生物多样性调查监测是生物多样性研究、保护和管理的基础^［1-5］。大型河流是全球水生生物多样性的关键区域, 随着人类对水资源的开发、内河航运的发展以及沿江沿河人类活动的增强, 水生态系统面临越来越大的退化压力, 水生生物多样性也面临着越来越大的危机^［6-12］。为了支撑、推动和落实大河流域的水生生物保护, 科学监测和评估大型河流中的水生生物(尤其是鱼类)组成和资源至关重要^［13］。当前的鱼类监测评估主要依赖于传统的捕捞监测和水声学监测, 其中捕捞监测往往限于人力和资源, 调查站位布局空间密度较低, 调查结果往往也是依靠一段时间调查数据的积累, 调查结果的时空分辨率、时效性、费效比都较低^［14-15］。水声学监测可以给出较高时空分辨率和时效性的结果^［16-17］, 但截至目前只对少数鱼类有水声学种类识别的研究^［18-20］, 在实际调查监测中对大多数鱼类种类都还无法进行水声学识别^［16-17］。因此, 急需新的有效的在大型河流中可用的监测技术、监测方案的补充和介入。

eDNA宏条形码(environmental DNA metabarcoding)技术为水生生物监测评估提供了一种新的技术和方案^［21-25］。所有生物都会在其生存环境中留下其DNA痕迹, 从水体、沉积物、土壤、混合物等环境样品中直接提取DNA, 利用宏条形码和高通量测序技术对其进行定性或定量分析, 可以高效率地实现非接触、无损伤的多物种(或高级分类单元)监测^{［22-23,25-28］}。目前有大量研究已经探讨了eDNA监测的时间限^［29-31］、空间限^{［25,32-33］}, 并且有越来越多的研究确认eDNA对物种组成的监测效率比传统捕捞监测的效率高^［34-38］。但对大型河流中水生生物的eDNA监测效率, 即单eDNA样品的物种组成检出能力, 鲜见相关定量研究。

长江是世界第三长河, 是典型的大型流水水体, 也是对中国经济社会发展贡献最大的一个淡水生态系统。随着经济社会发展需要, 人类活动对长江生态系统的影响逐渐增大并积累, 导致了长江生态环境退化、长江鱼类种群衰减和物种丧失等问题^{［11-12,39-41］}, 为此, 中国政府提出长江大保护战略, 并逐步实施长江禁捕政策^［42-45］。为支撑长江大保护相关具体管理决策和长江“十年禁渔”效果评估, 急需探索建立长江水生生物eDNA监测技术体系。

为了给大型河流中水生生物的eDNA监测技术体系建设提供支持, 呼应长江水生生物eDNA监测的探索需求, 本研究以长江为大型河流的代表, 以鱼类为水生生物的代表, 基于前人的研究成果, 在长江武汉江段针对大型河流中鱼类组成的eDNA监测效率开展定量研究。2020年9月份, 本研究在长江武汉江段针对鱼类组成并行开展了传统捕捞监测和eDNA监测, 为了聚焦科学问题——单eDNA样品的物种组成检出能力, 本研究eDNA监测只分析一对引物的检出结果, 传统捕捞监测只统计一种网具的捕捞渔获。通过eDNA监测结果与传统捕捞监测结果的比较分析, 探讨eDNA监测大型河流中鱼类组成的检出能力、检出效率、平行样设置等问题。

2020年9月12—28日期间, 在长江中游干流武汉市新洲区双柳镇江段左岸长约2000 m, 宽约600 m的作业区域, 中心坐标北纬30°34′14″, 东经114°38′36″, 并行开展了捕捞监测(15 d)和eDNA监测(13 d)。监测期间, 水温在23.1~26.2 ℃间, 参考水文站汉口站的监测水位在24.24~25.24 m之间, 监测流量在36300~44800 m³/s之间。

