2021, Vol. 28 
表1(Table 1)
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071
3. 浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江 舟山 316022
4. 江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005
5. 中国水产科学研究院长岛增殖实验站，山东 烟台 265800
2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
3. National Engineering Research Center For Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China
4. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China
5. Changdao Enhancement and Experiment Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, 265800, China
无脊椎动物的性别类型和表现形式相对脊椎动物表现得更加丰富多彩，其性别决定呈现原始性、多样性和可塑性。双壳贝类是一类具有多种繁殖策略的软体动物，有雌雄异体型，雌雄同体型，不少种类还存在性逆转现象[1-5]。尽管已经对双壳贝类性别分化进行了大量研究，但仍没有明确证据表明这些动物存在性染色体[6]，也没有相应的模式物种来展示性别形成的过程。双壳贝类隶属低等动物，其性别决定往往受相关基因和环境因素的共同影响[6]。
Dmrt (double-sex and mab-3 related transcription factor，双性和mab-3相关转录因子)是一类编码与性别决定相关的转录因子的基因家族，最早发现于果蝇(Drosophila melanogaste)中[7]，其编码的蛋白含有一个DM结构域，可通过锌指方式结合特异性的DNA片段[8]，与动物的性别分化和胚胎发育等密切相关。Dmrt1是Dmrt基因家族的主要成员。近年来, Dmrt1基因的研究在脊椎动物中较多，特别是在鱼类[9-15]、爬行类[16-17]、哺乳类 [18]中，而有关无脊椎动物的研究相对较少。郭鹏飞等[19]证明Dmrt1参与了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)早期的性腺发育。胡芳琴[20]发现池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)Dmrt1基因在精子形成和性别调控中起重要作用，这个结果与Hong等[21]的研究结果一致，即Dmrt1参与调节脊椎动物性腺发育的过程，调控了下游基因的表达。Li等[22]证实Dmrt1在精细胞和卵细胞中均被检测到，且在雄性生殖细胞中的含量大于雌性生殖细胞。由此可见, Dmrt1在贝类性别分化中起着关键性的作用。虾夷扇贝是我国北方扇贝养殖业结构调整及辅助发展的重要养殖品种。近些年来，利用养殖贝类中雌雄同体构建自交家系改良品种已在科研人员中达成共识，但有关贝类性别分化分子机制的研究还不透彻。通过虾夷扇贝性腺转录组的WGCNA分析，我们构建了虾夷扇贝性别分化的遗传通路，初步推断虾夷扇贝Dmrt1是调控其性别分化的关键基因[23]。为进一步探讨虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis) Dmrt1基因(PyDmrt1)在性别分化中的作用，本研究采用荧光定量 qRT-PCR 和原位杂交技术ISH确定了虾夷扇贝Dmrt1基因在性腺中的表达特征，旨在充实完善Dmrt1基因性别分化调控的基础资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用2龄虾夷扇贝于2019年10月至2020年6月购自烟台长岛生鲜市场，体重为(73.34±20.5) g。取部分扇贝性腺组织，液氮速冻后存于-80 ℃冰箱用于RNA提取和组织分布检测。另取部分性腺组织浸入原位杂交固定液(Servicebio，中国)中。组织切片法结合性腺组织涂片法鉴定性别。
1.2 总RNA提取和PyDmrt1的cDNA合成采用Trizol法(Solarbio，中国)提取虾夷扇贝性腺总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, Wilmngton，美国) 检测其纯度与浓度，选取OD260/280的值在1.90~2.2范围、RNA浓度大于800 ng/μL的样本进行反转录。RNA鉴定合格后，采用HiScript IIIRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme，中国)并参照说明书合成cDNA。-20 ℃保存。
1.3 PyDmrt1基因的生物学分析从虾夷扇贝转录组数据分析获得的基因编码序列(登录号: KP79_PYT09461)命名为PyDmrt1。
