嗜冷黄杆菌(Flavobacterium psychrophilum)是鲑科鱼类细菌性冷水病(bacterial cold water disease, BCWD)的致病菌，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和银鲑(Oncorhynchus kisutch)尤其易感^[1]。自1948年首次从美国患病银鲑的肾脏中分离到嗜冷黄杆菌以来，该菌在丹麦、挪威、瑞典、法国、英国、日本、韩国、澳大利亚、加拿大、美国、智利和秘鲁等多个国家和地区的集约化鲑鳟主养区均有报道^[2]。BCWD的典型临床症状包括尾柄部溃烂、鳍条腐烂、鳃苍白，伴有脾脏肿大、肠炎等^[3]，通常在4~15 ℃的水温时发生，10 ℃及以下流行普遍且危害严重^[4]，可造成患病鲑鳟10%~90%死亡率^[5]，严重制约了鲑鳟产业的健康发展。

目前，国内外对嗜冷黄杆菌的研究多集中在分子流行病学、检测方法、耐药性、致病性和免疫防控技术等方面^[6-9]。嗜冷黄杆菌的致病机制复杂且尚不够清晰，其菌株毒力与黏附系统、外毒素、脂多糖和分泌系统等相关^[3]。最新研究表明，嗜冷黄杆菌具有很强的弹性蛋白水解活性，可降解鱼皮肤、肌肉和软骨的成分^[10]。该菌利用IX型分泌系统(T9SS)分泌多种蛋白到细胞表面和其他地方，如细胞表面黏附素、肽酶、核酸酶和其他水解酶等^[11]。该菌无鞭毛或菌毛，却能产生滑动运动，T9SS分泌运动性黏附素到细胞表面，这是滑动运动所必需的^[12]。嗜冷黄杆菌的侵染途径包括水平和垂直传播两种^[13]，该菌对上皮组织表面的黏附使它能够侵入宿主，鳍是最常附着的部位，其次是鳃、皮肤^[14]。Papadopoulou等^[14]评估了嗜冷黄杆菌对虹鳟鱼苗鳃、皮肤和鳍黏膜表面的附着力，这种黏附性受到组织和时间的显著影响，他们同时发现该菌能少量侵入虹鳟的脾脏和肾脏，这可能在BCWD的发病机制中起着至关重要的作用。但是关于该病原在鱼体内不同组织中的增殖和分布情况仍不清楚。

本课题组前期首次报道了国内养殖虹鳟源嗜冷黄杆菌的分离鉴定和生物学特性研究^[15]，通过肌肉注射感染健康虹鳟表明，分离菌株对实验鱼具有较高的致病性，肝脏、脾脏和肌肉组织病变明显。为进一步阐明嗜冷黄杆菌对虹鳟的致病机制，本研究利用qPCR方法开展嗜冷黄杆菌在肌肉注射感染虹鳟过程中的组织嗜性及动态分布研究，以期为有效防控BCWD提供理论基础。

嗜冷黄杆菌CH06株(全基因组序列GenBank登录号: CP046374.1)由本实验室分离、鉴定并保藏，其MLST基因型为ST12型，血清型为Fd型^[15]。健康虹鳟购自辽宁本溪艾格莫林实业有限公司，平均体重20~30 g，开展实验前于水族箱中暂养1周并进行细菌学检测，以确保其处于健康状态且不携带嗜冷黄杆菌。

实验用胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、组织基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司，2×Taq PCR Master Mix购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，2× GoldStar Probe Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司，引物和探针委托吉林省库美生物科技有限公司合成。

取冻存于–80 ℃的CH06株划线接种于胰蛋白酵母提取物(tryptone yeast extract salts, TYES)琼脂平板上，15 ℃恒温培养72~96 h。挑取单菌落接种于TYES肉汤培养基中，15 ℃ 150 r/min振荡培养72 h，使用生理盐水清洗菌液3次并重悬，10倍系列稀释重悬后的菌液，采用平板计数法计算菌液浓度。