捕捞网具为高3 m, 宽400 m的2.5指流刺网, 每天捕捞2~3网次, 共37网次。所捕获全长超过50 cm的常见鱼类物种活个体, 经全长、体长、体重测量后放归, 其他捕获个体放入冰浴泡沫箱保低温, 带回实验室进行物种辨识、个体测量、解剖采样等相关室内作业。对每天捕捞监测到的物种组成进行分析, 统计本次捕捞监测到的物种组成, 统计监测逐日累计物种数, 用EstimateS (Version 9.1.0, Copyright R. K. Colwell: http://purl. oclc.org/estimates)计算监测结果的物种积累曲线。基于物种积累曲线计算每增加1 d捕捞监测所增加的新物种记录数, 对新物种记录数对监测天数进行指数回归, 估算随着捕捞监测天数增加所可能达到的最大物种数。统计单天监测的监测效率, 估算检出80%、90%和95%的物种所需的监测天数。对本次捕捞监测的渔获物结构进行分析, 计算各物种总的数量占比和重量占比。

在每天捕捞监测最后一网次捕捞下网后进行流网时, 用无菌采样瓶采集上层水水样1.5 L。在正式采集水样并封装之前, 用所要采的水涮洗3次。所采集的水样封装好之后放入冰浴泡沫箱(独立于渔获物的专设冰浴泡沫箱)保低温, 带回实验室用0.2 μm孔径滤膜进行抽滤(采样后12 h内处理完毕), 获得存留了eDNA的滤膜, 放入50 mL无菌离心管, 用自封袋装好, -80 ℃冰箱保存, 置于泡沫箱干冰浴运输。

用试剂盒［DNeasy PowerWater Kit (QIAGEN, Germany)］按照操作规范流程对留存eDNA的滤膜进行处理, 提取eDNA。用线粒体CO I基因的宏条形码(引物mlCOIintF/jgHCO2198R)进行PCR 扩增^［46-47］。PCR反应体系为: 5×TransStart FastPfu 缓冲液4 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL, 下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL, BSA 0.2 μL, 模板DNA 10 ng, ddH₂O补足至20 μL。每个样本3个重复。PCR扩增程序如下: 96 ℃ 预变性5 min, 35个循环(95 ℃变性 60 s, 47 ℃ 退火120 s, 72 ℃延伸 60 s), 然后72 ℃稳定延伸5 min, 最后在4 ℃进行保存(PCR仪: ABI GeneAmp® 9700型)。PCR扩增产物在提取、纯化、定量之后在Illumina Miseq平台加标准接头进行建库测序, 获得DNA序列数据(上海美吉生物医药科技有限公司)。

测序所得的序列结果在美吉生物云平台(www.majorbio.com)上进行质控、拼接(用FLASH)、OTU聚类(用UPARSE, 99%的序列相似度)、物种注释(采用RDP classifier贝叶斯算法, 比对NCBI核酸序列数据库, 97%的分类置信度), 获得每份样品所监测到的物种组成及其相对丰度。统计本次eDNA监测到的鱼类物种组成, 统计监测逐个样品累计物种数, 用EstimateS (Version 9.1.0, Copyright R. K. Colwell: http://purl.oclc.org/ estimates)计算监测结果的物种积累曲线。基于物种积累曲线计算每增加一个eDNA监测所增加的新物种记录数, 对新物种记录数和监测样品个数进行指数回归, 估算随着监测样品个数增加所可能达到的最大物种记录数。统计单个eDNA监测的监测效率, 估算检出80%、90%和95%的物种所需的监测样品个数。统计分析本次eDNA监测到的各鱼类物种的相对丰度。

本次捕捞监测捕捞量为平均每天每船70尾、16.5 kg, 每天记录到鱼类12~20种。15 d调查累计记录到35种鱼类, 隶属5目、6科(表1), 基于物种积累曲线估算捕捞监测的最大鱼类物种记录数为37种(最优估值), 单天捕捞监测的物种监测能力为(15.8±1.7)种, 监测效率为(42.7±4.6)%, 要达到80%、90%和95%以上的物种检出度分别至少需要监测8船∙天、12船∙天、16船∙天(图1)。本次监测的渔获物中数量以短颌鲚最多, 占渔获物总数的20.9%; 其次为麦瑞加拉鲮, 占渔获物总数的12.8%; 而后依次是达氏鲌、银鲴、翘嘴鲌、鲢、黑尾近红鲌等。重量以鳙最多, 占渔获物总重的19.1% (因捕到了1尾13875 g的大个体); 其次为草鱼, 占渔获物总重的14.6%; 然后是鲢, 占渔获物总重的11.3%; 再然后依次是麦瑞加拉鲮、鲤、翘嘴鲌等(表1)。

