仿石鲈科(Haemulidae)隶属鲈形目(Perciformes), 鲈亚目(Percoidei), 鲈总科(Percoidae), 广泛分布于热带、亚热带沿海及岛礁海域^[1], 是重要的海洋经济鱼类。形态上，中国仿石鲈科记载有4~7属约30种^{[2,3,4,5,6,7]}, 但其内部种属归类问题还存在明显争议。目前大部分资料认为我国仿石鲈科包含石鲈属(Pomadasys)、胡椒鲷属(Plectorhinchus)、矶鲈属(Parapristipoma)以及髭鲷属(Hapalogenys)4个属。有资料将眶棘鲈属(Scolopsis)也归为仿石鲈科^[2,3], 而眶棘鲈属在其他资料却隶属于眶棘鲈科(Scolopsidae)^[4,6,7]或金线鱼科(Nemipteridae)^[1,5,8]。另外，针对目前归类于仿石鲈科的髭鲷属，有资料认为其与仿石鲈科关系较远，应该从仿石鲈科里面独立出来，或升级为髭鲷科(Hapalogenyidae)^[9,10]。此外，还有个别资料将鯻科(Teraponidae)的种类也归为仿石鲈科，因其拥有与仿石鲈科鱼类相似的条纹^[11]。至于上述归类是否正确，基于形态分类方法还不足以清楚区分，各种属分类争议悬而未决，需进一步结合分子生物学技术，利用合适的分子标记进行系统分类研究，澄清相关分类争议问题。

线粒体DNA细胞色素b (Cytochrome b, Cyt b)基因结构简单，进化速率适中，严格母系遗传，是可信度较高的分子标记，广泛应用于鱼类种、属系统发育关系的研究^[12,13,14]。Chen等^[12]利用Cyt b序列分析20种金线鲃属(Sinocyclocheilus)鱼类分子系统进化关系，揭示旧城金线鲃(Sioncyclocheilus juichengensis)与邱北金线(Sinocyclocheilus qiubeinsis)聚为同一个分支，认为两者应该是同种异名。赵桂研等^[13]基于Cyt b基因分析了我国8种高原鳅属(Triplophysa)鱼类种群遗传多样性与系统发育关系，揭示8种高原鳅种间存在着高度遗传分化。扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术，是Vos等^[15]开发的一种DNA指纹技术，其综合了 RFLP和RAPD两种标记技术的优点，具有多态性强、重复性好的特点。AFLP作为一种理想、有效的核DNA分子标记，在物种分类、遗传多样性评估，遗传图谱构建、品种家系分析等研究方面广泛应用^[16,17,18]。Han等^[17]利用AFLP技术对Lateolabrax maculatus和Lateolabrax japonicus进行物种遗传分歧度及种群遗传结构分析，确定两种鲈鱼存在明显的遗传分化。安丹丹等^[18]基于AFLP技术分析了乌江四川裂腹鱼(Schizothorax kolzovi)种群遗传结构，显示乌江四川裂腹鱼种群目前还具有较丰富的遗传多样性。本研究利用Cyt b基因结合AFLP标记技术，对仿石鲈科及其相关争议科属进行分子系统进化关系分析，旨在从分子水平揭示各种、属间系统分类关系，澄清仿石鲈科鱼类分类争议问题。

实验样品主要在中国广东、海南等沿海省份野外采集，另有部分材料由国外研究单位提供，主要采自于西印度洋、南太平洋、东太平洋等海区。采集标本根据《中国鱼类系统检索》^[4]、《台湾鱼类志》^[5]、《Fishes of the World》^[1]、世界鱼类数据库FishBase^[19]等分类资料和平台进行分类鉴定，取肌肉或鳍条于95%乙醇保存，用于后续总基因组DNA的提取。最后共采集到仿石鲈科(Haemulidae)、金线鱼科(Nemipteridae)、眶棘鲈属(Scolopsis)、鯻科(Teraponidae)以及笛鲷科(Lutjanidae)、裸颊鲷科(Lethrinidae)、鮨科(Serranidae)等相关科属鱼类标本64种。另外从GenBank上下载了舵鱼科(Kyphosidae)的低鳍舵鱼(Kyphosus vaigiensis)、石鲷科(Oplegnathidae)的条石鲷(Oplegnathus fasciatus)两种鱼类以及作为外类群的鲤科(Cyprinidae)中鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)共同分析，标本种类与来源见表1。

取约0.1 g样品组织，利用海洋动物总基因组DNA提取试剂盒(天根生化), 根据说明书操作提取样品基因组DNA, 80 μL灭菌水进行溶解。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，–20 ℃存放备用。

