中国水产科学  2021, Vol. 28 Issue (11): 1396-1405  DOI: 10.12264/JFSC2021-0149
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引用本文 

姜郦轩, 张吉昌, 樊钢洲, 李昂, 柳淑芳, 庄志猛. 南极鱼亚目鱼类DNA条形码及分子系统学[J]. 中国水产科学, 2021, 28(11): 1396-1405. DOI: 10.12264/JFSC2021-0149.
JIANG Lixuan, ZHANG Jichang, FAN Gangzhou, LI Ang, LIU Shufang, ZHUANG Zhimeng. DNA barcoding and molecular systematics of Notothenioidei[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2021, 28(11): 1396-1405. DOI: 10.12264/JFSC2021-0149.

基金项目

山东省重大科技创新工程专项（2018SDKJ0302）；国家重点研发计划项目（2018YFC1406800）；农业农村部财政专项“海洋渔业生物资源收集与保藏”和“南极海洋生物资源开发利用科研支撑”.

作者简介

姜郦轩(1995–)，女，硕士研究生，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail: 895972465@qq.com

通信作者

柳淑芳，研究员，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail: liusf@ysfri.ac.cn

文章历史

收稿日期：2021-04-13
修改日期：2021-05-17
Contents              Abstract              Full text             Figures/Tables             PDF
南极鱼亚目鱼类DNA条形码及分子系统学
姜郦轩1,2,3,张吉昌2,樊钢洲2,李昂2,3,柳淑芳2,3,庄志猛2,     
1. 浙江海洋大学水产学院，浙江 舟山 316022
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071
收稿日期：2021-04-13；修改日期：2021-05-17
基金项目：山东省重大科技创新工程专项（2018SDKJ0302）；国家重点研发计划项目（2018YFC1406800）；农业农村部财政专项“海洋渔业生物资源收集与保藏”和“南极海洋生物资源开发利用科研支撑”.
作者简介：姜郦轩(1995–)，女，硕士研究生，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail: 895972465@qq.com.
摘要：以南极海域“南极海洋生物资源养护委员会”(The Commission for the Conservation Antarctic Marine Living Resources, CCAMLR) 48.1、48.2和48.3亚区的南极磷虾(Euphausia superba)渔业兼捕所得97份南极鱼样品为研究对象，经形态学特征分析和DNA条形码将其鉴定为南极鱼亚目4科17属17个有效种，其中依据形态学特征只鉴定出6个物种，其余11个物种则依据DNA条形码得到准确鉴定。可见，在形态学鉴定经验不足或样品形态不完整的情况下，DNA条形码可以有效地实现物种鉴定。继而，分析了南极鱼类97条DNA条形码的碱基组成特征，发现GC含量第一密码子最高且第二密码子最低可能为南极鱼亚目类群的特有现象，但其生物学意义尚有待于进一步研究。将本研究采集的南极鱼亚目17种鱼类与从BOLD数据库中筛选的64种鱼类的DNA条形码合并，构建了南极鱼亚目4科39属81种鱼类的系统关系树，这是迄今为止包含种类最多的南极鱼亚目鱼类分子鉴别和系统进化关系分析。遗传距离和系统关系树分析进一步证明DNA条形码对于南极鱼类物种鉴定的适用性与可行性，另外还发现南极鱼亚目鱼类的个别物种其分子系统关系与形态学分类地位不一致。本研究结果证实了DNA条形码技术对南极鱼亚目分类群的识别效率，弥补了传统形态学鉴定方法的局限和不足，丰富了南极鱼类DNA条形码数据库，为南大洋鱼类多样性与适应性进化研究奠定了基础，同时为南极渔业资源保护和可持续开发利用提供了科学依据。
关键词：南极鱼亚目    COI基因    DNA条形码    遗传距离    分子系统关系    
DNA barcoding and molecular systematics of Notothenioidei
JIANG Lixuan1,2,3,ZHANG Jichang2,FAN Gangzhou2,LI Ang2,3,LIU Shufang,2,3,ZHUANG Zhimeng2    
1. College of Fisheries, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China
2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
3. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China
Abstract:Notothenioide is the dominant species in the Southern Ocean. Due to its high degree of specialization in morphological characteristics and physiological adaptation, the small size of most species and the difficulty in obtaining samples, the traditional morphological classification method has great limitations. DNA barcode technology provides the standard of genetic taxonomy and effective molecular taxonomy, and is the improvement, development and innovation of traditional taxonomy methods, which is helpful to accurately locate the specimens that need to be re-identified in morphology. 97 Antarctic fish samples were obtained from Antarctic krill fisheries in CCAMLR 48.1, 48.2 and 48.3 sub regions. By morphological analysis and DNA barcoding, these samples were identified as 17 effective species belonging to 17 genera and 4 families of Notothenioide. Only 6 species were identified according to morphological characteristics, and the other 11 species were identified accurately according to DNA barcoding. So DNA barcoding can effectively identify species in the case of lack of morphological identification experience or incomplete sample morphology. Then, 97 DNA barcodes of Notothenioide were analyzed. It was found that the highest GC content in the first codon and the lowest GC content in the second codon were the unique phenomenon of Notothenioide. However, its biological significance needs to be further studied. A phylogenetic tree of 81 species of fishes belonging to 39 genera and 4 families was constructed by combining the DNA barcodes of 17 species collected in this study with 64 species screened by bold. This is the most abundant molecular identification and phylogenetic analysis of Notothenioide up to now. Genetic distance and phylogenetic tree analysis further proved the applicability and feasibility of DNA barcoding for species identification of Notothenioide. In addition, it was found that the molecular phylogenetic relationship and morphological taxonomy position of individual species of Notothenioide were inconsistent. The results of this study confirmed the efficiency of DNA barcoding technology in the identification of suborder taxa of Antarctic fish, made up for the limitations and shortcomings of traditional morphological identification methods, enriched the DNA barcoding database of Antarctic fish, laid the foundation for the study of Antarctic fish diversity and adaptive evolution, and provided scientific basis for the protection and sustainable development and utilization of Antarctic fishery resources.
Key words：Notothenioidei    COI gene    DNA barcoding    genetic distance    molecular phylogenetic relationships    