eDNA监测单个样品记录到鱼类物种20~40种, 13个样品累计记录到89种鱼类, 隶属28目、55科(表2) (部分鱼类因序列比对物种注释存在问题而未被记录), 基于物种积累曲线估算eDNA监测的最大鱼类物种记录数为99种(最优估值), 单样eDNA监测的物种监测能力为(25.5±4.7)种, 监测效率为(25.8±4.8)%, 达到80%、90%和95%的物种检出度分别需要10个、13个、17个样品(图2)。本次eDNA监测得到的各鱼类物种的相对丰度以草鱼最大, 占比达47.9%; 其次为银鲴, 占比为15.9%; 而后是鲢和黑尾近红鲌, 占比分别为6.7%和6.3% (表2)。

本次eDNA监测调查了13个eDNA样品, 用线粒体CO I基因宏条形码(引物mlCOIintF/ jgHCO2198R)共检出89种鱼类, 隶属28目、55科。其中有30种由历史捕捞调查结果所确认(图3)^［41］, 由此可以确认其为正确识别结果。另外59种可能在序列比对物种注释中存在问题, 这个问题有望随着相关数据库的逐步完善而得以解决^［48］。当前也可以根据已知知识和证据对部分物种注释进行订正, 比如长江自然水域中截至目前未捕捞监测到西伯利亚鲟, 但捕捞监测到了养殖逃逸进入长江的杂交鲟, 所以推测eDNA监测注释到的西伯利亚鲟大概率是来自杂交鲟eDNA信号, 类似情况还有eDNA监测注释到的鲤亚口鱼可能是长江珍稀鱼类胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)的eDNA信号, eDNA监测注释到的兰格氏副齿脂鲤可能是养殖引种后逃逸到长江自然水体的短盖巨脂鲤(Colossoma brachypomus)(2019年在洞庭湖的自然水域、2020年在鄱阳湖的自然水域均有记录)的eDNA信号等(表2)。

图1

图1 　捕捞监测的物种记录数(a)和物种积累曲线(b) Fig. 1 The number of recorded fish species in fishing monitoring (a) and its species accumulation curve (b)

表1

表1 　捕捞监测的渔获物尾数比和重量比 Tab. 1 Proportion of number and weight of each species in fishing survey 物种species 拉丁名 scientific name 尾数比/% proportion of number 重量比/% proportion of weight 短颌鲚 Coilia brachygnathus 20.85 3.46 麦瑞加拉鲮 Cirrhhina mrigala 12.80 6.74 达氏鲌 Chanodichthys dabryi 7.47 3.31 银鲴 Xenocypris argentea 7.27 3.30 翘嘴鲌 Culter alburnus 7.08 6.16 鲢 Hypophthalmichthys molitrix 5.72 11.32 黑尾近红鲌 Ancherythroculter nigrocauda 5.53 2.59 铜鱼 Coreius heterodon 4.95 2.98 鲇 Silurus asotus 4.36 5.51 鲂 Megalobrama skolkovii 4.07 1.01 粗唇鮠 Leiocassis crassilabris 3.01 1.58 长吻鮠 Leiocassis longirostris 2.42 2.54 草鱼 Ctenopharyngodon idellus 1.84 14.60 蒙古鲌 Chanodichthys mongolicus 1.84 1.71 鳙 Aristichthys nobilis 1.75 19.11 鲤 Cyprinus carpio 1.36 6.57 瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachellii 1.36 0.51 鳊 Parabramis pekinensis 1.07 1.15 长蛇鮈 Saurogobio dumerili 0.97 0.60 大口鲇 Silurus meridionalis 0.58 0.29 光泽黄颡鱼 Pelteobagrus nitidus 0.58 0.13 鲫 Carassius auratus 0.48 0.14 飘鱼 Pseudolaubuca sinensis 0.48 0.20 鳜 Siniperca chuatsi 0.39 0.15 鳡 Elopichthys bambusa 0.29 0.40 拟尖头鲌 Culter oxycephaloides 0.29 0.26 青鱼 Mylopharyngodon piceus 0.29 2.54 杂交鲟   0.19 0.78 斑鳜 Siniperca scherzeri 0.10 0.03 赤眼鳟 Squaliobarbus curriculus 0.10 0.23 鲮 Cirrhinus molitorella 0.10 0.04 蛇鮈 Saurogobio dabryi 0.10 0.00 似鳊 Pseudobrama simoni 0.10 0.00 团头鲂 Megalobrama amblycephala 0.10 0.01 刀鲚 Coilia ectenes 0.10 0.05