参考文献[20], 用于扩增Cyt b基因片段的上下游引物分别为：5′-TGGCAAGCCTACGCA AAAC-3′及5′-TATTCCGCCGATTCAGGTAA-3′。PCR反应总体积为50 μL, 其中10×buffer缓冲液5 μL, dNTPs (各2.5 mmol/L) 2 μL, 上下游引物各1 μL, Ex Taq酶(1 U/µL) 2 µL。扩增条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 50~55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 35个循环，最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增成功的样品用PCR产物纯化试剂盒(天根生化)纯化回收，送至天一辉远生物技术有限公司进行序列测定。

AFLP实验分析选择仿石鲈科(石鲈亚科及胡椒鲷亚科)、鯻科、金线鱼科、髭鲷属、眶棘鲈属等存在分类争议科属50个代表性种类进行分析，其中石鲈亚科19种，胡椒鲷亚科13种，鯻科5种，金线鱼科8种，眶棘鲈属2种，髭鲷属3种。AFLP实验流程参照Vos等^[15]方法操作，稍加变动，主要包括基因组DNA双酶切(EcoR I和Mse I), 接头连接，连接产物预扩增及选择性扩增。通过前期引物筛选实验，从15对引物中选择6对多态性效果较丰富的选择性扩增引物组合：EcoR I-TCC/Mse I-CTG、EcoR I-TCT/Mse I-CTG、EcoR I-TCC/Mse I-TCC、EcoR I-TCG/Mse I-CTG、EcoR I-TCT/Mse I-TCC、EcoR I-TCT/Mse I-CCT用于AFLP图谱分析。具体的接头和引物序列见表2。