南大洋具有低温寒冷、高营养盐、低叶绿素等独特的海洋生态环境，造就了其生物组成和食物网结构的特殊性。南极鱼类是该海域的代表性生物类群之一，是南大洋生态系统物质循环和能量流动的重要载体。南极鱼亚目(Notothenioidei)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲈形目(Perciform)，由共同营底栖生活的温带祖先在南极变冷过程中快速演化而来，为南极海域的原始种[1]，目前的记录种共有8科48属227种[2]，占南大洋鱼类总数的46%，在南大洋鱼类其丰度和生物量中的占比均高达90%以上[3]，是南大洋鱼类的绝对优势种。因此，对南极鱼亚目鱼类进行准确的物种分类鉴定具有重要生物学和生态学意义。

当前，传统形态学方法对南极鱼亚目鱼类进行定性和定量研究尚具有较大的局限性，一则南极鱼亚目鱼类形态特征和生理适应高度特化，加之样品获取难度大，人们对其形态学分类和物种多样性认知有限；二来受环境和食物等因素的季节变化影响，多数南极鱼亚目鱼类体型较小、生长缓慢，使其形态相似难以区分；三是受保存和运输条件所限，样本的新鲜程度和完整性无法保障。上述原因给南极鱼亚目物种分类鉴定带来了诸多困难。DNA条形码技术是对传统分类学方法的完善、发展和创新，目前已广泛应用于生物分类鉴定工作中，成为物种鉴定的有力工具之一。早在2007—2008年开展的南极海洋生物普查计划(The Census of Antarctic Marine Life, CAML)中，便开始使用DNA条形码技术鉴定南极大陆架东部的鱼类物种信息。由于当时DNA条形码技术处于起步阶段，BOLD数据库中的DNA条形码参考序列信息较为有限，使得该技术对于某些南极鱼类分类群的识别效率受到质疑[4]。但CAML计划及随后开展的罗斯海区动物区系调查均表明，南极鱼类物种多样性之前被低估了，且DNA条形码技术有助于精确定位需要在形态学上重新鉴定的标本，相关研究结果还提示南极某些类群有进一步开展DNA条形码辅助形态分类工作的必要性[4-5]。

