2021, Vol. 28 
2. 上海海洋大学，上海 201306
2. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
扑草净(prometryn)是一种高效低毒的内吸型除草剂，除了在农业用于防除一年生禾本科及阔叶草外，也被广泛用于水产养殖、河道以及水库除藻，尤其用于虾类、海参、贝类等养殖中清池和大型藻类去除[1]。未吸收的扑草净随废水排入河流、湖泊或海洋[2-3]。中国黄渤海[4]、海南八门湾[5]、莱州湾[6]等水域中均有扑草净检出，国外海洋环境中也多次扑草净检出[7-8]。山东沿岸贝类中也有不同程度检出扑草净[9]，近年来中国多批次出口日本贝类被查出扑草净残留超标，严重影响了我国水产品对外贸易[10]。扑草净具有类似于苯环的结构，化学性质较稳定，有一定的残效期，易被双壳贝类等海洋水产动物富集，进而造成生态风险、影响水产品的质量安全。
目前，国内外关于贝类中扑草净的研究多集中于局部地区污染调查及急性毒性方面，对贝类抗氧化酶系统及组织细胞的影响报道较少。四角蛤蜊(Mactra veneriformis)是中国沿海常见的滩涂经济贝类，以辽宁、山东为最多，主要栖息于潮间带中下区及浅海的泥沙滩中[11]，由于生长位置比较固定，受扑草净污染的风险相对更高。有研究指出，扑草净可引起生物体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)等抗氧化酶活性显著变化，产生一系列应激反应，从而导致氧化损伤[12-13]。海洋生物的抗氧化酶系统与其免疫力密切相关，其各成分的活性或含量的变化可作为机体受到氧化胁迫的生物标志物[14]。扑草净对四角蛤蜊抗氧化酶系统及组织细胞的影响目前尚未见报道。
本研究以中国沿海常见滩涂贝类四角蛤蜊为研究对象，通过分析扑草净胁迫与净水释放条件下四角蛤蜊鳃和消化腺SOD、CAT、GPx等抗氧化酶的活性变化，观察胁迫阶段鳃丝组织形态学改变，从氧化损伤及组织病理学角度探讨扑草净对四角蛤蜊的毒性效应，旨在为寻找扑草净污染的潜在生物标志物和滩涂贝类健康增养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂仪器: 酶标仪(Bio-RAD，中国上海美谷分子仪器有限公司)、紫外可见光分光光度计(U-2900，日本日立有限公司)、显微镜(DM500，德国徕卡有限公司)、全自动组织脱水机(TP1020，德国徕卡有限公司)、石蜡包埋机、旋转式切片机、全自动染色机、展片机、超净工作台、手提式高速分散器匀浆机、高速离心机。
试剂: 扑草净标准品(纯度>98.0%, Dr. Ehrenstorfer，德国)；考马斯亮蓝蛋白测定、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所，中国)；苦味酸；切片石蜡；化学试剂均为色谱纯和优级纯。
1.2 实验材料四角蛤蜊取自黄河口潮间带，体重(8.38±0.51) g，壳长(4.10±0.38) cm；小新月菱形藻(Nitzschia clos terium)藻种来自山东省海洋资源与环境研究院藻种室。实验用海水取自烟台近海，水温(15±1) ℃。
1.3 实验方法扑草净胁迫、释放实验参考刘丽娟等[15]。实验采用半静态水质接触染毒法，每个水箱中注入清洁海水100 L，实验期间连续充气，每24 h通过虹吸作用排除粪便，随后换1/2 (以体积计)相同扑草净质量浓度的海水。设置3个染毒组和1个对照组，3个染毒组扑草净质量浓度分别为0.2 μg/L、1.0 μg/L、10 μg/L，对照组扑草净质量浓度为0，仅加相同体积的助溶剂乙醇，染毒组和对照组各设3个平行。胁迫实验共持续21 d，实验期间保持染毒组海水中扑草净质量浓度基本恒定。胁迫实验结束后开始净水释放实验，所有实验水箱中海水均换成清洁海水，换水及投喂方法与胁迫实验一致，净水释放实验共持续15 d。用于检测酶活性样品在胁迫实验第1、2、4、6、10、15、21天和释放实验第1、3、6、10、15天取样；每组随机取3~5只四角蛤蜊，放于冰盘上解剖、迅速取鳃丝、消化腺放入标记好的1.5 mL离心管，–80 ℃保存。用于组织切片样品分别在胁迫实验第15、21天取样，每次从每个水箱内随机取四角蛤蜊3只。
酶活性测定时，取四角蛤蜊鳃、消化腺组织按照体积比1∶9加入预冷0.86%的生理盐水，冰浴匀浆，4 ℃ 3000 r/min离心10 min后取上清液，按照考马斯亮蓝蛋白测定，SOD、CAT、GPx试剂盒的说明测定蛋白含量和酶活。
每只贝切取鳃丝组织，经Bouin’s液固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、染色并封片后，光学显微镜下观察并拍照记录样品。
