2021, Vol. 28 
2. 福建省水产研究所, 福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室, 福建 厦门 361000
2. Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361000, China
海藻附生菌与其宿主有着复杂的关系, 一方面, 与海藻相关细菌以直接或间接的方式在海藻的形态发生和生长中起着关键的作用[1]。例如, 与海藻相关的细菌代谢产物和固氮细菌负责海洋大型藻类的形态建成和生长发育[2-3], 并且有益附生菌通过分泌次级代谢产物或抗菌剂产生化感作用来对抗有害微生物的定殖和侵染[4]。而另一方面, 当环境恶化或宿主的免疫受损时, 一些对藻类有利的细菌也有可能成为致病菌[5]。例如, 当藻体受到温度胁迫时, 共生型细菌群落中防御物质呋喃酮分泌减少, 将致使病原体的侵染力增强, 导致红藻白化[6-7]。同时大量研究还发现, 存在于海带(Saccharina japonica)表面的弧菌属(Vibrio)、盐单胞菌属(Halomonas)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)与海带病害的发生密切相关[8-11]。
点状白烂病是海带育苗期常见病害, 近年来, 该病害在海带养殖中大规模出现, 给海带养殖业造成巨大的经济损失[12]。海区暂养是海带苗种培育的关键环节[13], 迄今为止, 国内外学者对室内培育海带苗种的病害研究已有大量的报道[14-16], 但是对海区暂养海带苗种的病害研究极少。海带病害的发生与其表面附生菌的群落结构紧密关联, 因此可从微生物群落结构的角度, 探究细菌和暂养期海带病害间的关系。基于此, 本研究采用高通量测序技术分析了暂养期海带及其所处海水环境的细菌群落结构和多样性, 旨在从微生物群落结构及多样性的角度掌握细菌与患病海带间的互作关系, 为今后揭示暂养期海带病害发生的机制提供科学参考。
1 材料和方法 1.1 样本采集及处理2018年12月, 在福建省泉州市泉港区肖厝海区(图1A)采集了暂养期患病海带幼苗和患病海带养殖区水样, 同一时间于临近海区(图1B)采集了同批苗种同一天下海暂养且长势良好的健康海带幼苗和健康海带养殖区水样。健康海带和患病海带及其所处养殖区海水样本均采集3个。采用Leica DMI8光学显微镜(德国莱卡公司)对海带样本进行显微观察和拍照(图2), 之后从健康海带幼苗的叶片梢部附近切取约10 g的新鲜藻段, 从患病海带叶片边缘的病烂部分切取同等大小藻段, 经灭菌海水清洗数遍去除样本上的杂质后, 装入无菌自封袋中, 液氮速冻后于–80 ℃超低温冰箱内保存备用。实验中采集的海水样本, 预先使用尼龙网(200 μm孔径)过滤600 mL, 去除碎屑后再使用混合纤维膜(0.22 μm孔径)过滤, 该过程使用真空抽滤机(予华牌SHZ-DⅢ)进行负压抽滤。
1.2 DNA提取、PCR扩增和测序根据基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)的说明书要求, 提取海带样本和海水样本的基因组DNA, 以制备基因组DNA为模板, 后使用16S rRNA基因V3~V4片段的通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[17-18]扩增目标DNA片段。使用低循环数对目标DNA进行扩增, 且在扩增过程中保持各样本扩增循环数一致。20 μL的PCR扩增体系的反应条件: 95 ℃下预变性3 min; 95 ℃下变性30 s, 55 ℃下退火30 s, 72 ℃下延伸45 s, 共27个循环; 72 ℃下延伸10 min。将所得的PCR产物混合后经过2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物, Tris-HCl洗脱, 后收集和纯化产物置于上海美吉生物医药有限公司的测序平台进行测序。
1.3 数据分析使用fastp和FLASH软件优化样本测序数据, 之后确定海带宿主叶绿体和线粒体的序列, 将其从数据中去除。使用Usearch软件对优化后的序列进行聚类分析[19], 后采用RDPclassifier软件中的贝叶斯算法对97%相似性水平OTU代表序列进行分类学分析[20], 比对Silva数据库, 在不同分类学水平上统计各样本的细菌群落组成。选择97%相似性的OTU, 利用mothur软件计算不同随机抽样下的Alpha多样性指数, 包括物种丰富度指数(abundance based coverage, ACE)、Chao指数、香农指数(Shannon index)、辛普森指数(Simpson index)和覆盖率(coverage)[21]。使用Qiime软件计算beta多样性距离矩阵[22], 利用vegan软件进行nMDS和Anosim分析, 利用R语言工具绘制群落结构组分图和Venn图。使用SPSS 20.0软件对多样性指数和关键细菌OTUs进行单因素方差分析。
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图1 海带幼苗和海水采样点A: 患病样本采样点; B: 健康样本采样点. Fig. 1 Sampling sites for the seedlings of kelp Saccharina japonica and seawaterA: sampling site of diseased samples; B: sampling site of healthy samples. |