将实验虹鳟随机分为2组，实验组和空白对照组各15尾。攻毒前利用MS222麻醉虹鳟，实验组用1×10⁸ CFU/mL CH06株菌悬液按0.1 mL/尾在虹鳟尾柄部进行肌肉注射，空白对照组注射等体积生理盐水。

感染12 h、24 h、96 h后详细观察和记录实验组和对照组虹鳟的临床症状，同时分别取注射处肌肉、脾脏和肾脏，用4%多聚甲醛固定48 h (中间换液)，样品经包埋切片、切片脱蜡至水化、苏木素染色、盐酸乙醇分化、自来水返蓝、伊红染色、脱水、透明、封片步骤处理后，利用尼康EclipseCi-L显微镜观察和拍照。

分别选择12 h、24 h、96 h 3个时间点检测虹鳟各组织载菌量，研究嗜冷黄杆菌对虹鳟的组织嗜性。感染12 h、24 h、96 h后随机捞取2组中各3尾鱼进行样品采集，包括肝脏、脾脏、肾脏、肠道、鳃、注射处肌肉、脑和尾鳍，立即冻存于–80 ℃中备用。

取1.0 mL CH06株菌悬液于1.5 mL离心管中，10000 r/min离心3 min，弃去上清，按照试剂盒说明书进行细菌基因组DNA提取并检测其浓度和纯度。以CH06株基因组DNA为模板，使用引物^[16]F. psychro_ P1F(5′-GAAGATGGAGAAGGTAATTTAGTTGATATT-3′)和F. psychro_P1R(5′-CAAATAACATCTC CTTTTTCTACAACTTGA-3′)进行PCR扩增嗜冷黄杆菌rpoC基因目的片段。PCR反应体系(50 μL)如下: 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL, ddH₂O 20 μL。PCR扩增条件^[4]: 96 ℃预变性10 min; 96 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化后，进行测序比对分析及DNA浓度定量检测。根据公式^[16]计算拷贝数: 拷贝数(copy/μL)=纯化产物的DNA浓度(ng/μL)/(1.797×10^–7)(pg/copy)。

参照Strepparava等^[16]建立的嗜冷黄杆菌qPCR检测方法，将纯化的PCR产物进行10倍系列稀释作为模板，使用TaqMan探针(5′-FAM- AAACGGGTATTCTTCTTGCTACA-3′BHQ1)和引物F. psychro_P1F/P1R进行TaqMan qPCR扩增。反应体系(10 μL)如下: GoldStar Probe Mixture 5 μL，引物各0.2 μL, TaqMan探针0.2 μL, ROX 0.2 μL, DNA模板0.5 μL, ddH₂O 3.7 μL。反应条件^[4]: 95 ℃预变性10 min; 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 s, 40个循环；40 ℃延伸10 s。所有样本进行3次重复，同时设立阴性对照。按上述体系及条件进行qPCR反应，得到标准曲线。

取30 mg冻存的各组织按照试剂盒说明书进行组织基因组DNA的提取，检测纯度和浓度后置于–20 ℃保存备用。以提取的各组织基因组DNA为模板，按照1.5.2中的方法进行qPCR检测，所有样本进行3次重复，同时设立阴性对照。应用已构建的标准曲线计算虹鳟各组织病原载量。

从实验组和对照组中各采样3尾虹鳟，在脾脏、肾脏等组织取样划线接种于TYES琼脂培养基上，15 ℃恒温培养72~96 h后对分离菌株进行形态特征和理化特性分析。同时，参照方法1.5.2提取细菌基因组DNA，利用嗜冷黄杆菌特异性引物F. psychro_P1F/P1R扩增rpoC基因进行测序比对分析。

实验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较采用Duncan’s法，结果以平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$表示，P<0.05表示差异显著。

人工感染后12 h，注射处肌肉略微肿胀，此时解剖无组织异常；感染后24 h，虹鳟精神不振，游动缓慢或不动，厌食，此时解剖可见注射处肌肉小面积溃烂，脾脏肿大不明显；感染后96 h，虹鳟体色发黑，尾柄部溃烂，此时剖检可见有鳃苍白，脾脏肿大，肝脏有出血点和腹水现象，注射部位肌肉溃烂严重，部分个体甚至出现脊柱畸形(图1)。对照组虹鳟仅在注射处出现肌肉略微肿胀现象，剖检未见组织异常情况，且始终无死亡。