表1 　捕捞监测的渔获物尾数比和重量比 Tab. 1 Proportion of number and weight of each species in fishing survey

图2

图2 　eDNA监测的物种记录数(a)和物种积累曲线(b) Fig. 2 The number of recorded fish species in eDNA monitoring (a) and its species accumulation curve (b)

表2

表2 　eDNA监测的各物种eDNA相对丰度 Tab. 2 The relative richness of each species in eDNA monitoring 目order 科 family 物种 species 中文注释说明 annotation 相对丰度% relative richness Cypriniformes Xenocyprididae Ctenopharyngodon idella 草鱼* 47.91 Cypriniformes Xenocyprididae Xenocypris argentea 银鲴* 15.94 Cypriniformes Xenocyprididae Hypophthalmichthys molitrix 鲢* 6.72 Cypriniformes Xenocyprididae Ancherythroculter nigrocauda 黑尾近红鲌* 6.32 unclassified_Actinopteri Sphyraenidae Sphyraena acutipinnis 尖鳍魣, 魣科 2.33 Osteoglossiformes Mormyridae Petrocephalus simus 岩头鱼, 象鼻鱼科 1.92 Siluriformes Siluridae Silurus meridionalis 大口鲇* 1.80 Cypriniformes Xenocyprididae Hypophthalmichthys nobilis 鳙* 1.76 Pleuronectiformes Cynoglossidae Symphurus thermophilus 蜇栖无线鳎, 舌鳎科 1.59 Siluriformes Bagridae Leiocassis longirostris 长吻鮠* 1.57 Cypriniformes Xenocyprididae Squaliobarbus curriculus 赤眼鳟* 1.43 Cypriniformes Cyprinidae Cyprinus carpio 鲤* 0.97 Cypriniformes Cyprinidae Cirrhinus mrigala 麦瑞加拉鲮* 0.82 Stomiiformes Diplophidae Triplophos hemingi 三钻光鱼, 双光鱼科 0.73 Gobiiformes Gobiidae Eviota zonura 绿带矶塘鳢, 虾虎鱼科 0.59 Cypriniformes Xenocyprididae Mylopharyngodon piceus 青鱼* 0.52 Gobiesociformes Gobiesocidae Lepadichthys frenatus 连鳍喉盘鱼, 喉盘鱼科 0.49 Siluriformes Bagridae Pseudobagrus albomarginatus 白边拟鲿* 0.42 Cypriniformes unclassified Cypriniformes Megalobrama terminalis or Culter alburnus 三角鲂* (或翘嘴鲌) 0.40 Aulopiformes Paralepididae Lestidium prolixum 长裸蜥鱼, 魣蜥鱼科 0.38 Uranoscopiformes Pinguipedidae Parapercis flavipinna 黄鳍金枪鱼, 肥足鰧科 0.36 Siluriformes Siluridae Silurus asotus 鲇* 0.31 Cypriniformes Gobionidae Coreius heterodon 铜鱼* 0.26 Pempheriformes Glaucosomatidae Glaucosoma buergeri 叶鲷, 叶鲷科 0.26 Perciformes Nototheniidae Patagonotothen tessellata 短吻南美南极鱼, 南极鱼科 0.24 Perciformes Zoarcidae Pachycara sp. MOP110593 壮绵鳚属, 绵鳚科 0.24 Labriformes Labridae Thalassoma lutescens 胸斑锦鱼, 隆头鱼科 0.23 Cypriniformes Xenocyprididae Parabramis pekinensis 鳊* 0.23 Cypriniformes Xenocyprididae Culter alburnus 翘嘴鲌* 0.20 Cypriniformes Xenocyprididae Culter oxycephaloides 拟尖头鲌* 0.19 Siluriformes Loricariidae Schizolecis guntheri 冈瑟氏裂盘鲶, 甲鲶科 0.19 Clupeiformes Engraulidae Coilia brachygnathus 短颌鲚* 0.16 Cypriniformes Xenocyprididae Chanodichthys mongolicus 蒙古鲌* 0.14 Cypriniformes Catostomidae Carpiodes carpio 鲤亚口鱼，亚口鱼科 0.13 Siluriformes Aspredinidae Pterobunocephalus depressus 丘鲇, 疣体鲇科 0.11 Cypriniformes Xenocyprididae Elopichthys bambusa 鳡* 0.11 Cypriniformes Xenocyprididae Pseudolaubuca sinensis 飘鱼* 0.10 Acipenseriformes Acipenseridae Acipenser baerii 西伯利亚鲟, 鲟科 0.09 Gobiiformes Gobiidae Gobiosoma bosc 薄氏鮈虾虎鱼, 虾虎鱼科 0.08 Gobiiformes Gobiidae Odontamblyopus rubicundus 红狼牙虾虎鱼* 0.08 Syngnathiformes Callionymidae Repomucenus filamentosus 斜棘䲗属, 䲗科 0.08 Cypriniformes Danionidae Opsarius barna 巴納低線鱲,亚科 0.07 Cypriniformes Gobionidae Squalidus argentatus 银鮈* 0.07 