采用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)确定PyDmrt1的开放阅读框。在线分析软SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/ set_mode.cgi?NORMAL=1)预测结构和功能域。使用SignalP 5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测PyDmrt1蛋白的信号肽，并使用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜区域。使用BLAST程序(https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对PyDmrt1进行碱基同源性分析并进行蛋白质序列相似性搜索。通过Jalview比对来自不同种类Dmrt1的序列，并使用MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining(NJ)方法构建PyDmrt1系统发育树。
1.4 半定量RT-PCR根据所获得的PyDmrt1 mRNA转录本序列，设计半定量(semi-quantitative) RT-PCR引物Dmrt1-F和Dmrt1-R (表1)。以虾夷扇贝生长期的cDNA为模板，使用2×Taq Master Mix for PAGE试剂盒(Vazyme，中国)对目的基因进行PCR扩增。反应条件为95 ℃ 3 min (预变性); 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s (退火)，循环35次; 72 ℃ 5 min (彻底延伸)。扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因条带。
1.5 荧光定量根据开放阅读框框ORF (open reading frame)区设计PyDmrt1定量 qRT-PCR 引物: QDmrt1-F和QDmrt1-R(表1)。使用β-actin基因[24]作为内参基因校正cDNA模板(表1)。
分别以虾夷扇贝不同发育时期的性腺、鳃cDNA和增殖期雌性和雄性的鳃cDNA为模板对目的基因进行扩增。使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme，中国)按照下列参数配置qPCR反应液体系: 2×ChamQ STBR Color qpcr master Mix 10 μL; 上下游引物各0.4 μL; cDNA模板2 μL; 50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL; 灭菌蒸馏水6.8 μL。反应条件为: 95 ℃ 30 s (预变性); 95 ℃ 10 s; 60 ℃ 30 s (退火); 循环40次; 在StepOnePlusTM(America)进行qPCR反应。本实验采取$\［{2^{--\Delta \Delta {C_t}}}$法计算PyDmrt1基因的相对表达量。实验数据输入Prism 5和SPSS 26.0进行单因素方差分析和多重比较, P<0.05 表示差异显著。
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表1 本实验所用引物 Tab. 1 Primers used in the experiment |
原位杂交探针设计由武汉赛维尔生物科技有限公司设计，阳性探针YDmrt1: 5ʹ-GGCGGCGU CUAUCUUUCCUAUGGUCUUC-3ʹ。取部分性腺组织切成2 mm左右的厚度，用灭菌的镊子置于原位杂交液中常温固定24 h用于切片原位杂交。正式原位杂交步骤如下: 固定的组织经石蜡切片后依次放入二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min、DEPC水洗。用胃蛋白酶处理使靶核酸片段暴露，预杂交缓冲液(不含探针和硫酸葡聚糖)37 ℃孵育1 h，接着滴加含探针的杂交液55 ℃杂交过夜，进行非特异结合探针的洗脱和残余 RNA 的消化后，用BSA (Bovine Serum Albumin)封闭非特异性抗体1 h，滴加鼠抗地高辛标记488 (anti-DIG-488)进行抗体孵育37 ℃ 40 min，洗涤，最后显色液(DAPI)进行显色，于尼康正置荧光显微镜(Japan)下观察并采集图像。
2 结果与分析 2.1 PyDmrt1序列分析生物信息学分析结果显示, PyDmrt1 ORF序列长918 bp，编码306个氨基酸。存在保守的DM结构域(49~189 bp); DM结构域存在一个核定位信号序列(nuclear localization signal sequence) KGHKR(图1)。PyDmrt1蛋白无信号肽，不存在明显的跨膜区域。因此推测其为一个胞内蛋白，不属于膜蛋白。
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图1 虾夷扇贝Dmrt1与其他物种的同源性序列比对物种NCBI登录号: 虾夷扇贝(XP_021353714.1); 欧洲大扇贝(XP_033733655.1); 斑马鱼(AAN61060.1); 方格星虫 (QGP74528.1). 横线为DM结构域，方框内为核定位信号序列. Fig. 1 Dmrt1 homologous sequence alignment between Patinopecten yessoensis and other speciesSpecies NCBI login No.: Patinopecten yessoensis (XP_021353714.1); Pecten maximus (XP_033733655.1); Danio rerio (AAN61060.1); Sipunculus nudus (QGP74528.1). The horizontal line is the DM domain, and the box is the nuclear localization signal sequence. |