本研究拟以南极海域“南极海洋生物资源养护委员会” (The Commission for the Conservation Antarctic Marine Living Resources, CCAMLR) 48.1、48.2和48.3亚区的南极磷虾(Euphausia superba)渔业兼捕所得南极鱼类为研究对象，在形态学分类基础上，采集南极鱼亚目标准DNA条形码，同时探讨DNA条形码技术对南极鱼亚目分类群的识别效率，弥补传统形态学鉴定方法的局限和不足，丰富南极鱼类DNA条形码数据库，为南大洋鱼类多样性与适应性进化研究奠定基础，同时为南极渔业资源保护和可持续开发利用提供科学依据。

1　材料与方法 1.1　实验材料

南极鱼类样品采样时间为2018/2019渔季和2019/2020渔季，由南极磷虾渔船“福荣海”和“福远渔9818”分别在CCAMLR 48.1、48.2和48.3亚区兼捕获取，共计97份样品，其中75份为完整鱼类样品，22份为肌肉组织样品。样品用无水乙醇浸泡固定并于冷库中保存。运回实验室后，先依据形态学特征[6-8]对鱼类样品进行初步的形态学鉴定，随后取背部肌肉组织用于DNA条形码鉴定。

1.2　DNA提取与DNA条形码序列扩增

取肌肉约30 mg，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取模板DNA，琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测DNA质量与浓度。

PCR反应体系为25 µL，其中包括上下游引物各1 µL, Mix dNTP 12.5 µL，模板DNA 3 µL，加双蒸水至总体积25 µL。DNA条形码扩增使用COI基因通用扩增引物，上下游引物[9]分别为: Fish-F: 5′-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3′, Fish- R: 5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′。

PCR反应条件为: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性0.5 min, 54 ℃退火0.5 min和72 ℃延伸 1 min, 35个循环；72 ℃延伸10 min；最后保持在4 ℃。

PCR产物约680 bp，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由青岛BGI华大基因完成双向测序。DNA条形码序列经校准后上传中国渔业生物DNA条形码信息平台(http://www.fishery-barcode.cn)。

1.3　参考DNA条形码序列下载

为了全面分析南极鱼亚目鱼类系统关系，从BOLD (http://v3.boldsystems.org/index.php/)筛选和下载了4科28属64种南极鱼亚目鱼类DNA条形码。将BOLD数据库下载的64条COI基因序列与本研究获得的97条序列合并分析。同时，下载了青鳉(Oryzias latipes) DNA条形码序列作为外类群序列。下载的COI基因序列信息如表1所示。

1.4　序列分析

利用sequencher软件对每个样品测序结果进行处理，并辅以人工校对，校对后的序列同NCBI数据库进行BLAST相似性比对，以确保结果的准确性。通过MEGA-X软件基于ClustalW对所有序列进行比对，计算序列的长度、GC含量、简约信息位点等参数。基于Kimura-2-parameter (K-2-P)双参数模型计算科内种间遗传距离(interspecific genetic distance)和种内遗传距离(intraspecific genetic distance)。使用MEGA-X软件构建邻接法(neighbour-joining, NJ)系统树，系统树的可靠性采用Bootstrap检验，经1000次重复抽样评估。

表1 　BOLD下载的南极鱼亚目鱼类COI信息 Tab. 1 　The COI information of Notothenioidei download from BOLD
2　结果与分析 2.1　南极鱼类形态学初步鉴定