Cypriniformes Cyprinidae Carassius auratus or Megalobrama  amblycephala or Carassius cuvieri 鲫* (或团头鲂, 白鲫) 0.06 Perciformes Psychrolutidae Cottunculus microps 极地隐棘杜父鱼, 隐棘杜父鱼科 0.06 Siluriformes Bagridae Pseudobagrus brevicorpus 短体拟鲿, 鲿科 0.06 Siluriformes Loricariidae Harttia loricariformis 哈氏甲鲶, 甲鲶科 0.06 Aulopiformes Synodontidae Synodus sp. 1 BOLD-2019 狗母鱼属, 狗母鱼科 0.06 Perciformes Zoarcidae Zoarces gillii 吉氏绵鳚, 绵鳚科 0.06 Siluriformes Bagridae Tachysurus nitidus 光泽黄颡鱼* 0.06 Chaetodontiformes Chaetodontidae Heniochus singularius 四带马夫鱼, 蝴蝶鱼科 0.05 Cyprinodontiformes Poeciliidae Gambusia affinis 食蚊鱼* 0.05 Cypriniformes Gastromyzontidae Pseudogastromyzon fasciatus 拟腹吸鳅, 腹吸鳅科 0.04 Cypriniformes Leuciscidae Tribolodon sachalinensis 玫瑰三齿雅罗鱼, 鲤科 0.04 Cypriniformes Xenocyprididae Pseudobrama simoni 似鳊* 0.04 Holocentriformes Holocentridae Myripristis jacobus 黑条锯鳞鱼, 鳂科 0.04 Lampriformes Regalecidae Regalecus glesne 皇带鱼, 皇带鱼科 0.04 Pleuronectiformes Pleuronectidae Pleuronichthys cornutus 木叶鲽, 鲽科 0.04 Syngnathiformes Mullidae Upeneus sulphureus 黄带绯鲤, 羊鱼科 0.04 Characiformes Bryconidae Brycon chagrensis 巴拿马啮脂鲤, 啮脂鲤科 0.03 Characiformes Serrasalmidae Serrasalmus elongatus 长身锯脂鲤, 锯脂鲤科 0.03 Clupeiformes Clupeidae Potamothrissa acutirostris 尖吻河棱鲱, 鲱科 0.03 Scombriformes Stromateidae Peprilus triacanthus 三刺低鳍鲳, 鲳科 0.03 Siluriformes Loricariidae Peckoltia simulata 梳钩鲶属, 甲鲶科 0.03 Carangiformes Carangidae Elagatis sp. BOLD:AAB3730 纺锤鰤属, 鲹科 0.02 Characiformes Characidae Deuterodon langei 兰格氏副齿脂鲤, 脂鲤科 0.02 Cypriniformes Danionidae Rasbora myersi 麦氏波鱼, 鲤科 0.02 Cypriniformes Xenocyprididae Hemiculter bleekeri 贝氏䱗* 0.02 Cyprinodontiformes Poeciliidae Xiphophorus birchmanni 剑尾鱼, 花鳉科 0.02 Gobiiformes Gobiidae Rhinogobius similis 真吻虾虎鱼, 虾虎鱼科 0.02 Pempheriformes Pempheridae Pempheris sp. LIDMA2395-15 单鳍鱼属, 单鳍鱼科 0.02 Perciformes Zoarcidae Lycodes diapterus 黑狼绵鳚, 绵鳚科 0.02 Siluriformes Plotosidae Cnidoglanis macrocephalus 大头荨麻鳗鲇, 鳗鲇科 0.02 Scatophagiformes Scatophagidae Scatophagus argus 金钱鱼, 金钱鱼科 0.02 Blenniiformes Tripterygiidae Enneanectes reticulatus 粗头岩游鳚, 三鳍鳚科 0.02 Centrarchiformes Centrarchidae Enneacanthus gloriosus 蓝点九棘日鲈, 太阳鱼科 0.02 Clupeiformes Clupeidae Gonialosa manmina 恆河多鳞鰶, 鲱科 0.02 Cypriniformes Gobionidae Saurogobio dabryi 蛇鮈* 0.02 Cypriniformes Nemacheilidae Tuberoschistura baenzigeri 朋氏瘤粒条鳅, 条鳅亚科 0.02 Cyprinodontiformes Goodeidae Goodea atripinnis 黑鳍谷鮰, 古德鳉科 0.02 Cyprinodontiformes Rivulidae Nematolebias whitei 怀氏线小鳉, 溪鳉科 0.02 Gobiiformes Gobiidae Amblyeleotris marquesas 钝塘鳢属, 虾虎鱼科 0.02 Gobiiformes Gobiidae Bathygobius geminatus 深虾虎鱼属, 虾虎鱼科 0.02 Lutjaniformes Lutjanidae Pterocaesio digramma 双带鳞鳍梅鲷, 梅鲷科 0.02 Perciformes Percidae Percina gymnocephala 裸首小鲈, 鲈科 0.02 Perciformes Serranidae Rypticus subbifrenatus 斑纹皂鲈, 鮨科 0.02 Siluriformes Amblycipitidae Amblyceps mangois 钝头鮠, 钝头鮠科 0.02 Siluriformes Chacidae Chaca bankanensis 班甘连尾鮡, 连尾鮡科 0.02 Spariformes Lethrinidae Lethrinus crocineus 印度洋裸颊鲷, 裸颊鲷科 0.02 注: 用星号*标注的物种为历史捕捞调查结果所确认的物种. Note: The species labeled with asterisk * was recorded in the historical traditional fishing survey.