从NCBI数据库里选择4个Dmrt1代表性物种的氨基酸序列进行同源比对分析，结果发现虾夷扇贝与欧洲大扇贝(P. maximus)的相似性最高，为79%。图中画横线处为保守的DM结构域，红色方框为核定位信号序列(图1)。
为了解Dmrt1在不同物种中的进化关系，使用MEGA 7.0软件的Neighbor-joining 法对17个物种构建系统进化树，结果显示脊椎动物聚为一支，无脊椎动物软体动物聚为一支。其中虾夷扇贝先与栉孔扇贝(Chlamys farreri)、欧洲大扇贝等聚为一支，这显示它们的亲缘关系较近，形成的独立分支再与三角帆蚌(H. cumingii)聚为一支。PyDmrt1在系统进化树中的分子生物学进化地位与虾夷扇贝在生物学分类地位是相符的(图2)。
2.3 PyDmrt1在各组织中的表达RT-PCR分析PyDmrt1在生长期不同组织中的表达。结果显示，在外套膜、闭壳肌、肾、鳃中都可检测到少量PyDmrt1转录本的存在，但在肝胰腺中未见表达。PyDmrt1在精巢中的表达量最高，其表达量显著高于卵巢(图3)。
2.4 PyDmrt1在2龄虾夷扇贝性腺发育不同时期的相对表达量qRT-PCR 结果表明, PyDmrt1的表达量在雄性性腺的生长期和成熟期中存在显著性差异(P<0.05)，雄性个体的表达量显著高于雌性; 而在排放期无显著性差异(P>0.05, 图4)。通过对性腺处于不同发育时期的大量个体开展PyDmrt1基因的表达量分析，构建了该基因在虾夷扇贝性腺发育的时空表达模型，发现PyDmrt1在雌性性腺发育的不同时期一直处于低水平状态，且无明显变化(图5)。
2.5 PyDmrt1 mRNA在虾夷扇贝性腺组织中的细胞学定位原位杂交结果显示, PyDmrt1定位于所有细胞的细胞质。在卵巢中，与阴性对照组相比, PyDmrt1 mRNA在各时期的性腺分化细胞中均检测到阳性信号，但其表达量没有明显的变化(图6A1~图6A4)。在精巢中，与阴性对照组相比, PyDmrt1在精原和精母细胞中的表达呈阳性，精细胞因为细胞质的缺失，原位杂交检测不到PyDmrt1 mRNA (图6 B1~图6B4)。
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图2 不同物种Dmrt1蛋白系统进化分析括号中为物种NCBI登录号. Fig. 2 Phylogenetic analysis of Dmrt1 protein from different speciesSpecies NCBI login number are shown in bracket. |
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图3 虾夷扇贝Dmrt1基因在不同组织中的表达1. DL 2000 marker; 2. 去离子水; 3. 外套膜; 4. 闭壳肌; 5. 肝胰腺; 6. 肾; 7. 鳃; 8. 卵巢; 9. 精巢. Fig. 3 The expression of Dmrt1 gene in differenttissues of Patinopecten yessoensis1. DL 2000 marker; 2. Pure water; 3. Mantle; 4. Adductor muscle; 5. Hepatopancreas; 6. Kidney; 7. Gill; 8. Ovary; 9. Testis. |
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图4 PyDmrt1在虾夷扇贝雌雄性腺发育不同时期的相对表达量对比不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 4 The relative expression comparison of PyDmrt1 at different stages between female and male Patinopecten yessoensis gonadsDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). |
05-0541-09-F005.jpg "点击查看原图") |
图5 PyDmrt1在虾夷扇贝性腺发育的时空表达模型 Fig. 5 The expression pattern of PyDmrt1 in gonadaldevelopment of Patinopecten yessoensis |