表1

表1 　实验材料的种类和来源 Tab. 1 Species and sources of experimental samples 科/属 families/genera 物种species 拉丁名Latin name 样品来源source of samples 仿石鲈科Haemulidae 髭鲷属Ｈapalogenys 斜带髭鲷 Hapalogenys nitens 中国广东     横带髭鲷 Hapalogenys mucronatus 中国广东       纵带髭鲷 Hapalogenys kishinouyei 中国广东   少棘胡椒鲷属Diagramma 南非少棘胡椒鲷 Diagramma centurio 塞舌尔马埃岛       少棘胡椒鲷 Diagramma pictum 中国广东   胡椒鲷属Plectorhinchus 斑胡椒鲷 Plectorhinchus chaetodonoides 中国海南       花尾胡椒鲷 Plectorhinchus cinctus 中国广东       四带胡椒鲷 Plectorhinchus diagrammus 中国海南       密点胡椒鲷 Plectorhinchus gaterinus 坦桑尼亚马普托       黑胡椒鲷 Plectorhinchus gibbosus 塞舌尔马埃岛       斜纹胡椒鲷 Plectorhinchus lineatus 中国海南       东方胡椒鲷 Plectorhinchus orientalis 中国海南       暗点胡椒鲷 Plectorhinchus picus 中国海南       肖氏胡椒鲷 Plectorhinchus schotaf 莫桑比克马普托       红唇胡椒鲷 Plectorhinchus sordidus 肯尼亚迪亚尼海滩       条纹胡椒鲷 Plectorhinchus vittatus 塞舌尔马埃岛   矶鲈属Parapristipoma 三线矶鲈 Parapristipoma trilineatum 中国广东   石鲈属Pomadasys 银石鲈 Pomadasys argenteus 新喀里多尼亚努美阿       赤笔石鲈 Pomadasys furcatus 莫桑比克马普托       断斑石鲈 Pomadasys hasta 中国广东       大棘石鲈 Pomadasys macracanthus 萨尔瓦多拉乌尼翁       大斑石鲈 Pomadasys maculates 中国广东       黄鳍石鲈 Pomadasys olivaceus 南非东开普省       佩氏石鲈 Pomadasys peroteti 安哥拉       纵带石鲈 Pomadasys striatum 南非夸祖鲁纳塔尔   仿石鲈属Haemulon 黄仿石鲈 Haemulon flavolineatum 百慕大圣乔治斯岛       大口仿石鲈 Haemulon macrostomum 伯利兹Carrie Bow Cay       普氏仿石鲈 Haemulon plumieri 伯利兹Carrie Bow Cay       蓝仿石鲈 Haemulon sciurus 伯利兹Carrie Bow Cay   小仿石鲈属Haemulopsis 白色小仿石鲈 Haemulopsis leuciscus 萨尔瓦多拉乌尼翁   异孔石鲈属Anisotremus 黑异孔石鲈 Anisotremus surinamensis 波多黎各Playa Sardiner       枝异孔石鲈 Anisotremus virginicus 伯利兹Carrie Bow Cay   八带石鲈属Conodon 八带石鲈 Conodon nobilis 美国得克萨斯州   纹谐鱼属Inermia 纹谐鱼 Inermia vittata 伯利兹Carrie Bow Cay   锯鳃石鲈属Orthopristis 金鳍锯鳃石鲈 Orthopristis chrysoptera 美国南卡罗来纳州   异石鲈属Xenistius 北美异石鲈 Xenistius californiensis 美国加利福利亚州 眶棘鲈科Scolopsidae   眶棘鲈属Scolopsis 二线眶棘鲈 Scolopsis bilineatus 中国海南       带尾眶棘鲈 Scolopsis frenatus 塞舌尔马埃岛       伏氏眶棘鲈 Scolopsis vosmeri 中国广东 金线鱼科Nemipteridae 金线鱼属Nemipterus 印度洋金线鱼 Nemipterus bipunctatus 莫桑比克       红金线鱼 Nemipterus furcosus 新喀里多尼亚努美阿       苏门答腊金线鱼 Nemipterus mesoprion 中国海南       姬金线鱼 Nemipterus zysron 中国海南       日本金线鱼 Nemipterus japonicus 中国广东   锥齿鲷属Pentapodus 黄带锥齿鲷 Pentapodus aureofasciatus 新喀里多尼亚努美阿       长崎锥齿鲷 Pentapodus nagasakiensis 新喀里多尼亚努美阿   副眶棘鲈属Parascolopsis 宽带副眶棘鲈 Parascolopsis eriomma 莫桑比克马普托   鯻科Teraponidae   鯻属Terapon 鯻 Terapon theraps 中国广东       细鳞鯻 Terapon jarbua 中国广东   尖吻鯻属Rhynchopelates 尖吻鯻 Rhynchopelates oxyrhychus 中国广东   列牙鯻属Pelates 四线列牙鯻 Pelates quadrilineatus 中国广东   叉牙鯻属Helotes 叉牙鯻 Helotes sexlineatus 中国广东   鯵科Carangidae 丽叶鯵 Alepes kleinii 中国广东       金带细鯵 Selaroides leptolepis 中国广东   裸颊鲷科Lethrinidae 红鳍裸颊鲷 Lethrinus haematopterus 中国广东       星斑裸颊鲷 Lethrinus nebulosus 中国广东   笛鲷科Lutjanidae 紫红笛鲷 Lutjanus argentimaculatus 中国广东       勒氏笛鲷 Lutjanus russellii 中国广东   石首鱼科Sciaenidae 黄姑鱼 Nibea albiflora 中国广东       白姑鱼 Pennahia argentata 中国广东   鮨科Serranidae 横纹九棘鲈 Cephalopholis boenak 中国广东       尾纹九棘鲈 Cephalopholis urodeta 中国海南       青石斑鱼 Epinephelus awoara 中国广东       斜带石斑鱼 Epinephelus coioides 中国广东   舵鱼科Kyphosidae 低鳍舵鱼 Kyphosus vaigiensis GenBank   石鲷科Oplegnathidae 条石鲷 Oplegnathus fasciatus GenBank 外类群outgroup   鲤科Cyprinidae 鲫 Carassius auratus GenBank       鲤 Cyprinus carpio GenBank

表1 　实验材料的种类和来源 Tab. 1 Species and sources of experimental samples

表2

表2 　AFLP标记引物和接头序列 Tab. 2 Sequences of adaptors and primers for AFLP marker 接头与引物 adaptors and primers 序列(5′-3′) sequences (5′-3′) 选择性引物 selective primers 序列(5′-3′) sequences (5′-3′) EcoR I 接头 CTCGTAGACTGCGTACC E-TCC GACTGCGTACCAATTCTCC   AATTGGTACGCAGTCTAC E-TCG GACTGCGTACCAATTCTCG Mse I接头 GACGATGAGTCCTGAG E-TCT GACTGCGTACCAATTCTCT   TACTCAGGACTCAT M-CCT GATGAGTCCTGAGTAACCT E-primer GACTGCGTACCAATTC M-CTG GATGAGTCCTGAGTAACTG M-primer GATGAGTCCTGAGTAA M-TCC GATGAGTCCTGAGTAATCC

表2 　AFLP标记引物和接头序列 Tab. 2 Sequences of adaptors and primers for AFLP marker

酶切反应体积为20 μL, 包括10×酶切反应缓冲液4 μL, EcoR I (10 U/μL)与Mse I (10 U/μL)各0.4 μL, 模板DNA 约200 ng, 补ddH₂O至20 μL。37 ℃酶切3 h, 再65 ℃酶切3 h, 酶切产物直接用于后续连接反应。连接体系包括：10×T4 Buffer 2 μL; EcoR I 接头(50 μmol/L)1 μL; Mse I接头(50 μmol/L) 1 μL, T4连接酶0.4 μL, 酶切产物10 μL, 补ddH₂O至20 μL, 20 ℃连接过夜。