注射处肌肉: 感染后12 h，注射处肌肉组织无病理变化(图2A)；感染后24 h，肌纤维断裂、溶解(图2B)；感染后96 h，肌纤维大量断裂、溶解，伴有大量炎性细胞浸润(图2C)。

脾脏: 感染后12 h，脾脏组织无病理变化(图2D)；感染后24 h，脾窦扩张，其内充满红细胞(图2E)；感染后96 h，脾脏组织充满大量红细胞，残存的脾髓呈岛屿状漂浮其中(图2F)。

肾脏: 感染后12 h，肾脏组织无病理变化(图2G)；感染后24 h，肾脏组织部分肾小管上皮脱离基底膜，肾小球肿胀(图2H)；感染后96 h，肾脏组织含铁血黄素增加，出现大量空泡变性，肾小管上皮细胞变性、坏死，肾间质许多炎性细胞浸润(图2I)。

设置浓度在2.7×10⁸~2.7×10² copy/μL范围的标准品进行qPCR扩增。以每个浓度标准品拷贝数的lg值为横坐标，以出现的C_t值结果为纵坐标，获得基于检测rpoC基因qPCR方法的标准曲线(图3)。标准曲线方程为y=–4.1213x+43.551，截距为43.551，斜率为–4.1213，相关系数R²=0.9997，表明标准品拷贝数lg值与C_t值线性关系良好。

图1

图1 　患病虹鳟临床病征及病理解剖A. 第24小时，注射处肌肉小面积溃烂；B. 第24小时，脾脏略微肿大；C. 第96小时，体色发黑；D. 第96小时，尾柄部溃烂；E. 第96小时，脾脏肿大、肝脏有出血点；F. 第96小时，脊柱畸形；G. 第96小时，鳃苍白；H. 第96小时，注射部位肌肉溃烂. Fig. 1 　Clinical signs and pathological anatomy of diseased rainbow troutA. Small area of muscle ulceration at injection site at 24 h; B. Slightly enlarged spleen at 24 h; C. Blacken body at 96 h; D. Erosion of the caudal peduncle at 96 h; E. Splenomegaly and liver bleeding at 96 h; F. Spinal deformity at 96 h; G. Pale gills at 96 h; H. Muscle ulceration at the injection site at 96 h.

以提取的实验组和对照组虹鳟组织基因组DNA为模板，利用常规PCR方法扩增嗜冷黄杆菌rpoC基因。结果表明，实验组成功获得大小约为164 bp的目的基因片段，其与预期目的片段大小相符(图4)，而对照组PCR结果为阴性。BLAST比对分析显示，PCR产物序列与嗜冷黄杆菌rpoC基因的同源性为100%。

以感染CH06株后不同时间点虹鳟各组织DNA为模板进行qPCR TaqMan探针检测，结果显示在整个感染过程中，脾脏、肝脏、肾脏、肠道、鳃、注射处肌肉、脑和尾鳍中均可检出嗜冷黄杆菌；同时，常规微生物分离培养结果显示，从脾脏、肾脏等组织中可以分离到该病原。对照组既不能从各组织中分离到嗜冷黄杆菌，也不能通过qPCR检测到该病原。