经组织切片鉴定性别之后，从性腺发育各期中随机选取3个个体鳃组织的qRT-PCR，结果表明, PyDmrt1在雌性性腺发育不同时期鳃组织中的表达无显著性差异(P>0.05)，但在雄性成熟期和排放期的表达量显著高于增殖期(P<0.05); 在增殖期，雌性鳃组织的表达量高于雄性(图7)。为进一步验证PyDmrt1在增殖期鳃组织中的表达是否存在性别差异，本研究又随机挑选增殖期雌雄各5个个体进行qRT-PCR分析，结果发现，增殖期雌性鳃组织PyDmrt1基因相对表达量为0.3381± 0.3765，雄性相对表达量为0.4885±0.4268，雌性和雄性表达无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论本研究分析了PyDmrt1的序列，发现其含有Dmrt基因家族的DM保守结构域序列特征。 DM结构域包含6 个半胱氨酸(C)和 2 个组氨酸(H)形成的锌指结构，还有一个核定位信号序列KGHKR，该序列可与特定的 DNA 序列结合, Li等[22]认为Dmrt1的DM结构域参与了虾夷扇贝性别决定的过程。还有研究表明, Dmrt1蛋白以和importin-β1结合的方式运入细胞核内。核定位信号序列的突变不能有效地将Dmrt1蛋白和 importin-β1结合，导致Dmrt1无法进入到细胞核内，从而对其调控下游基因的表达产生影响[24]。据此验证了笔者的推测，即PyDmrt1是一个胞内蛋白。
不同组织分布检测发现，虾夷扇贝Dmrt1基因在性腺中的表达量显著高于其他组织。在肾组织中有少量的PyDmrt1表达。这与周丽青等[25]研究结果一致，即通过生殖腺组织学观察发现，成熟的精卵皆从肾外孔排出体外，这也是肾组织含有少量PyDmrt1转录本的原因。鳃、外套膜和闭壳肌的生理位置相近, PyDmrt1通过血液流通，可在这些组织中检测到少量的PyDmrt1转录本。为进一步验证Dmrt1是性腺发育和生殖细胞分化相关基因，且保证实验对象存活以验证性别，本研究剪取少量鳃组织进行荧光定量分析。研究发现，鳃组织PyDmrt1在性腺发育各期中的表达没有显著性差异，而且与性别也无明显相关性。以上研究结果从侧面验证了PyDmrt1是一个仅与性腺发育密切相关的基因。
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图6 PyDmrt1在虾夷扇贝性腺发育不同时期的细胞学定位A: 卵巢; B: 精巢. 1. 增殖期; 2. 生长期; 3. 成熟期; 4. 阴性对照. Mo: 成熟卵; Oc: 卵母细胞; Og: 卵原细胞; Sc: 精母细胞; Sg: 精原细胞; St: 精细胞; Sz: 精子. 标尺: 50 μm. Fig. 6 Cytological localization of PyDmrt1 at different stages of gonadal development in Patinopecten yessoensisA: ovary; B: testis. 1. Proliferation stage; 2. Growing stage; 3. Mature stage; 4. Negative control. Mo: mature eggs; Oc: oocyte; Og: oogonium; Sc: spermatocyte; Sg: spermatogonium; St: sperm cells; Sz: sperm. Scale bar: 50 μm. |
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图7 PyDmrt1在虾夷扇贝雌雄性腺不同发育时期鳃组织中的表达不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig.7 The expression of PyDmrt1 in female and male Patinopecten yessoensis gill tissues at different gonadal development stagesDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). |
通过qRT-PCR和原位杂交技术初步揭示其在性腺不同发育时期中的表达模式与已报道的大部分物种的特征基本一致。在虾夷扇贝性腺发育不同时期的组织分布检测中, PyDmrt1在性腺发育不同时期都有表达，但不同性别间及各发育时期的表达水平存在差异。在性腺发育的生长期和成熟期阶段, PyDmrt1在精巢的表达量显著高于卵巢，这个结果与栉孔扇贝(C. farreri)[26]和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[27]研究结果一致，说明PyDmrt1确实参与了雄性性腺发育的调控，是雄性特有的性别分化的关键基因。然而，该基因在卵巢不同时期的表达量并未随着性腺的发育周期出现明显的规律性变化，而是一直处于低水平的表达，这和本课题组在虾夷扇贝生殖腺转录组WGCNA分析中的结果[23]是一致的，说明Dmrt1是虾夷扇贝雄性特有的性别分化的关键基因，但决定生殖细胞分化为雌雄的有可能不是Dmrt1，推测其上游还有更加关键的基因尚未被发现，有待进一步研究。
本研究中, Dmrt1基因在不同发育时期生殖腺细胞中的定位结果与荧光定量的结果是一致的。该基因分布在早期的雄性生殖细胞和所有时期的雌性生殖细胞中，这与其他双壳贝类中的观察结果一致[20,24]，这一定位特点与已报道的在小鼠[29]中的研究结果也很相似。此外，雄性性腺滤泡腔内的精原和精母细胞中强阳性信号，表明该基因参与了精子的形成过程[30]。综上所述，本研究进一步证实PyDmrt1是虾夷扇贝精巢发育和性别分化过程中的一个关键基因。
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