1.4 数据处理实验结果采用平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$表示，用统计分析软件SPSS 20.0对酶活性进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，使用T检验对不同处理组之间进行差异性检测，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著；用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析 2.1 扑草净胁迫浓度设定依据本课题组曾经分别于2018年4月、7月、10月开展了对黄河口贝类增养殖区海水中除草剂污染特征调查。结果显示，该海域海水中扑草净检出率为100%，平均检出质量浓度为0.24 μg/L，最高检出质量浓度1.09 μg/L。本研究依据该调查结果，设置扑草净胁迫质量浓度为0.2 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L。
2.2 扑草净对四角蛤蜊SOD的影响扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊鳃SOD活性的影响见图1。胁迫阶段，随着扑草净胁迫时间的延长和浓度的升高，鳃SOD时间效应、浓度效应较明显。0.2 μg/L、1.0 μg/L两组四角蛤蜊鳃中SOD活性一直处于被诱导状态，第1天被明显诱导(P<0.01)，第2天后活性有所降低，呈现先升高后降低趋势，两组均在第10天达到较高诱导率(P<0.05)，分别为52.5%、50.1%。10.0 μg/L组酶活性先被抑制再被诱导，整体呈现先升高后降低的趋势，第1天被抑制(P<0.01)，第4天起被诱导，第10天达到最高诱导率65.4% (P<0.05)；第15天后酶活性逐渐降低，第21天接近对照组。净水释放阶段，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组SOD在第1天均有所回升，至第7天达到最高值(P<0.05)，随后逐渐降低并接近对照组。10.0 μg/L组酶活性先上升后下降，至第15天明显低于对照组(P<0.05)，不能恢复至对照水平，且变化不稳定。
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图1 不同浓度扑草净对四角蛤蜊鳃SOD活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05), **表示与对照组比较有极显著性差异(P<0.01). Fig. 1 Effect of different concentrations of prometryn on SOD activity in gills of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05); ** indicates a extremely significant difference compared with the control group (P<0.01). |
扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊消化腺SOD活性的影响见图2。胁迫阶段，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组SOD活性均处于被诱导状态，整体呈现先升高后降低的趋势，两组SOD活性分别在第4天、第6天达到最高诱导率(P<0.05)，分别为29.0%、34.9%; 10 μg/L组表现为先被抑制后被诱导的趋势，第1天起被抑制至第4天达到较低值，第6天起被诱导至第15天达到最高值(诱导率8.3%)，浓度效应较明显。净水释放阶段，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组SOD在第1天、第3天均有所回升(P<0.05), 10 μg/L组在第1天持续降低，可能由于胁迫产生过多的活性氧，抑制SOD的活性，第3天达到最高值，随后逐渐接近对照组。
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图2 不同浓度扑草净对四角蛤蜊消化腺SOD活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05). Fig. 2 Effect of different concentrations of prometryn on SOD activity in digest gland of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05). |
扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊鳃中CAT活性的影响见图3。胁迫阶段，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组四角蛤蜊鳃中CAT活性均表现为第1天先被诱导(P<0.01)，第2天被抑制，两组趋势略有不同，0.2 μg/L组第6天、第10天诱导率分别为38.1%、34.8%，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。1.0 μg/L组在第4天、第6天被诱导并在第4 天达到最高诱导率(P<0.05)，分别为72.6%、42.8%，第10天酶活性被抑制且逐渐降低，并低于对照组，时间效应较明显。10.0 μg/L组酶活性整体趋势为先升高后降低，第1天开始先被抑制(P<0.05)，至第4天、第6天达到较高诱导率，分别为29.6%、25.0%，第10天后被抑制，1.0 μg/L组和10.0 μg/L组CAT受影响更明显，浓度效应和时间效应明显。净水释放阶段，0.2 μg/L组CAT活性趋于接近对照组(P>0.05)，可见该浓度扑草净对CAT活性影响不大。1.0 μg/L、10.0 μg/L两组酶活性无明显变化规律，先处于被抑制状态，但活性趋于升高，1.0 μg/L组在第7天被诱导显著高于对照组(P< 0.05)，第10天被抑制(P<0.05)，而10.0 μg/L组在第15天被极显著诱导(P<0.01)。