预扩增反应体积为20 μL, 包括10×Buffer缓冲液 2 μL, dNTPs (各2.5 mmol/L) 1 μL, Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL, 上下游引物各0.5 μL, 连接模板2 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性45 s, 50 ℃退火45 s, 72 ℃延伸60 s, 26个循环。预扩增产物稀释20倍作为后续选择性扩增模板。

选择性扩增反应总体积20 μL, 包括10×Buffer缓冲液2 μL, dNTPs (各2.5 mmol/L) 1 μL, 5 U/μL Taq酶0.5 μL, 上下游引物各1 μL, 预扩增产物模板2 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性35 s, 65 ℃退火35 s (每次循环降低0.7 ℃), 72 ℃延伸60 s, 12个循环；94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 23个循环。扩增产物于5%变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离和检测。

测序所得Cyt b序列采用NCBI的Blast工具进行相似性检索，验证序列的正确性。与GenBank下载的序列一起利用Clustal W排列比对，去掉两端冗余，得到729 bp一致序列。利用MEGA 7.0分析序列碱基组成，位点数目，遗传距离等数据。以鲤(C. carpio)和鲫(C. auratus)作为外类群，利用ModelTest 2.1.5进行最佳进化模型预测，RAxML 8.0基于最大似然法(maximum likelihood, ML)构建分子系统进化树。进化树分支置信度采用1000次重复抽样分析(bootstrap analysis)进行检验。

选取聚丙烯酰胺凝胶电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的有无。在相同片段位置，有条带的记为“1”, 无带记为“0”。制作0 /1矩阵，将0/1矩阵输入POPGENE软件分析图谱遗传多态性，并用NTSYSpc2.10进行UPGMA聚类分析。

Cyt b序列经排列比对，去掉两端冗余得到一致序列729 bp, 编码243个氨基酸。序列中T、C、A、G碱基平均含量分别为29.0%、31.8%、23.3%、15.9%, A+T(52.3%)含量显著高于G+C(47.7%)。序列密码子第一位中，4种碱基含量差异不大，分布比较平均；密码子第二位，T-2含量明显高于其他3种，占40.0%, G-2含量最低，为14.2%; 密码子第三位C-3含量最高，占46.6%, G-3含量最低，为5.3%, 表现出明显反G偏倚。此外，在长度为729 bp序列中，除去外类群，共有保守位点360个，变异位点369个，简约信息位点为339个。

利用筛选的6对引物组合，从仿石鲈科及其相关科属50个代表性样品中，在100~700 bp范围间，检出669条清晰条带（图1）。经统计分析，多态性条带669条，多态性比率为100%, 显示该类群不同物种分子水平信息差异较大。其中E-TCT/M-TCC 引物组合产生的带最多，为128条，E-TCC/M-CTG引物组合产生的带最少，为99条，平均每对引物产生111条带，多态性比率均为100%(表3)。不同物种所得的条带信息差异显著，可依此相互区分。而隶属于同一科、属的种类也存在共同的条带信息，如E-TCT/M-CTG引物组合扩增结果，在400 bp左右位置存在仿石鲈科(石鲈亚科+胡椒鲷亚科)物种共有的条带信息，而在髭鲷属、眶棘鲈属、鯻科并无此条带，可作为区分仿石鲈科与其他科属种类的特异性条带。

表3

表3 　6对引物组合在仿石鲈科及相关科属种类AFLP图谱中多态性比较 Tab. 3 Polymorphisms comparison of the AFLP fingerprint of species from Haemulidae and related families/genera based on 6 pairs of primer combinations 序号 number 引物组合 primer  combinations 检测条带数 detected  bands 多态性条带数 polymorphic  bands 多态性比率/% polymorphic  ratio 1 E-TCC / M-CTG 99 99 100 2 E-TCT / M-CTG 110 110 100 3 E-TCC / M-TCC 109 109 100 4 E-TCG / M-CTG 117 117 100 5 E-TCT / M-TCC 128 128 100 6 E-TCT / M-CCT 106 106 100

表3 　6对引物组合在仿石鲈科及相关科属种类AFLP图谱中多态性比较 Tab. 3 Polymorphisms comparison of the AFLP fingerprint of species from Haemulidae and related families/genera based on 6 pairs of primer combinations

图1

图1 　引物组合E-TCT/M-CTG对50种仿石鲈科及相关科属种类AFLP扩增结果M: Marker; 1~50为样品编号；1~13: 胡椒鲷亚科；14~32: 石鲈亚科；33~35: 髭鲷属；36~43: 金线鱼科；44~45: 眶棘鲈属；46~50: 鯻科. Fig. 1 Results of AFLP amplification of species from Haemulidae and related families/genera based on primer combinations E-TCT/M-CTGM: Marker; 1–50 represent sample numbers. 1–13: Plectorhynchinae; 14–32: Haemulinae; 33–35: Hapalogenys; 36–43: Nemipteridae; 44–45: Scolopsis; 46–50: Theraponidae.