本次采集的样品体型较小(图1)，有的处于幼鱼阶段，有的只保存了部分肌肉组织样品，且样品用乙醇固定后已脱色和脱水变形，因此形态学鉴定难度较大。根据南极磷虾渔业国家科学观察员提供的鱼类照片和样品信息，依据南极鱼亚目的典型形态学特征，首先将97个样品分成17组，初步判断本次采集的样品有17种。进而对其中13组具有完整形态的样品进行专业的形态学分类鉴定，有6组样品鉴定到种(样品序号: 01、02、03、07、08、14)；其余7组样品由于形态学鉴定经验不足或形态特征被破坏等因素未能鉴定到种。另外有4组样品为组织样品，无法进行专业的形态学分类。形态学特征分类信息详见表2。

2.2　DNA条形码分析与物种鉴定 2.2.1　BLAST相似性比对与DNA条形码序列特征

经ClustalW序列比对分析，本研究采集的97尾南极鱼类DNA条形码序列可分成17组。BLAST相似性比对分析结果显示，17组序列分别与17个物种的相似度超过了99%。17个物种隶属于南极鱼亚目的鳄冰鱼科(Channichthyidae)、南极鱼科(Nototheniidae)、渊龙䲢科(Bathydraconidae)和阿氏龙䲢科(Artedidraconidae)等4科的17个属(表2)。17组样品中，6组有形态学鉴定结果的样品，其BLAST相似性比对分析结果与形态学鉴定结果一致；11组无法根据形态学特征鉴定物种的样品，其DNA条形码序列通过BLAST分析可以在NCBI公共数据库中匹配到相似度超过99%的物种。

对97尾南极鱼类样品的DNA条形码进行分析，去除两段引物序列保留共有序列570 bp，其碱基组成比例为A 22.3%、G 18.4%、C 28.9%、和T 30.4%。A+T碱基含量(52.7%)明显高于G+C碱基含量(47.3%)。COI序列密码子的碱基组成特征分析表明，第二位密码子的A+T含量最多(57.2%)，其次是第三位密码子(53.9%)，第一位密码子的A+T含量最少(47.2%); G+C含量最高的则是第一位密码子(52.8%)，其次是第三位密码子(46.1%)，而第二位密码子G+C含量最低(42.8%) (表3)。序列保守位点有378个，变异位点192个，简约信息位点184个，单突变位点8个，无插入/缺失位点(表3)。

图1 　南极鱼类样品照片图中13个样品序号与表2样品序号对应；另有4组样品为肌肉组织，未在图中展示. Fig. 1 　Photos of Antarctic fish samplesThe sequence numbers of 13 samples in the figure correspond to those in Tab. 2, and theother 4 samples are muscle tissues, which are not shown in this figure.
表2 　南极鱼类的形态学和DNA条形码分类鉴定结果 Tab. 2 　Identification and classification of Notothenioidei by morphology and DNA barcoding
表3 　密码子第一位、第二位和第三位平均组成统计表 Tab. 3 　Statistics of the average composition of the first, second and third codons %
2.2.2　属间、种间及种内遗传距离

利用MEGA- X软件基于Kimura-2-parameter模型计算97条DNA条形码的遗传距离(表4)。结果显示，17种南极鱼亚目鱼类种内遗传距离范围为0~0.0198，平均值为0.0033，均低于2%的种间遗传分化界限[10]；种间遗传距离范围为0.0201~0.2136，平均值为0.0746，均高于2%的种间遗传分化界限；种间和种内平均遗传距离相差23倍，符合Hebert提出的物种鉴定“10×法则”标准[10-14]，明显为17个有效种。

对4科鱼类的同科种间的遗传距离分析发现，南极鱼科鱼类的种间遗传距离平均值为0.1551，其中拉森氏拟南极鱼(Nototheniops larseni)和真鳞肩孔南极鱼(Trematomus eulepidotus)种间遗传距离最大为0.2136，莫氏犬牙南极鱼(Dissostichus mawsoni)和奇南极䲢(Aethotaxis mitopteryx)种间遗传距离最小为0.0809；鳄冰鱼科鱼类的种间遗传距离平均值为0.0699，其中南乔治亚尼拟冰鱼(Pseudochaenichthys georgianus)和裘氏鳄头冰鱼(Champsocephalus gunnari)种间遗传距离最大为0.1015，短腹头带冰鱼(Notothenia coriiceps)和眼斑雪冰鱼(Chionodraco rastrospinosus)种间遗传距离最小为0.0330；渊龙䲢科的尖头裸龙䲢 (Gymnodraco acuticeps)和澳洲姥龙䲢(Gerlachea australis)种间遗传距离为0.0534；阿氏龙䲢科的种间遗传距离在4科中最小，长背多罗龙䲢 (Dolloidraco longedorsalis)和长胸鳍阿氏龙䲢 (Artedidraco skottsbergi)种间遗传距离为0.0201。