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图3 不同浓度扑草净对四角蛤蜊鳃CAT活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05), **表示与对照组比较有极显著性差异(P<0.01). Fig. 3 Effect of different concentrations of prometryn on CAT activity in gills of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05); |
扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊消化腺CAT活性的影响见图4。胁迫阶段，相同暴露时间下，消化腺中CAT呈现较明显的浓度效应。3个实验组整体呈现先升高后降低的趋势，0.2 μg/L组酶活性接近对照组(P>0.05)，第4天达到最高诱导率29.5%; 1.0 μg/L组从第2天起被诱导并在第4天达到最高诱导率56.4%(P<0.01); 10.0 μg/L组基本处于被诱导状态(P<0.05)，从第2 天至第15天被显著诱导(P<0.05)，在第4天达到最高诱导率103.5% (P<0.01)。净水释放阶段，0.2 μg/L组酶活性接近对照组，可见，0.2 μg/L扑草净胁迫对四角蛤蜊消化腺中CAT活性影响不大。1.0 μg/L组在第3天(P<0.05)、第7天处于被诱导状态且活性有所回升，第10天后活性被抑制并低于对照组；10 μg/L组表现为趋于降低，第1天至第7天继续被诱导并达到较高值(P<0.05)，第10天后活性明显被抑制，显著低于对照组(P<0.05)。
2.4 扑草净对四角蛤蜊GPx的影响扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊鳃GPx活性的影响见图5。胁迫阶段，0.2 μg/L组一直处于被诱导状态，第1天被显著诱导(P<0.05)，第2天起活性呈降低趋势，第10天时又被诱导至较高值，诱导率为35.8%，之后趋于接近对照组水平(P> 0.05)，可见，低浓度扑草净作用会诱导GPx活性，对四角蛤蜊产生一定氧化胁迫。1.0 μg/L组变化趋势与0.2 μg/L组基本一致，第2天后酶活性先降低后升高，在第10天时被诱导至较高值，诱导率为34.3%；而10.0 μg/L组受到抑制较明显，与对照组差异显著(P<0.05)，第1天、第4天及第6天受到显著抑制(P<0.05)，酶活性无明显变化规律。净水释放阶段，0.2 μg/L组酶活力表现为先升高又降低，最后趋于对照水平；1.0 μg/L和10.0 μg/L组GPx活性变化趋势不明显或呈现紊乱状态，酶活性失调。
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图4 不同浓度扑草净对四角蛤蜊消化腺CAT活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05), **表示与对照组比较有极显著性差异(P<0.01). Fig. 4 Effect of different concentrations of prometryn on CAT activity in digest gland of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05); |
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图5 不同浓度扑草净对四角蛤蜊鳃GPx活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05), **表示与对照组比较有极显著性差异(P<0.01). Fig. 5 Effect of different concentrations of prometryn on GPx activityin gills of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05); |