基于Kimura-2-Parameter模型利用MEGA7.0计算出各物种Cyt b遗传距离(由于样品较多，表格数据较大，无法在同一页面显示，故表格不列出), 遗传距离范围为0.024~0.303, 平均遗传距离0.218。根据物种遗传距离数据汇总出各科、属之间的遗传距离范围(表4)。通过比较仿石鲈科(胡椒鲷亚科+石鲈亚科)、鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属等有分类争议科属间遗传距离范围可知，仿石鲈科内部(石鲈亚科与胡椒鲷亚科)遗传距离范围为0.024~0.243, 而鯻科与仿石鲈科遗传距离范围(0.191~0.275)大于仿石鲈科内部的各种属遗传距离范围，且比其与舵鱼科(0.168~0.211)、石鲷科(0.180~0.218)、笛鲷科(0.197~0.255)等其他科的遗传距离范围均要大，显示鯻科与仿石鲈科分子水平差异甚远。对于眶棘鲈属，其与仿石鲈科之间的遗传距离范围(0.208~0.290)也大于仿石鲈科内部各种属遗传距离范围。反之，眶棘鲈属与金线鱼科的遗传距离范围则相对较小(0.174~0.265), 甚至小于其与仿石鲈科之间的遗传距离范围(0.208~0.290)。对于传统分类上隶属于仿石鲈科的髭鲷属，其与仿石鲈科的遗传距离范围也相对较大(0.180~0.291), 且比其与笛鲷科(0.186~0.241), 舵鱼科(0.197~0.252)等其他科的遗传距离范围要大，显示髭鲷属与仿石鲈科的亲缘关系较远。

表4

表4 　基于Cyt b基因的仿石鲈科、鯻科、金线鱼科、眶棘鲈属、髭鲷属及其他科属间遗传距离 Tab. 4 Genetic distances among Haemulidae, Theraponidae, Nemipteridae, Scolopsis, Hapalogenys and other families/genera based on Cyt b gene sequences     胡椒鲷亚科 Plectorhynchinae 石鲈亚科 Haemulinae 鯻科 Theraponidae 金线鱼科 Nemipteridae 眶棘鲈属 Scolopsis 髭鲷属 Hapalogeny 胡椒鲷亚科 Plectorhynchinae 0.024–0.205 石鲈亚科 Haemulinae 0.156–0.243 0.064–0.225 鯻科 Theraponidae 0.208–0.275 0.191–0.272 0.139–0.182 金线鱼科 Nemipteridae 0.185–0.269 0.188–0.293 0.197–0.290 0.032–0.247 眶棘鲈属 Scolopsis 0.208–0.283 0.225–0.290 0.232–0.284 0.174–0.265 0.184–0.230 髭鲷属 Hapalogeny 0.180–0.270 0.187–0.291 0.219–0.299 0.188–0.293 0.213–0.274 0.185–0.204 舵鱼科 Kyphosidae 0.158–0.217 0.183–0.232 0.168–0.211 0.198–0.250 0.216–0.232 0.197–0.252 石鲷科 Oplegnathidae 0.189–0.251 0.183–0.240 0.180–0.218 0.211–0.303 0.250–0.257 0.235–0.272 石首鱼科 Sciaenidae 0.188–0.242 0.178–0.251 0.202–0.263 0.197–0.288 0.230–0.295 0.235–0.275 笛鲷科 Lutjanidae 0.172–0.246 0.162–0.233 0.197–0.255 0.208–0.263 0.227–0.245 0.186–0.241 裸颊鲷科 Lethrinidae 0.178–0.230 0.164–0.241 0.227–0.276 0.212–0.279 0.233–0.260 0.214–0.294 鲹科 Carangidae 0.219–0.269 0.197–0.289 0.225–0.271 0.216–0.289 0.265–0.298 0.220–0.299 鮨科 Serranidae 0.186–0.268 0.169–0.265 0.218–0.272 0.207–0.270 0.226–0.283 0.213–0.261

表4 　基于Cyt b基因的仿石鲈科、鯻科、金线鱼科、眶棘鲈属、髭鲷属及其他科属间遗传距离 Tab. 4 Genetic distances among Haemulidae, Theraponidae, Nemipteridae, Scolopsis, Hapalogenys and other families/genera based on Cyt b gene sequences