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图2 海带幼苗样本及其显微观察A: 健康幼苗; B: 患病幼苗; C: 健康幼苗边缘部致密的细胞; D、E: 患病幼苗边缘部解离的细胞. Fig. 2 Samples of the seedlings and their microscope observationsA: healthy seedlings; B: diseased seedlings; C: compact cells in the marginal part of healthy seedlings; D, E: dissociative cells in the marginal part of diseased seedlings. |
将健康海带、患病海带及其所处海域海水的样本经高通量测序及序列优化, 并对嵌合体、叶绿体和线粒体序列进行质量过滤和去除后, 共获得602739条优化序列(表1)。序列平均长度为433 bp, 其中长度处于421~440 bp的优化序列有428036条, 441~460 bp的优化序列有174180条, 两者占全部优化序列的99.91%。各样本覆盖率均超过99.5%, 表明该测序深度捕获了样本绝大部分细菌, 能够全面地反映海带样本和海水样本的细菌群落结构。
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表1 各样本序列结果统计 Tab. 1 Statistics of the sequencing results of samples |
按最小样本序列数对样本序列进行抽平, 将抽平后的样本16S rRNA序列结果与Silva物种分类数据库中的参考序列进行比对注释, 共识别出32个门、77个纲、219个目、398个科、797个属、1772个OTUs。
选择门级别进行分类学水平的分析(图3), 结果显示, 除去所有样本中丰度占比均小于1%的物种后, 海带附生菌首要优势门为变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 其中变形菌门在HS和DS样本所占比例相近, 分别为43.84%和49.29%, 而HS样本中拟杆菌门的相对丰度(19.91%)远低于DS样本(37.31%); 次要优势门为放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes), 两者的相对丰度在HS和DS样本中也有差别, 放线菌门在HS样本中所占比例为10.79%, 高于DS样本(1.65%), 厚壁菌门在HS样本中所占比例为15.52%, 高于DS样本(5.92%); 其他优势门为蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria), 其相对丰度较低。在所有海水样本中首要的优势菌门均为变形菌门, 其在HW和DW样本的微生物组成中所占比例分别为46.4%和55.69%; 次要的优势菌门为拟杆菌门、放线菌门和蓝细菌门, 其中拟杆菌门和放线菌门在HW和DW样本中的相对丰度分别为13.22%、13.27%和12.89%、16.52%, 而蓝细菌门在HW样本中所占比例为25.44%, 高于DW样本(10.88%)。
选择科作为分类阶元进行分类学分析(图4), 结果显示, DS样本中黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和红杆菌科(Rhodobacteraceae)分别以33.47%和21.17%的相对丰度占据绝对的优势; 次要优势科为鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)和生丝单胞菌科(Hyphomonadaceae), 相对丰度分别为10.07%和8.11%, DS样本中有10个细菌科的相对丰度超过1%。HS样本中的优势附生菌属于红杆菌科(12.55%)、黄杆菌科(10.7%)、鞘脂单胞菌科(3.29%)和生丝单胞菌科(4.02%), 其相对丰度均低于DS样本。与DS相比, HS样本附生菌科类丰富, 有24个细菌科的相对丰度超过1%。在海水样本中, 细菌科类丰富, 但并不存在占绝对优势的细菌科。相对丰度较高的细菌科有红杆菌科、黄杆菌科、蓝细菌科(Cyanobiaceae)和放线菌科(Actinomarinaceae), 其中红杆菌科、黄杆菌科和放线菌科在HW和DW样本的细菌组成中所占比例相近, 分别为22.29%、8.62%、8.26%和15.53%、10.37%、10.74%。而蓝细菌科在HW样本中所占比例为25.23%, 高于DW样本(10.86%)。
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图3 海带和海水门水平的细菌群落组成DS: 患病海带; DW: 患病海带养殖区海水; HS: 健康海带; HW: 健康海带养殖区海水. Fig. 3 Bacterial communities of kelp Saccharina japonica and seawater at phylum levelDS: diseased kelp; DW means seawater from diseased kelp breeding areas; HS: healthy kelp; HW: seawater from healthy kelp breeding areas. |
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图4 海带和海水科水平的细菌群落组成DS: 患病海带; DW: 患病海带养殖区海水; HS: 健康海带; HW: 健康海带养殖区海水. Fig. 4 Bacterial communities of kelp Saccharina japonica and seawater at family levelDS: diseased kelp; DW: seawater from diseased kelp breeding areas; HS: healthy kelp; HW: seawater from healthy kelp breeding areas. |