扑草净胁迫和释放条件下四角蛤蜊消化腺GPx活性的影响见图6。胁迫阶段，3个实验组均表现为第1天先被诱导(P<0.05)，后略有降低，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组在第10天达到较高值，诱导率分别为30.6%、34.3%, 10.0 μg/L组酶活性变化与对照组差异显著(P<0.05)，在第1天、第10天被诱导诱导率达到69.3%，在第6天被显著抑制(P<0.05)，抑制率为64.9%，随后3个组均呈降低趋势。净水释放阶段，0.2 μg/L、1.0 μg/L两组在第7 天诱导率分别为74.4% (P<0.05)、134.1%, 10.0 μg/L组在第3天达到最高值，第7天后3个组趋于降低，0.2 μg/L组与对照组差异不明显，1.0 μg/L、10.0 μg/L两组明显低于对照组(P<0.05)，没有恢复活性。
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图6 不同浓度扑草净对四角蛤蜊消化腺GPx活性的影响* 表示与对照组比较有显著性差异(P<0.05), **表示与对照组比较有极显著性差异(P<0.01). Fig. 6 Effect of different concentrations of prometryn on GPx activity in digest gland of Mactra veneriformis* indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05); |
扑草净胁迫条件下，在第15天、第21天时四角蛤蜊鳃丝组织切片样本见图7。第15天时，对照组鳃上皮细胞排列规则、形态正常，可见较完整的纤毛层，鳃丝腔结缔组织充盈、无异物(图7a); 0.2 μg/L组鳃丝黏膜略有肿胀，边缘稍模糊(图7b), 1.0 μg/L组鳃丝扭曲，鳃膈膜呈圆形(图7c); 10 μg/L组鳃丝紧缩，纤毛明显变少(图7d)，浓度效应明显。21 d时，对照组鳃上皮细胞略有紧缩(图7e); 0.2 μg/L组鳃丝黏膜层变薄(图7f)，随着浓度的增高，鳃丝进一步变细，上皮细胞紧缩，纤毛脱落，鳃丝内开始出现腔隙并逐渐变大(图7g–h), 10 μg/L组鳃丝变异程度高于1.0 μg/L组，时间效应和浓度效应明显。
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图7 扑草净胁迫对四角蛤蜊鳃组织的影响a~d: 15 d时对照组、0.2 μg/L组、1 μg/L组、10 μg/L; e~h: 21 d时对照组、0.2 μg/L组、1 μg/L组、10 μg/L组. A: 鳃丝，B: 结缔组织，C: 鳃膈膜. Fig. 7 Effect of prometryn on Pathological changesof gills of Mactraveneriformisa–d: control group, 0.2 μg/L group, 1 μg/L group, 10 μg/L group on the 15th day; e–h: control group, 0.2 μg/L group, 1 μg/L group, 10 μg/L group on the 21st day. A: gill filament, B: connective tissue, C: gill diaphragm. |
抗氧化酶系统是生物体受到胁迫时重要的代谢调节机制，SOD作为基本的抗氧化酶，能将超氧阴离子(O2–)自由基歧化为H2O2和O2; H2O2在CAT和GPx的作用下转化为H2O和O2。CAT在清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。GPx可清除机体内的H2O2及脂类氢过氧化物，抑制脂质过氧化，防止细胞膜和组织受过氧化损伤[16]。SOD、CAT和GPx之间相互协同，在清除活性氧、控制脂质过氧化水平以及减少对膜的伤害起到重要作用，三者酶活性之间的平衡是确定超氧阴离子和H2O2等活性氧稳态水平的关键[17]。SOD、CAT和GPx等抗氧化酶作为灵敏的生物标志物指标，在生态毒理学及环境污染预警研究中应用较为广泛。
国内外在扑草净对贝类抗氧化酶系统毒性效应研究方面鲜有报道，但大量研究证明，除草剂影响水生动物的抗氧化酶系统的正常生理机能。10 μg/L、50 μg/L剂量阿特拉津处理太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)消化腺，其SOD和CAT活性受到显著诱导[18]；阿特拉津等4种除草剂混合后处理尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏，其GST和CAT活性明显受到诱导或抑制[19]; 2.5 mg/L草甘膦胁迫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)12 h后，可显著诱导其肝脏CAT、GPx活性[20]；丁草胺处理牙鲆(Paralichthy solivaceus)后，其鳃细胞SOD、CAT和GPx的酶活性受到明显抑制[21]; 0.51 μg/L扑草净胁迫可引起克氏原螯虾(Procambarus clarkii)组织抗氧化酶活性的改变，抗氧化机制受到损伤[22]。本研究中，四角蛤蜊受到0.2 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L高中低3个质量浓度的扑草净胁迫时，鳃和消化腺抗氧化酶系统被诱导或抑制，其SOD、CAT和GPx活性均发生改变。