表2 　eDNA监测的各物种eDNA相对丰度 Tab. 2 The relative richness of each species in eDNA monitoring

图3

图3 　eDNA监测识别的鱼类物种与捕捞调查记录的鱼类物种间的关系 Fig. 3 The relationship among the species lists of eDNA survey and fishing survey

eDNA监测调查对传统捕捞调查的物种记录具有较高的覆盖度, 并且这一覆盖度将随着相关数据库的完善而提高。本次15 d共37网次的2.5指流刺网捕捞调查监测累计记录到35种鱼类, 其中24种在eDNA监测中被识别, 即本次eDNA监测确切识别的物种组成对本次捕捞调查所记录到的物种组成的覆盖度为68.6%(图3)。2017—2020年长江渔业资源与环境调查中武汉江段共进行捕捞调查92船·天, 涉及多种网目的定置刺网、流刺网以及地笼, 累计记录到90种鱼类(数据来自“长江中游渔业资源与环境调查2017—2020年进展报告”, 未公开发表资料), 其中27种在本次eDNA监测中被识别, 覆盖度为30.0% (图3)。如果eDNA监测的物种未确认或错误注释问题随着相关数据库的完善而得以缓解, eDNA监测对传统捕捞调查所记录物种的覆盖度将会有相应提高。