通过微生物16S rRNA V3~V4区测序结果, 构建Venn图来识别健康海带和患病海带及其所处养殖区海水样本的优势菌群(图5)。健康海带和患病海带及其所处养殖区海水样本共有1772个细菌OTUs, 其中相同的OTUs个数为118个, 有685个OTUs只存在于HS样本, 166个OTUs只存在于DS样本, 45个OTUs只存在于HW样本,35个OTUs只存在于DW样本。HS样本单独富集的细菌菌群数量最多, 细菌菌群数量排序依次为HS>DS>HW>DW。
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图5 海带和海水微生物OTU的维恩图DS: 患病海带; DW: 患病海带养殖区海水; HS: 健康海带; HW: 健康海带养殖区海水. Fig. 5 Venn diagram of the OTU of microflora of kelp Saccharina japonica and seawaterDS: diseased kelp; DW: seawater from diseased kelp breeding areas; HS: healthy kelp; HW: seawater from healthy kelp breeding areas. |
为探究海带和海水样本中细菌群落丰富度和多样性的差异, 基于测序数据, 对其进行Alpha多样性分析, 得到Ace、Chao、Simpson和Shannon指数后, 进行了显著性差异分析(图6)。结果显示, HW与DW样本的各项指数均无显著性差异, 表明健康海带和患病海带所处养殖区海水的细菌群落结构丰富度和多样性差异不显著。HS与DS样本之间的Ace和Chao指数无显著性差异, 但两者之间的Shannon和Simpson指数具有显著性差异(P<0.05), 表明健康海带和患病海带表面附生菌的物种丰富度差异不显著, 但两者附生菌的群落分布具有显著性差异(P<0.05)。与HS相比, DS样本中的Ace和Chao指数的标准差都较高, 这说明健康海带和患病海带附生菌中某些特定细菌的丰度具有较大的差异。
为进一步解析细菌群落结构的多样性, 基于Bray_Curtis距离算法进行nMDS分析, 以阐明细菌群落结构的聚类关系(图7)。结果显示, 海带和海水的细菌群落呈离散型分布, 而非按照健康状况聚集, 这说明健康海带和患病海带及其所处养殖区海水的微生物群落结构丰富度无显著性差异。同时进行Anosim与Adonis分析(表2), 结果显示海带样本和海水样本之间的P值均大于0.05, 这再次说明健康海带和患病海带及其所处养殖区海水的微生物群落结构丰富度无显著性差异。
2.4 关键细菌OTU的鉴定通过SIMPER分析, 筛选出8个关键的OTUs (海带中4个, 海水中4个), 解释了健康海带和患病海带及其所处养殖区海水细菌群落结构的差异(图8)。
对于海带样本而言, 患病海带附生菌群落中与黄杆菌科(OTU1169和OTU1111)、红细菌科(OTU1351)和鞘脂单胞菌科(OTU1353)相关OTUs的相对丰度较健康海带显著增加(P<0.05)。其中OTU1169仅在患病海带中发现且相对丰度最高, 提供了21.36%的差异率, 是潜在引起海带发病的主要致病菌科。这3个细菌科的4个OTUs共提供35.88%的差异率。
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图6 海带和海水细菌群落多样性指数的比较柱上不同字母表示差异显著(P<0.05); DS代表患病海带; DW代表患病海带养殖区海水; HS代表健康海带; HW代表健康海带养殖区海水. Fig. 6 Comparisons of diversity indices for kelp Saccharina japonica and seawater bacterial communitiesDifferent letters on the top of the columns indicate significant differences (P<0.05); DS means diseased kelp; DW means seawater from diseased kelp breeding areas; HS means healthy kelp; HW means seawater from healthy kelp breeding areas. |
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图7 基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维标度图A、B分别表示海带和海水的非度量多维标度图; DS: 患病海带; DW: 患病海带养殖区海水;HS: 健康海带; HW: 健康海带养殖区海水. Fig. 7 Non-metric multidimensional scaling (nMDS) plot based on a Bray-Curtis distance matrixA and B indicate the nMDS of kelp and seawater, respectively; DS: diseased kelp; DW: seawater from diseased kelp breeding areas; HS: healthy kelp; HW: seawater from healthy kelp breeding areas. |