表4 　不同分类单元遗传距离(K2P)统计表 Tab. 4 　Summary of genetic divergences (K2P) within various taxonomic levels
2.2.3　南极鱼亚目鱼类系统关系构建

为了进一步验证上述物种鉴定结果的准确性，以便全面分析南极鱼亚目鱼类系统关系，将本研究自测的南极鱼亚目4科17属17种鱼类的97条DNA条形码，与BOLD数据库下载的4科28属64种南极鱼亚目鱼类DNA条形码合并分析。本次构建的南极鱼亚目鱼类系统关系树包括4科39属81种，其中南极鱼科34种、鳄冰鱼科15种、渊龙䲢科16种和阿氏龙䲢科16种。

NJ系统树中南极鱼亚目鱼类总体上聚为6支，具有较高的节点支持率，其中，南极鱼科(Nototheniidae)位于系统树根部，由3支组成，为并系群(paraphyletic group)；其次是鳄冰鱼科(Channichthyidae)，属单系群(monophyletic group)；渊龙䲢科(Bathydraconidae)和阿氏龙䲢科(Artedidraconidae)分化时间更晚，均为单系群。在属的水平上，绝大多数同属物种都各自聚在一起，仅有南极鱼科的寒极鱼属(Cryothenia)、鳄冰鱼科的雪冰鱼属(Chionodraco)和阿氏龙䲢科的阿氏龙䲢属(Artedidraco)等3个属的物种未聚成独立的小分支。另外，副南极鱼属(Paranotothenia)鱼类与南极鱼属(Notothenia)的5个种聚在一个分支内(图2)。

3　讨论

南极鱼亚目鱼类是南极鱼类中物种多样性最丰富的类群，虽然多数物种个体较小，且数量有限，但该类群是适应性进化和耐寒机制研究的良好生物模型，因而具有重要的科学意义和经济价值。南极鱼类资源研究不仅为适应性进化机制研究和生物技术创新带来机遇，亦将促进国际社会对南极生态与环境保护及其生物资源权属与管理等问题达成共识。南极鱼类的准确分类鉴定是其保护生物学、进化生物学和生物地理学等研究的前提。据报道，南极鱼类每年都有新物种被发现[5]。DNA条形码提供了有效的遗传分类学标准，采集南极鱼类DNA条形码信息是发现新物种和隐存种、丰富南大洋生物多样性认识的便捷途径之一，能为研究南极鱼类的进化规律和遗传变异提供基础数据。本研究中的97份南极鱼样品经形态学特征分析和DNA条形码鉴定为南极鱼亚目4科17属17个有效种，其中依据形态学特征只鉴定出6个物种，其余11个物种则依据DNA条形码得到准确鉴定。可见，在形态学鉴定经验不足或样品形态不完整的情况下，DNA条形码可以有效地实现物种鉴定。