基于物种积累曲线的估算, 2020年9月这个监测时段, 长江武汉新洲双柳镇江段水域用eDNA (线粒体CO1基因宏条形码)可监测的鱼类物种数为99左右, 单样品eDNA监测的鱼类物种检出能力为26种左右, 监测效率为25.8%左右, 达到80% (82个物种)、90% (89个物种)和95% (94个物种)的物种检出度分别需要10个、13个、17个平行样品左右。捕捞(2.5指流刺网)可监测的物种数为37左右, 单船·天捕捞监测的物种监测能力为16种左右, 监测效率为42.7%左右, 要达到80% (30个物种)、90% (33个物种)和95% (35个物种)的物种检出度分别需要监测8船·天、12船·天、16船·天。

本次eDNA监测调查中, 单样品eDNA监测的鱼类物种检出对单船·天捕捞监测的鱼类物种记录的覆盖度约为65.7%。因为不同的DNA宏条形码对不同的生物类群有不同的辨识能力^{［46-47,49］}, 因此在eDNA监测中应用多个宏条形码进行监测往往会比应用单个宏条形码进行监测所检出的物种数要多, 但所需要投入的资源也多。与之平行, 不同的网具所捕获的水生生物类型也有差异, 在传统捕捞中用多类型多规格的捕捞网具进行监测往往会比用单类型单规格的捕捞网具所捕获记录到的物种数要多^［15］, 同样, 所需要投入的资源也多。本研究聚焦单eDNA样品的物种组成检出能力这一科学问题, 避开多宏条形码和多网具的影响, eDNA监测只分析一对通用引物的检出结果, 传统捕捞监测只统计一种捕捞网具捕捞渔获。本研究中, 单样品eDNA检出本次捕捞监测记录到的物种能力约为10种(10.4±2.2), 对比单船·天捕捞监测的物种监测能力(16种左右), 单样品eDNA监测的鱼类物种检出对单船天捕捞监测的鱼类物种记录的覆盖度约为65.7%。考虑到eDNA监测中被监测到但未被准确识别的物种, 单样品eDNA监测到的鱼类物种对单船天捕捞到的鱼类物种应该有更高的覆盖度。

eDNA监测需要更完善的条形码数据库做支撑。eDNA监测中未被确认正确识别的物种有59种, 分别属于鲟形目(1种)、鲱形目(3种)、鲤形目(6种)、鲇形目(8种)、鲈形目(7种)、虾虎鱼目(5种)、鳉形目(3种)、脂鲤目(3种), 以及仙女鱼目、拟金眼鲷目、海龙鱼目、鲽形目各2种, 喉盘鱼目、鳚形目、鲹形目、日鲈目、蝴蝶鱼目、金鳞鱼目、隆头鱼目、月鱼目、笛鲷目、骨舌鱼目、鲭形目、鲷形目、巨口鱼目、金钱鱼目、䲢形目各1种。本次捕捞调查中有11种未被eDNA监测所监测识别到, 分别属于鲟形目(1种)、鲱形目(1种)、鲤形目(5种)、鲇形目(2种)、鲈形目(2种)。2017—2020年捕捞调查中有63种未被eDNA监测所监测识别到, 分别属于鲟形目(1种)、鳗鲡目(1种)、鲱形目(1种)、鲤形目(39种)、鲇形目(10种)、颌针鱼目(1种)、合鳃鱼目(2种)、鲈形目(4种)、虾虎鱼目(3种)、攀鲈目(1种)(数据来自“长江中游渔业资源与环境调查2017—2020年进展报告”, 未公开发表资料)。有理由认为有一部分捕捞调查到但eDNA监测未检出的鱼类物种已被监测到但未被准确识别, 比如, 捕捞调查中的杂交鲟, eDNA却监测注释出西伯利亚鲟; 另如, 2017—2020长江中游干流捕捞记录到6种拟鲿(数据来自“长江中游渔业资源与环境调查2017—2020年进展报告”, 未公开发表资料), 但本次eDNA监测却监测注释到短体拟鲿(韩国的一个濒危种), 可能是因为短体拟鲿的相应基因序列已发布^［50］, 长江的几种拟鲿的相应基因序列尚缺, 在序列比对注释中将长江的某个/某几个拟鲿的eDNA信号被错误标注为近缘的短体拟鲿。因此随着条形码数据库的不断完善, eDNA监测将发挥出更大的监测效力。目前, 根据中国水产科学研究院的科技基础工作部署, 中国水产科学研究院长江水产研究所负责开展长江水产种质资源凭证标本及其DNA条形码补充采集工作。该工作的开展将推动条形码数据库的不断完善, 进而助力eDNA监测效力的发挥。