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表2 基于Bray-Curtis差异性对海带和海水相关细菌群落结构差异的显著性检验 Tab. 2 Significance tests of the differences of kelp Saccharina japonica and seawater associated bacterial community structures, respectively on the basis of Bray-Curtis dissimilarities |
与患病海带养殖区海水相比, 在健康海带养殖区海水中存在2个较高丰度的细菌目: 聚球藻菌目(OTU1743和OTU1476, Synechococcales)和红杆菌目(OTU1407, Rhodobacterales), 其在两个样本间的相对丰度具有显著差异(P<0.05), 提供17.96%的差异率。寡营养类群SAR86在患病海带养殖区海水中的丰度更高, 与健康海带养殖区海水存在显著差异(P<0.05)。
3 讨论本研究, 通过高通量测序技术发现暂养期健康海带和患病海带的优势细菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门, 这些细菌门在一些藻类表面中也已被发现[23-27]。相关丰度较高的细菌类群普遍存在于大型藻类中, 如极北海带(Laminaria hyperborea)[28]、Saccharina latissima[29]和南方石莼(Ulva australis)[5]。黄杆菌科和红杆菌科在暂养期健康海带和患病海带附生菌中的相对丰度具有较大差异, 相关研究已经证实, 黄杆菌谱系菌类是分解繁殖期藻体有机物的重要菌类[30-31]。这提示黄杆菌科和红杆菌科与海带感染病害可能有密切的联系。
多样性指数分析显示, 健康海带和患病海带两者之间的Ace和Chao指数无显著性差异, Simpson和Shannon指数存在显著差异(P<0.05), 表明病害可能对海带表面附生菌的物种丰富度无显著性影响。这一观点在研究其他褐藻物种, 如: Saccharina latissima[32]和巨藻(Macrocystis pyrifera)[33]中也有相似的报道。相关研究已表明海带表面的微生物群落受时空变化的影响大于受疾病的影响[34], 并且海藻的养殖条件是导致其群落结构差异的主要因素[35]。因此, 海带样本采集的地点和时机对细菌群落总体的影响强于藻体的健康状态。从多样性指数也可以发现, 患病海带附生菌群落多样性指数的标准差都很高, 表明海带中某些特定的细菌发生了较大的变化, 这说明造成海带感染疾病的原因很大程度上是由于少数细菌类群数量的变化所导致的。
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图8 海带和海水关键细菌OTUs相对丰度的比较绿色、红色、蓝色、灰色条分别表示健康海带、患病海带、健康海带养殖区海水、患病海带养殖区海水.柱形图上方字母不同表示差异显著(P<0.05). Fig. 8 Comparisons of the relative abundance of OTUs of kelp Saccharina japonica and seawaterGreen, red, blue, and grey bars indicate healthy kelp, diseased kelp, seawater from healthy kelp breeding areas, and seawater from diseased kelp breeding areas, respectively. Different letters on the top of the columns indicate significant differences (P<0.05). |
通过SIMPER分析, 海带中4个关键OTUs的丰度差异显著, 其中属于黄杆菌科的OTU1169和OTU1111的相对丰度最高, 这也提示黄杆菌科与海带感染病害有密切的联系。然而, 也有研究认为黄杆菌科是海带潜在的抗菌资源, 具有抗微生物活力[36], 微生物中的黄杆菌还能够释放形态发生素, 促进石莼(Ulva mutabilis)的形态建成[37]。由此推断, 海带附生菌中大量存在的黄杆菌科可能在对抗病害发生的过程中发挥了拮抗作用, 是诊断海带是否感染疾病的主要指示菌。与此同时, 目前大多数与养殖生物健康状态相关的细菌类群, 也在海水中被发现[38-39], 海水中丰度变化明显的细菌群落也可以反映出养殖生物的健康状态[40-41]。在本研究中, 海水中的细菌群落也出现了组成结构的变化, 主要为特定OTUs (OTU1407、OTU1743、OTU1476和OTU1674)的丰度变化。因此, 海水中显著变化的细菌类群可以作为海带健康状况的诊断指标。
在本研究中, 海带附生菌群落组成的变化与藻体健康状态密切相关, 其中以黄杆菌科最为明显, 养殖海区海水中的细菌群落结构变化也是如此。本研究结果揭示了暂养期海带苗种病害的发生与海带和海水中微生物群落之间的关系, 海带样本中的4个OTUs和海水样本中的4个OTUs可能是评估海带健康状态的潜在指标, 可以作为诊断海带是否感染病害的指示菌。然而, 为了建立用于精准防控海带病害发生的检测技术, 在今后的研究中仍需要开展附生菌株系的分离和培养, 并进行体内抗菌试验, 以便于清晰地阐明这些菌株对海带疾病发生和健康生长的重要作用。
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