随着胁迫时间的延长，0.2 μg/L扑草净对四角蛤蜊鳃和消化腺酶活性影响小于1.0 μg/L、10.0 μg/L组，低浓度扑草净对四角蛤蜊产生一定的氧化胁迫，诱导抗氧化酶活性升高，且影响相对较小，这与长时间低浓度扑草净暴露可引起克氏原螯虾不明显氧化损伤[22]的研究结果一致。国内外许多研究都发现，当生物体受到轻度逆境胁迫时，机体会做出相应的反应以适应环境变化，酶活力往往会升高[23-24]。本研究中，四角蛤蜊在0.2 μg/L质量浓度扑草净作用下，体内活性氧增多，诱导抗氧化酶的合成，SOD、CAT和GPx酶活力变强，与胁迫产生的活性氧达到动态平衡，说明当机体受到污染物胁迫时，机体抗氧化酶系统发挥保护作用，抵御环境对机体的伤害，这是贝类为了适应外界环境而调节自身生理状态的结果[25]。10.0 μg/L组随着胁迫时间延长各酶活性明显受到抑制，可能是由于扑草净在四角蛤蜊体内不断积累，高浓度刺激下机体产生过多的超氧阴离子，不能被SOD等抗氧化酶及时清除，机体所受胁迫超出了自身的防御能力，抑制了3种酶的活性[26]。另外，SOD歧化产生的H2O2不能被及时分解，也会抑制抗氧化酶活性[27]。GPx活性变化不稳定，受抑制较其他浓度明显，其活性下降也会导致H2O2的累积，加剧了对抗氧化酶活性的抑制，进而对细胞造成氧化损伤[28]，机体随之发生生理和病理改变，这与溴氰菊酯对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarun)体内酶活性变化规律的影响[29]一致。CAT和GPx同为清除H2O2的重要抗氧化酶，两种酶对刺激的响应力度略有不同，可能与二者对H2O2亲和力不同有关[30]。鳃、消化腺中SOD、CAT和GPx对胁迫的敏感性均表现为鳃>消化腺，可能由于鳃直接与扑草净接触，受到直接作用，而贝类消化腺是双壳贝类主要解毒器官，抗氧化酶含量比较丰富，受到外界刺激初期，对刺激的响应机制比鳃相对稳定[17]。随着扑草净浓度的升高、胁迫时间的延长，酶活性受到的影响越来越明显，呈现明显时间效应和浓度效应，这与邻苯二甲酸二丁酯对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)鳃和内脏团SOD、CAT[14]，以及PFOS对翡翠贻贝(Perna viridis)外套膜抗氧化酶[31]的影响的研究结果一致。
净水释放阶段，0.2 μg/L、10 μg/L组SOD、CAT和GPx活性部分回升或恢复，可能随着扑草净胁迫消除，四角蛤蜊体内扑草净得到释放，刺激源减少，酶活力略有恢复。但10.0 μg/L组GPx、CAT活性呈现紊乱、失调状态，无明显规律。结合扑草净胁迫与释放的养殖过程，随着实验时间的延长，10 μg/L组贝类个体普遍对外界刺激反应不灵敏，推测四角蛤蜊在胁迫阶段受到高浓度扑草净的刺激，经过一定时间的积累，过多的活性氧不能被SOD、CAT、GPx及时清除，SOD产生的H2O2超出CAT、GPx的消除能力，机体受到的胁迫超出了自身的防御能力，抗氧化酶系统受到破坏，CAT和GPx活性降低或散失，进而造成不可逆的氧化损伤[28]，释放阶段酶活性也不能恢复至对照水平。1.0 μg/L组、10 μg/L组四角蛤蜊鳃中GPx活性均无明显变化规律，酶活性紊乱，且在释放阶段均未完全恢复活性。该结果可更确切地反映扑草净对四角蛤蜊的毒性效应，说明相对于SOD、CAT而言，GPx对扑草净胁迫表现得更敏感，可作为扑草净污染的潜在生物标志物。
鳃是四角蛤蜊的呼吸、滤食器官，由外套膜的内侧壁延伸形成，起始于外套膜与内脏囊后方，具有气体交换和调节离子平衡的重要作用。鳃的损坏会破坏贝类呼吸作用，影响其摄食行为，影响贝类生长发育，甚至导致生物体的死亡[32]。丁草胺可引起牙鲆鳃细胞水肿、板层上皮的抬升和脱离、支柱细胞破裂、损害其呼吸功能，急性致命性极高[21]。本研究结果表明，扑草净胁迫可引起鳃丝上皮细胞的形态变化，随着染毒浓度的升高，细胞损伤逐渐加重，鳃丝表现为上皮细胞萎缩、纤毛脱落，鳃丝内腔隙变大，10.0 μg/L扑草净可导致鳃组织损伤。这与溴氰菊酯染毒菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)导致其鳃丝上皮细胞纤毛层萎缩、纤毛脱落[29]、草甘膦引起鱼鳃细胞间隙变大[33]的结论一致。
4 结论随着扑草净浓度增高或胁迫时间延长，四角蛤蜊抗氧化酶SOD、CAT及鳃组织细胞形态变化存在明显浓度效应和时间效应，高浓度扑草净对四角蛤蜊造成明显氧化损伤，引起组织细胞形态学变化，对其有明显的毒性效应。扑草净对SOD、CAT、GPx均有一定的诱导或抑制作用，0.2 μg/L扑草净可诱导四角蛤蜊抗氧化酶活性，对其造成一定的氧化胁迫，但影响小于1.0 μg/L、10.0 μg/L两组。净水释放阶段，1.0 μg/L、10.0 μg/L组酶活性不能完全恢复甚至活性丧失，10.0 μg/L扑草净对四角蛤蜊抗氧化酶系统造成不可逆氧化损伤。扑草净胁迫可引起鳃上皮细胞萎缩、纤毛脱落，鳃丝内腔隙变大。
综上，四角蛤蜊鳃中GPx可作为扑草净污染的潜在生物标志物，用来反映扑草净对海水养殖环境的污染，并为海洋环境中扑草净污染作出预警。
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