根据AFLP结果计算的50种代表性物种遗传距离，汇总出仿石鲈科，金线鱼科，鯻科，眶棘鲈属，髭鲷属等各科属间的遗传距离范围(表5)。其中仿石鲈科内部(石鲈亚科与胡椒鲷亚科)AFLP遗传距离范围为0.690~1.362。鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属与仿石鲈科(石鲈亚科与胡椒鲷亚科)之间的遗传距离范围均比较大：分别为1.268~1.683、1.097~1.553、1.225~1.556, 大于仿石鲈科内部遗传距离范围，与Cyt b结果相似，揭示在AFLP遗传图谱上，鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属与仿石鲈科的亲缘关系均相对较远。

表5

表5 　基于AFLP数据的仿石鲈科、鯻科、金线鱼科、眶棘鲈科各属间遗传距离 Tab. 5 Genetic distances among Haemulidae, Theraponidae, Nemipteridae, Scolopsis and Hapalogenys based on AFLP data     胡椒鲷亚科 Plectorhynchinae 石鲈亚科 Haemulinae 鯻科 Theraponidae 金线鱼科 Nemipteridae 眶棘鲈属 Scolopsis 髭鲷属 Hapalogeny 胡椒鲷亚科Plectorhynchinae 0.690-1.144 石鲈亚科 Haemulinae 0.970-1.361 0.522-1.362 鯻科 Theraponidae 1.268-1.618 1.307-1.683 0.939-1.206 金线鱼科 Nemipteridae 1.053-1.501 0.944-1.683 1.112-1.593 0.741-1.303 眶棘鲈属 Scolopsis 1.134-1.492 1.097-1.553 1.092-1.728 0.947-1.388 0.831 髭鲷属 Hapalogeny 1.225-1.556 1.289-1.545 1.233-1.891 1.097-1.501 1.281-1.326 0.804-0.993

表5 　基于AFLP数据的仿石鲈科、鯻科、金线鱼科、眶棘鲈科各属间遗传距离 Tab. 5 Genetic distances among Haemulidae, Theraponidae, Nemipteridae, Scolopsis and Hapalogenys based on AFLP data

基于仿石鲈科及其相关科属种类Cyt b序列，以鲫和鲤作为外类群，利用最大似然法构建系统进化树如图2所示，树上各节点数值为ML 树采用1000次Bootstrap统计后的支持率。进化树上，仿石鲈科中胡椒鲷属、矶鲈属、石鲈属等11属34种鱼类共同聚成仿石鲈科最大的单系群，该类群又可清晰分为两个主要分支，其中石鲈属、仿石鲈属、异孔石鲈属等7个属形成石鲈亚科(Haemulinae)分支；胡椒鲷属、少棘胡椒鲷属、矶鲈属形成胡椒鲷亚科(Plectorhynchinae)分支。对于鯻科及眶棘鲈属，进化树一致表明，两者均没有与仿石鲈科类群相聚。鯻科与舵鱼科、石鲷科聚为一支，眶棘鲈属与金线鱼科聚在一起，位于金线鱼科内部。此外，传统分类隶属于仿石鲈科的髭鲷属，在进化树上也没有与仿石鲈科聚为单系，而是单独形成一支，独立于仿石鲈科之外。结果显示，仿石鲈科类群由石鲈亚科及胡椒鲷亚科两个亚科组成，鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属与仿石鲈科亲缘关系较远。

基于AFLP遗传图谱，根据各样本间遗传距离，用UPGMA聚类法对筛选的50种鱼类进行聚类分析，得到系统进化树分支图如图3所示。进化树上，50种鱼类可划分为3大类群：第一类群为胡椒鲷亚科与石鲈亚科聚成的仿石鲈科单系群；第二类群包括髭鲷属，金线鱼科与眶棘鲈属，其中眶棘鲈属与金线鱼科聚在一起；第三类群为鯻科5种鱼类聚成的单系分支。各科属种类聚类关系与Cyt b序列构建的进化树大致相同。

AFLP分子标记技术自1993年提出以来，已被广泛应用于动植物遗传结构、基因定位、DNA指纹图谱等不同领域研究，在鱼类上也常用于群体遗传多样性、分子标记育种、家系选育等群体分析^[16,17,18], 而用于不同物种亲缘关系、系统分类研究相对较少^[21,22]。本研究将AFLP技术与Cyt b标记结合，共同应用于仿石鲈科及相关争议科属的系统进化分析。本研究AFLP标记图谱中，筛选的6对引物组合从50种鱼类中共检出669条清晰条带，其中多态性条带669条，多态性比率为100%, 拥有足够多的差异区分不同种属。根据AFLP图谱计算的遗传距离及构建系统进化树也能有效区分不同物种亲缘关系。进化树上，仿石鲈科、鯻科、金线鱼科、眶棘鲈属、髭鲷属等科、属均能清晰聚类，拓扑结构与Cyt b基因构建进化树结构基本一致，表明AFLP标记可有效用于仿石鲈科不同种属分类关系研究。