通过病原载量的多少判定嗜冷黄杆菌的组织嗜性强弱。结果表明(图5)，嗜冷黄杆菌对虹鳟的注射处肌肉、脾脏、肾脏和鳃具有较强的组织嗜性，为细菌增殖的重要场所，对肝脏、尾鳍、肠道和脑的组织嗜性相对较弱。感染后12 h，注射处肌肉病原载量最高为(5.85±2.11)×10⁵ copy/μL，其次是鳃和肾脏，其病原载量分别达到(1.62±0.28)× 10³ copy/μL和(1.30±0.23)×10³ copy/μL。感染后24 h，脾脏和脑中的病原载量分别为(1.26±0.37)× 10⁴ copy/μL和(1.72±0.31)×10³ copy/μL，与其他组织相比，较上一时间点上升最多，分别是12 h时的17.05倍和13.30倍。肾脏、鳃、脑中的病原载量维持在10³水平，而肝脏、肠道、尾鳍中的病原载量维持在10²水平。注射处肌肉病原载量为(6.48±2.07)×10⁵ copy/μL，显著高于其他组织(P< 0.05)。感染后96 h，所有被检组织病原载量均上升，脾脏中的病原载量为(1.15±0.58)×10⁷ copy/μL，显著高于注射处肌肉病原载量(P<0.05)，注射处肌肉病原载量为(7.21±1.77)×10⁶ copy/μL，显著高于其他组织(P<0.05)。肝脏、肾脏和脾脏中的病原载量分别为(1.75±0.45)×10⁶ copy/μL、(2.00±0.22)× 10⁶ copy/μL和(1.15±0.58)×10⁷ copy/μL，与其他组织相比，较上一时间点上升最多，分别是24 h时的3243.34倍、1336.96倍和916.94倍。

图2

图2 　嗜冷黄杆菌感染虹鳟的组织病理损伤(HE)A~C. 分别为感染12 h、24 h和96 h后虹鳟注射处肌肉组织病变情况；D~F. 分别为感染12 h、24 h和96 h后虹鳟脾脏组织病变情况；G~I. 分别为感染12 h、24 h和96 h后虹鳟肾脏组织病变情况. Fig. 2 　Histopathological changes of rainbow trout infected by Flavobacterium psychrophilum (HE)A–C. Histopathological changes in intramuscular injection site at 12 h, 24 h and 96 h; D–F. Histopathological changes in spleen tissues at 12 h, 24 h and 96 h; G–I. Histopathological changes in kidney tissues at 12 h, 24 h and 96 h.

图3

图3 　荧光定量PCR扩增标准曲线 Fig. 3 　Real-time PCR amplification standard curves

图4

图4 　rpoC基因的PCR扩增M: DNA Marker DL2000; 1: rpoC基因片段；2: 阴性对照. Fig. 4 　Amplification of rpoC gene by PCR

图5

图5 　虹鳟感染嗜冷黄杆菌后各组织中病原载量的变化分析* 表示相同感染时间不同组织差异显著(P<0.05). Fig. 5 　Analysis of bacterial load in different tissues of rainbow trout infected by Flavobacterium psychrophilum* means significant differeces (P<0.05) among different tissues at the same time.

所有被检组织中嗜冷黄杆菌的载量随感染时间增加均呈上升趋势，其中，注射处肌肉和脾脏中的病原载量最高，其次为肾脏、鳃、肝脏、尾鳍、肠道和脑。嗜冷黄杆菌对注射处肌肉和脾脏的嗜性最强，其次为肾脏和鳃，其对肝脏、尾鳍、肠道、脑组织嗜性相对较弱。