Ward等[9]曾报道了143种硬骨鱼类的DNA条形码第一密码子GC含量最高、第三密码子GC含量最低；彭居俐等[15]分析了鲤科(Cyprinidae)鱼类DNA条形码密码子GC含量，得出与Ward等[9]一致的结果；柳淑芳等[16]则发现石首鱼科(Sciaenidae) DNA条形码的第二密码子GC含量最高，第三密码子GC含量最低；赵娜等[17]分析了15种南极鱼科和鳄冰鱼科鱼类的36条DNA条形码及NCBI下载的两科鱼类61条DNA条形码，发现该类群第一密码子GC含量最高(51.3%)，第二密码子含量最低(42%)。本研究分析了97条南极鱼类DNA条形码的碱基组成特征，发现AT平均含量(52.7%)显著高于GC平均含量(47.3%)，其中第一密码子GC含量最高(52.8%)，第二密码子GC含量最低(42.8%)。本研究结果与赵娜等[17]的结果相一致，但有别于其他硬骨鱼类的DNA条形码碱基组成特征。可见，不同类群鱼类的DNA条形码碱基组成有所不同，第一密码子GC含量最高且第二密码子最低是否为南极鱼亚目类群的特有现象？该现象有何生物学意义？这些问题尚有待于进一步研究。

图2 　81种南极鱼亚目鱼类的DNA条形码NJ分子系统树* 标注为本研究自测样品. Fig. 2 　Neighbor-joining phylogenetic tree of DNA barcodes for 81 species of NotothenioideiMarked with * are the samples determined in this study

本研究采集的南极鱼亚目17种鱼类DNA条形码，结合从BOLD筛选和下载的南极鱼亚目64种鱼类DNA条形码，构建了南极鱼亚目4科39属81种鱼类的系统关系树，其中包括南极鱼科34种、鳄冰鱼科15种、渊龙䲢科16种和阿氏龙䲢科16种。迄今为止，本研究为包含种类最多的南极鱼亚目鱼类分子鉴别和系统进化关系分析，物种和属分别占已有记录的35.68%和81.25%。NJ系统树显示，南极鱼亚目4个科聚类效果明显且节点支持率较高。但是属级的物种聚类时，有部分物种在系统树上的位置与传统的分类地位不一致。比如: (1)寒极鱼属(Cryothenia)的两个物种在系统树中的位置异于预期。其中，海神寒极鱼(Cryothenia amphitreta)与肩孔南极鱼属(Trematomus)和南冰䲢属(Pagothenia)的物种聚为一支，该分支内的物种均隶属于Trematominae亚科；斑条寒极鱼(Cryothenia peninsulae)却并未与其同属姊妹种海神寒极鱼(C. amphitreta)聚在一起，而且游离于Trematominae亚科的分支之外。赵娜等[17]也曾发现了此类现象，可见该属的分类地位尚有待于深入探究。(2)个别物种的属级分类单元的有效性值得商榷。在系统树中，博氏南冰䲢(Pagothenia borchgrevinki)聚在肩孔南极鱼属(Trematomus)分支中，新西兰副南极鱼(Paranotothenia magellanica)聚在南极鱼属(Notothenia)分支中。在FishBase中检索两个物种的曾用名，发现博氏南冰䲢的同种异名之一为Trematomus borchgrevinki，而新西兰副南极鱼的同种异名之一为Notothenia magellanica。据此，本研究结果不支持南冰䲢属(Pagothenia)和副南极鱼属(Paranotothenia)的物种独立成属，还需要有更多的同属物种的形态学和分子分类学证据进行佐证。(3)鳄冰鱼科的雪冰鱼属(Chionodraco)和阿氏龙䲢科的阿氏龙䲢属(Artedidraco)的属内物种没有聚到一起，这两个属的物种分类地位还需要补充更多的样品进行深入分析。

综上所述，根据DNA条形码计算南极鱼亚目鱼类的种间和种内平均遗传距离，符合Hebert提出的物种鉴定“10×法则”标准；NJ系统树上，南极鱼科、鳄冰鱼科、渊龙䲢科和阿氏龙䲢科各科物种聚类效果明显，大部分的同属物种也各自聚为一支；遗传距离和系统关系树分析进一步证明DNA条形码对于南极鱼类物种鉴定的适用性与可行性；南极鱼亚目鱼类的个别物种其分子系统关系与形态学分类地位不一致。可见，DNA条形码对种类繁多、形态相似的南极鱼亚目鱼类可实现快速准确、简便高效的物种鉴定，不仅能辅助传统形态学方法为南极鱼亚目分类系统提供必要补充和佐证，而且适用于南极鱼亚目物种的系统发育关系构建。

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