eDNA监测需要保证平行样数量及设置与水体规模、物种组成密度、鱼类资源密度的相称。eDNA监测到的各物种相对丰度, 与eDNA的释放、存留、输移、降解等动力学过程相关^［51］, 本研究结果也证实, eDNA所监测到的各鱼类物种的相对丰度与捕捞所监测到的各鱼类物种的数量和重量整体呈正相关(表1、表2)。因为eDNA监测的样品采集是一种有限取样, 具有一定的随机性, 所以为了eDNA监测能够有更高的覆盖度, 采样中需要根据水体规模、物种组成密度、鱼类资源密度进行相应的平行样设置。本次调查期间(2020年9月), 参考水文站汉口站的监测流量在36300~44800 m³/s之间, 平均每天每船的监测捕捞量为70尾、16.5 kg, 记录到物种数为16, 单样品eDNA监测的鱼类物种检出能力为26种左右, 监测效率为25.8%左右, 达到80%、90%和95%的物种检出度分别需要10个、13个、17个平行样品左右。随着2021年长江重点水域全面禁捕的落地实施, 长江的鱼类资源量将会有所恢复, 进而各断面鱼类种类数也将会有所回升, 因而单样品eDNA监测的鱼类物种检出能力和监测效率也将有所增加。因为长江具有明显的季节性水文节律, 丰水期、平水期、枯水期的流量具有显著差异, 在禁捕后物种组成密度、鱼类资源密度没有显著性季节差异的情况假设下, 相比于丰水期(本次调查的时期), 平水期和枯水期的eDNA监测将具有更高的鱼类物种检出能力和监测效率。在未来的eDNA监测工作中, 在80%的检出度目标下, 10个平行样将是一个合适的最大平行样数量, 在95%的检出度目标下, 17个平行样将是一个合适的最大平行样数量。其他长江江段, 甚至其他大型河流可以根据长江武汉江段的情况进行简单的推测判断。

为了探讨大型河流中的eDNA监测效率, 2020年9月(丰水期), 作者在长江武汉江段针对鱼类组成开展了传统捕捞监测和eDNA监测, 监测期间参考水文站汉口站的流量在36300~44800 m³/s之间。结果显示, (1) 本次eDNA监测共检出鱼类89种, 其中30种可与历史捕捞调查结果互相确认, 覆盖68.6%的本次捕捞调查所记录到的鱼类物种, 覆盖30.0%的2017—2020年捕捞调查所记录到的鱼类物种, 另有59种未被确认正确识别的物种, 需要建立更完善的条形码数据库来解决这个问题; (2) 在长江武汉江段2020年9月的流量规模(汉口站36300~44800 m³/s)、物种组成密度(2.5指流刺网15天船捕捞记录到35种鱼类)、鱼类资源密度(每天每船70尾、16.5 kg)条件下, 单样品eDNA监测的鱼类物种检出能力约为26种, 检出效率约为25.8%, 在80%和95%的检出度目标下, 分别需要采集10个和17个平行样, 其他长江江段, 甚至其他大型河流进行eDNA监测所需设置的平行样数量可以根据长江武汉江段的情况进行简单的推测判断。另外, 本研究表明, 更完善的DNA宏条形码数据库和合适的平行样设置是未来eDNA监测作为一个常规监测手段而进行运用的前提。