索饵, 并会洄游至墨西哥湾的迁徙模式, 同时发现这一变化规律同Sr元素随海水盐度变化模式相吻合; McMillan等[62]通过对澳大利亚南部近海雌性翅鲨(Galeorhinus galeus)脊椎骨中Mn、Mg和Li等微量元素的沉积规律, 推断其洄游路径主要为新西兰沿岸至澳大利亚南部沿海, 从而纠正了此前认为雌性翅鲨主要集中在澳大利亚东南海域的观点。
气候变化所导致的海水盐度、温度和pH等环境因子的变化以及某些重金属污染物浓度的改变都可记录在软骨鱼类的脊椎骨上[63]。目前国外已有通过对硬组织上元素沉积机理与温度、盐度、pH之间变化关系来分析栖息地环境变化的案例。Mohan等[64]对尖吻鲭鲨、大青鲨、狐形长尾鲨(A. vulpinus)脊椎骨的Mn、Ba和Ca元素进行了测定, 发现三种鲨鱼脊椎骨中Ba和Ca元素含量始终保持较低水平且变化幅度较小, 在海洋中Ba和Ca元素含量与海表温度呈显著负相关, 较低温度可以加速Ba和Ca的元素沉积, 因此得出其偏好暖水的推论; Feitosa等[65]测定了巴西北部海岸小尾真鲨(C. porosus)脊椎骨轮纹上Ba、Ca、Mn和Sr元素含量变化, 通过比对近岸海水中与轮纹上Ba/Ca比值, 发现小尾真鲨可能存在三个近岸地理群体。此外, 成年雌鲨脊椎骨中Mn含量显著高于雄鲨, 而Mn在近岸水体中含量较高, 推测可能由于生殖洄游, 雌鲨在近岸栖息时间较长有关。鱼类硬组织的Sr含量被证明与盐度相关[66], 在Feitosa等[65]的研究中, 小尾真鲨脊椎骨轮纹间Sr含量变化幅度较小, 推测其很可能不会洄游进亚马孙河流域, 这一结论也与捕捞日志数据相吻合。
2.5 脊椎骨研究的方法学 2.5.1 脊椎骨保存样品正确保存是得到准确测量结果的前提, 现阶段样品保存方法主要有低温冷冻、福尔马林和乙醇保存[67]。研究显示化学试剂保存对稳定同位素和微(痕)量元素测定结果影响显著。Mohan等[68]发现福尔马林保存显著降低鲨脊椎骨中C、Ca和Mg等元素含量, 这是由于福尔马林作为防腐剂, 会穿透组织并缓慢结合蛋白质上的醛基, 形成稳定的亚甲基交联桥, 并浸出Ca、Mg等离子。目前的研究虽还未证实乙醇对脊椎骨化学物质的影响, 但已证实乙醇会对肌肉组织中δ13C值产生影响[69], 因此使用乙醇保存应有待进一步证明其可行性。低温冷冻保存虽会造成样品的轻微收缩[31], 但仍是目前脊椎骨保存最常用和可靠的方法。
2.5.2 无机碳去除脊椎骨主要由磷酸羟基磷灰石组成, 并含有碳酸盐等无机矿化成分[70], 这些无机部分会影响有机部分碳氮稳定同位素测定值[71], 传统的处理方法是用盐酸(一般体积百分比浓度为20%~40%的HCl)对椎骨结构进行处理, 从而去除无机碳[72]。在Estupñán-Montaño等[48]对大青鲨椎骨的研究中, 使用37%的HCl对脊椎骨粉末进行脱无机碳处理。但Brodie等[73]研究发现盐酸属于强酸, 会与蛋白质上氨基酸发生反应, 从而降低组织中δ15N含量, Kim等[50]提出使用乙二胺四乙酸(EDTA)取代盐酸对样品进行处理, 研究发现噬人鲨脊椎骨中δ13C和δ15N比值可几乎保持不变, 但是在对居氏鼬鲨等其他物种脊椎骨处理时发现EDTA会严重损耗15N含量[74], 这可能与不同物种的特定生理需求和代谢途径有关, 因此针对EDTA是否适用于所有物种还需进一步证明。现阶段的研究中仍较多选用一定浓度的HCl来去除无机碳, 但针对鱼类脊椎骨无机碳去除的必要性和方法仍缺乏相关研究且存在较大争议。
3 展望软骨鱼类无论在鱼类进化、物种多样性保护还是海洋生态系统稳定等方面, 都具有重要的研究地位和价值。其基础生物学研究, 特别是生长、摄食和洄游是海洋生物学、生态学研究的重要内容, 已逐渐受到广泛关注。在应用脊椎骨追溯和还原生活史过程中的摄食及洄游行为方面, 国外学者的研究较多且深入。我国在这方面的研究起步较晚, 需加大研究力度。具体应主要在以下几个方面加深研究。
(1)方法学上, 对脊椎骨的保存和预处理方法还未形成统一标准。不同保存方法对脊椎骨形态、元素含量的影响都有待考究, 虽然目前已证实福尔马林保存对脊椎骨元素含量存在一定影响, 但研究种类较少, 可能存在偶然性。低温保存仍是目前最佳的保存方式; 在稳定同位素分析时对无机碳的去除效果及去除试剂的选取上仍存在争议, 目前对于脊椎骨仍较多采用HCl去除无机碳,而脊椎骨微取样样品量都相对较少, 强酸酸化势必大大增加系统性误差, 后续的研究应确定最适去除无机碳方法。
(2)摄食方面, 在利用稳定同位素计算营养级时, 同位素基线差异的影响需要考虑。多数大型软骨鱼类具有高度洄游性, 生活史可能常跨越多种生态系统, 这使得过程更为复杂。特定化合物稳定同位素分析将是解决这一问题的关键, 如氨基酸的δ15N值。不同氨基酸在合成和代谢过程中存在不同的N分馏机制, 其中, 谷氨酸上的15N在代谢过程中存在脱氨反应, 因此在营养级间的富集度较高(4‰~8‰), 而苯丙氨酸则在营养级间的富集度接近0。因此基于同一个体自身氨基酸δ15N值来计算营养级, 可有效排除基线干扰, 目前在软骨鱼中尚应用较少。
(3)洄游和栖息地利用上, 无论是稳定同位素还是微(痕)量元素都可以较好地追溯软骨鱼类栖息地变化, 但需要解决的关键问题是建立脊椎骨各轮纹稳定同位素比值、微(痕)量元素含量与环境基线的对应关系。因此, 得到稳定同位素的富集度和周转率, 摸清元素沉积机制至关重要, 这些参数都将需要大量的实验室内投喂试验来确定。
脊椎骨是研究软骨鱼类生长、摄食和洄游的重要硬组织。其上包含的基础生物学信息将为渔业资源的可持续利用和濒危物种的多样性保护提供重要的科学管理依据, 也将为揭示软骨鱼类这一神秘和古老类群的生活史过程提供重要理论支持。
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