鱼类人工感染细菌的方法包括浸浴、肌肉注射、腹腔注射或通过口腔、生殖孔感染。嗜冷黄杆菌感染虹鳟主要采用浸浴法或注射法，在虹鳟的早期生命阶段(<5 g)，浸浴感染是首选方法，因为此时虹鳟容易感染，且这种感染方法不会绕过黏液、表皮、鳃和肠道的内在防御机制，模拟了自然感染途径^[17-18]。然而浸浴感染的缺点是可重复性低，由病原菌导致的死亡率低，感染过程较长。较大的虹鳟(5~10 g)通常对嗜冷黄杆菌浸浴感染不易感，本研究所用虹鳟体重较大为20~ 30 g^[19]。在水生环境中，虹鳟通常会接触异质传染病原体。然而，即使自然界中经常发生此类感染，虹鳟的共同感染也很少受到关注^[20]。比如大西洋鲑三代虫(Gyrodactylus salaris)的附着和摄食破坏了虹鳟鳃和表皮的完整性，导致其抵抗细菌及病毒的能力下降^[21]；鱼虱(Caligus rogercresseyi)以虹鳟的黏液、表皮组织和血液为食，损伤体表造成机械损伤^[21]；寄生水霉(Saprolegnia parasitica)感染虹鳟致使其患部皮肤缺失，露出真皮^[22]；鲑疱疹病毒Ⅱ型(salmonid herpesvirus2, SaHV2)感染虹鳟致使其体表糜烂、溃疡^[22]；这些感染都有极大可能导致机会性病原体的入侵和继发感染，肌肉注射感染正是模仿了这些情况发生后的继发感染。Decostere等^[19]使用嗜冷黄杆菌浸浴和通过口腔、生殖孔这3种方法感染虹鳟，在实验组和对照组中，均未发现虹鳟表现出临床症状或死亡，在虹鳟皮肤、鳃、肾脏、脾脏和大脑的组织学检查中未发现嗜冷黄杆菌，也没有从检查的任何器官中分离出该菌。Holt^[23]的研究表明对于嗜冷黄杆菌感染虹鳟和其他鲑科鱼类，通过肌肉注射感染比腹腔注射感染更有效；Garcia等^[24]证明利用嗜冷黄杆菌诱导虹鳟幼鱼感染，肌肉注射感染的死亡率高于腹腔注射感染；Fredriksen等^[25]用浓度为5.0×10⁷ CFU/mL的嗜冷黄杆菌腹腔注射虹鳟，死亡率为0，用浓度为5.0×10⁷ CFU/mL、5.0× 10⁶ CFU/mL、5.0×10⁵ CFU/mL的嗜冷黄杆菌肌肉注射虹鳟，死亡率为75%~100%。这些实验均证明肌肉注射感染可行性比腹腔注射感染可行性更高。同时，嗜冷黄杆菌能分泌弹性蛋白酶，这是一种能降解鱼类结缔组织如皮肤和肌肉的胞外蛋白酶，采用在尾柄部肌肉注射CH06的方法正与自然感染嗜冷黄杆菌虹鳟在尾柄部出现皮肤溃疡、肌肉溃烂这一临床症状相似。所以本实验采用肌肉注射法进行人工感染实验。

感染预实验分别以CH06株菌悬液1.0× 10⁸ CFU/mL组、1.0×10⁷ CFU/mL组、1.0× 10⁶ CFU/mL组3个浓度按0.1 mL/尾在虹鳟尾柄部进行肌肉注射。虽然各浓度组都能感染成功，但1.0× 10⁶ CFU/mL组死亡率只有60%，与其他两组相比较低，96 h观察虹鳟未出现死亡情况且尾柄部未出现溃疡灶，说明此浓度略低，死亡过慢，未能达到理想的感染状态；1.0×10⁷ CFU/mL组死亡率为90%，死亡率高，96 h观察虹鳟出现1例死亡，解剖发现皮肤下肌肉已出现溃烂但尾柄部仍未出现溃疡灶，也未能达到理想的感染状态；1.0× 10⁸ CFU/mL组死亡率为100%，死亡率高，72 h出现第1例死亡，96 h死亡4尾，在96 h就能达到50%死亡率，死亡鱼中有80%都出现了典型的尾柄部溃疡灶，脾脏肿大的比例也达60%，该组典型症状出现比例最高，综合考虑最终选用1.0× 10⁸ CFU/mL浓度的CH06肌肉注射感染虹鳟作为正式实验感染条件，并将该浓度组出现50%死亡率的时间点作为采样的终止时间。注射等体积生理盐水的对照组虹鳟无明显临床病征且无死亡。