图2

图2 　仿石鲈科及其相关种类基于Cyt b序列利用最大似然法构建的分子系统进化树 Fig. 2 Molecular phylogenetic trees of Haemulidae and related species constructed using maximum likelihood method based on Cyt b gene sequences

图3

图3 　仿石鲈科及其相关种类基于AFLP图谱利用UPGMA法构建分子系统进化树 Fig. 3 Molecular phylogenetic trees of Haemulidae and related species constructed using UPGMA method based on AFLP markers

形态分类上，Johnson^[23]曾把仿石鲈科划分为石鲈亚科(Haemulinae)和胡椒鲷亚科(Plectorhynchinae)两个亚科。其中石鲈亚科包括石鲈属、仿石鲈属、异石鲈属等14个属，胡椒鲷亚科包括少棘胡椒鲷属、胡椒鲷属与矶鲈属3个属。本研究采集获得石鲈亚科及胡椒鲷亚科鱼类33种，隶属于11个属，样品来源于印度-西太平洋、东太平洋、东大西洋等世界不同海区，具有一定的代表性。基于Cyt b及AFLP标记构建的系统进化树，33种鱼类均聚成两个分支，其中石鲈属、仿石鲈属、异孔石鲈属等7个属聚为石鲈亚科的分支，胡椒鲷属、少棘胡椒鲷属、矶鲈属3个属聚成胡椒鲷亚科分支，与Johnson^[23]将仿石鲈科划分2个亚科的观点一致。

眶棘鲈属在传统分类资料中分类地位争议较大，部分资料将眶棘鲈属归为仿石鲈科^[2,3], 另有资料却将其归为眶棘鲈科(Scolopsidae)^[4,6,7], 或金线鱼科(Nemipteridae)^[1,5,8]; 此外，还有资料将眶棘鲈科(Scolopsidae )[连同眶棘鲈属(Scolopsis)]并入仿石鲈科[原为石鲈科(Pomadasyidae)], 并在其下设立眶棘鲈亚科(Scolopsinae)^[24]等。根据本研究分子标记构建的系统进化树，不管Cyt b还是AFLP标记，进化树一致表明，眶棘鲈属均以高支持率优先与金线鱼科聚在一起，位于金线鱼科内部，并与仿石鲈科的分类地位相距较远。此外，基于Cyt b及AFLP标记遗传距离分析，眶棘鲈属与仿石鲈科的遗传距离(Cyt b: 0.208~0.290; AFLP: 1.097~1.553), 比其与金线鱼科之间的遗传距离(Cyt b: 0.174~0.265; AFLP: 0.947~1.388)均要大。可知，与仿石鲈科相比，在分子水平上，眶棘鲈属与金线鱼科存在更近的亲缘关系，这与目前部分系统分类学研究结果一致。Carpenter等^[25]测定了金线鱼科、裸颊鲷科、鲷科、棘臀鱼科骨骼和鳞片等形态特征数据并进行系统进化分析，发现眶棘鲈属与金线鱼科聚为紧密单系。Orrell等^[26]以及Miller等^[27]分别利用分子标记构建笛鲷科(Lutajnidae)以及鲷科(Sparidae)分子系统进化关系也揭示眶棘鲈属与金线鱼科聚在一起，与仿石鲈科分类位置相对较远。本研究前期利用RAG2标记分析仿石鲈科鱼类系统分类问题也揭示眶棘鲈属与金线鱼科关系更近，支持眶棘鲈属隶属于金线鱼科观点^[28], 这也与目前大部分形态分类资料归类结果一致^{[1,5,8,19,29]}。

我国分布的髭鲷属种类记载有3种：斜带髭鲷、横带髭鲷与纵带髭鲷^{[2,3,4,5,6,7]}, 本研究把3种髭鲷样品完全采集。对于这3种髭鲷的分类关系，一般根据背鳍鳍棘第3鳍棘是否长于第4鳍棘的标准首先把横带髭鲷与另外2种髭鲷区分开来，横带髭鲷背鳍第3鳍棘比第4鳍棘要长，而斜带髭鲷与纵带髭鲷第3鳍棘比第4鳍棘要短。本研究分子水平的分类结果中，不管是Cyt b还是AFLP分析的进化树，斜带髭鲷与纵带髭鲷都优先聚成一支，然后再与横带髭鲷相聚，聚类结果与形态分类结果一致。