黄杆菌属包含多种细菌，地理范围呈世界性分布，能在淡水、土壤甚至寒冷环境中生存，其中对鱼类具有致病性且危害严重的包括嗜冷黄杆菌、嗜鳃黄杆菌(Flavobacterium branchiophilum)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)和约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)^[26]。鱼类黄杆菌病的临床症状主要表现为体色发黑，食欲下降，游泳异常，皮肤溃疡。也会出现其他临床症状，如虹鳟感染嗜鳃黄杆菌会出现鳃丝肿胀、颜色暗淡等症状^[27]；黄颡鱼感染柱状黄杆菌会出现鳃丝发白、不整齐，腹腔积水，肠道系膜充血等症状^[28]；草鱼感染约氏黄杆菌会出现烂鳃、鳍条和鳍条基部溃烂等症状^[29]。嗜冷黄杆菌作为一种对鲑鳟类养殖业产生严重威胁的病原菌，在国外具有较长的研究历史。本研究以1.0×10⁸ CFU/mL的CH06肌肉注射于虹鳟，成功感染虹鳟，其人工感染的临床表现与自然感染相同，主要有虹鳟精神不振，游动缓慢或不动，厌食，体色发黑，尾柄部溃烂，鳃苍白，脾脏肿大，肝脏有出血点和腹水，其中尾柄部溃烂比较典型，可以作为临床上诊断虹鳟嗜冷黄杆菌感染的一个示病表现。

病原体的快速检测和定量，对于疾病监测至关重要，是流行病学研究的重要组成部分。实时荧光定量PCR (qPCR)已用于多项研究中，以提高病原检测和定量方法的敏感性。陈成等^[30]使用qPCR技术定量检测拟态弧菌(Vibrio mimicus)浸浴感染黄颡鱼后在体内的动态分布，结果表明皮肤、鳃和肠道是病菌的入侵位点，并在体内多组织、器官分布。刘丹等^[31]使用qPCR技术定量检测大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus, CGSRV)人工感染大鲵后在不同组织中的动态分布，结果显示CGSRV在肺、肠、肝脏、脾脏、肾脏和皮肤肌肉中含量高，表明CGSRV具有广泛的组织分布特征。本研究基于rpoC基因开展qPCR定量检测。每个细菌细胞可能含有数量不等的16S rRNA基因拷贝，以单拷贝基因为靶点，可以更直接更准确地量化病原体，一个基因拷贝对应一个细菌细胞。此外，rpoC的变异性可以提供嗜冷黄杆菌靶序列的特异性扩增，使rpoC成为qPCR的良好候选^[16]。Jarau等^[4]通过rpoC qPCR法和平板计数法计算受感染鱼组的96个脾脏样品的菌落数，发现两种计数方法之间存在非常强的正相关性(R²= 0.915, P<0.05)，证明rpoC qPCR法计算出的菌落数可以反映活菌数。平板计数法非常耗时且劳动强度大，rpoC qPCR法具有速度快和易于操作的优点。本研究发现，在人工感染虹鳟的脾脏、肝脏、肾脏、肠道、鳃、肌肉、脑和尾鳍中均能检测到嗜冷黄杆菌，且随着感染时间的延长，所有被检组织中的病原载量持续增加。其中，由于采用肌肉注射感染的原因，注射处肌肉病原载量始终较高，在感染后12 h、24 h显著高于其他组织(P<0.05)，在感染后96 h略低于脾脏病原载量，而高于其他组织。与感染初期相比，感染嗜冷黄杆菌96 h后虹鳟的肝脏、肾脏、脾脏中病原载量显著上升，说明肌肉、肝脏、肾脏和脾脏是嗜冷黄杆菌的重要增殖场所。组织病变观察与qPCR检测结果相比，可见组织病变出现的时间与病原载量的多少呈现较高的一致性。Ekman^[32]研究结果显示，嗜冷黄杆菌在感染虹鳟过程中，脾脏病变明显，脾脏出血、坏死并存在大量游离细菌；肾脏表现出肾小管上皮和造血组织坏死的病变。也有研究发现，嗜冷黄杆菌感染虹鳟后可在患病鱼的鳃、皮肤、内脏器官和伤口上检测到该病原菌^[33]。Jarau等^[4]研究发现，人工感染3 d后可在虹鳟脾脏中检测出嗜冷黄杆菌。这些研究结果都与本研究得到的嗜冷黄杆菌侵染组织的结果一致。

本研究利用qPCR技术探究嗜冷黄杆菌肌肉注射感染虹鳟后细菌在鱼体内的增殖分布规律和组织嗜性，为进一步研究嗜冷黄杆菌的致病机制及有效防控BCWD奠定重要基础。