对于髭鲷属在仿石鲈科中的分类地位，大多数分类资料把髭鲷属归类于仿石鲈科，但也有研究认为髭鲷属在仿石鲈科中的分类地位存在争议。Johnson^[23]把仿石鲈科划分为石鲈亚科和胡椒鲷亚科，对于髭鲷属，认为其在鲈亚目中的分类地位并不明确。近期不少分子水平研究均指出髭鲷属与仿石鲈科亲缘关系较远，应从仿石鲈科中独立出来，或提升为髭鲷科(Hapalogenyidae)。徐田军等^[30]基于Cyt b全长序列分析了斜带髭鲷、横带髭鲷与鲈总科6科29种鱼类的分子系统进化关系，表明髭鲷属与石鲈科其他属的遗传距离已超出了科间水平。魏涛^[31]测定了斜带髭鲷线粒体基因组全序列，基于全序列与62种鲈亚目进行系统进化分析，显示斜带髭鲷单独形成一支，独立于仿石鲈科之外。任岗等^[9]利用16S rRNA对石鲈科5个属的鱼类系统发育分析也认为髭鲷属跟仿石鲈科关系较远，建议将髭鲷属提升为髭鲷科。在世界鱼类数据库(FishBase)上，髭鲷属已经从仿石鲈科中分离出来，隶属于髭鲷科，收录了全球7种髭鲷属鱼类^[19]。本研究系统进化树上，不管是Cyt b还是AFLP标记，髭鲷属均没有与仿石鲈科聚为一支，3种髭鲷聚成髭鲷属的单系分支，独立于仿石鲈科类群之外。基于遗传距离也显示，髭鲷属与仿石鲈科的遗传距离(Cyt b: 0.180~0.297; AFLP: 1.225~1.556)超出了仿石鲈科内部属间遗传距离(Cyt b: 0.024~0.243; AFLP: 0.690~1.362), 显示髭鲷属在分子水平上与仿石鲈科亲缘关系较远，支持髭鲷属从仿石鲈科中分离出来，或提升到髭鲷科的分类观点。

鯻科在我国大致分为3~4属4~8种^{[2,3,4,5,7,32]}, 本研究共采集了鯻科4属(鯻属、尖吻鯻属、列牙鯻属、叉牙鯻属) 5种鱼类，具有一定代表性。进化树上，5种鯻科鱼类聚成单系分支，独立于仿石鲈科类群之外。在Cyt b进化树上，鯻科优先与舵鱼科、石鲷科鱼类聚在一起，位于进化树的基部，与仿石鲈科相距较远。在AFLP标记进化树上，鯻科种类也单独形成一支，位于进化树的底部。根据遗传距离分析，不管是Cyt b基因还是AFLP标记，鯻科与仿石鲈科的遗传距离(Cyt b: 0.191~0.275; AFLP: 1.268~1.683)均远大于仿石鲈科内部属间遗传距离(Cyt b: 0.024~0.243; AFLP: 0.690~1.362)。可知，鯻科与仿石鲈科亲缘关系较远，不支持鯻科归入仿石鲈科，该结果与当今大多数形态资料分类观点一致^{[2,3,4,5,7,33]}。相对于仿石鲈科，本研究进化树上，鯻科与舵鱼科存在更近的亲缘关系，这也与当前部分系统分类研究结果相似。Greenwood等^[34]揭示鯻科与舵鱼科在形态上均拥有一种特定的RLA (ramus lateralis accessories)10型的特征，该特征仅在个别科、属存在，认为是该类群物种的共源性状。Yagishita等^[35]基于线粒体DNA标记分析也验证鯻科与舵鱼科关系较近，与仿石鲈科关系较远。对于鯻科内部各种属间的分类关系，进化树上，四线列牙鯻与叉牙鯻优先聚为姐妹分支，鯻与尖吻鯻位于鯻科分支内部，细鳞鯻最先分化，位于鯻科分支基部，这与陈璐等^[36]、苏国茂等^[37]对鯻科分子系统进化研究结果相似，可为鯻科内部各种属间系统分类关系提供一定依据。

本研究基于线粒体DNA Cyt b基因及AFLP标记图谱，对仿石鲈科及其相关争议科属进行分子系统进化关系研究，从分子水平深入揭示各种、属系统分类关系，有效澄清仿石鲈科及相关科属分类争议问题。结果表明，分子水平上，仿石鲈科聚为石鲈亚科与胡椒鲷亚科两个主要分支，鯻科、眶棘鲈属、髭鲷属等争议科属与仿石鲈科亲缘关系较远，不应该归为仿石鲈科，与当今主要形态分类资料观点一致，研究结果为仿石鲈科及相关科属的系统分类提供分子水平依据。