凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 俗称南美白对虾，自然分布于墨西哥Sonora州西北部至秘鲁北部的太平洋沿岸海域，具有生长速度快、肉质鲜美、盐度适应性广等特性。自1988年由张伟权研究员引进中国，并在20世纪90年代突破人工繁育技术后，开始大规模养殖推广^[1]。目前，我国凡纳滨对虾养殖产量连续多年超过100万t, 占世界养殖总产量的37%以上，为我国最重要的水产养殖种类之一^[2]。然而，随着养殖规模的逐渐扩大，凡纳滨对虾出现种质衰退现象，主要包括生长速度减慢、抗逆性差、繁殖力降低，因此对凡纳滨对虾进行遗传改良，成为凡纳滨对虾产业的迫切需求。规模化家系选育技术，是当前在凡纳滨对虾遗传改良工作中应用的一项重要技术。利用该技术开展选择育种工作，需要大规模收集奠基者群体，构建遗传变异丰富的基础群体。由于凡纳滨对虾属国外引进种，因此国内可利用的种质资源群体多为已改良的商业群体，存在不同群体间的遗传性能差异大，群体内和群体间的亲缘关系及其遗传背景不清楚的问题。如果在遗传评估中忽略这种未知亲本组(unknown parent group, UPG)效应，会导致育种群体目标性状的遗传力及加性遗传方差被高估，进而影响育种决策^[3]。因此，采取有效的策略，对凡纳滨对虾奠基者群体的UPG效应进行分析，是一项提高遗传评估准确度的重要研究内容^[4]。

1981年，Quaas和Pollak首次提出将不同群体的遗传贡献值通过一个Q矩阵纳入混合模型方程中的方法，基于系谱信息建立了剖分UPG效应的最佳线性无偏预测(best linear unbiased prediction based on pedigree, pBLUP)模型^[5]。在系谱中，加入代表不同群体的虚拟个体信息，可以简便地剖分出UPG效应。该方法已在凡纳滨对虾育种群体的遗传参数估计研究中得到应用^[6,7]。然而，经典的遗传组方法并没有考虑奠基者群体内和群体间可能存在的亲缘关系，也没有考虑由于选择和漂变导致的方差组分降低等情况。随着高通量基因型鉴定技术的发展，育种学家已建立了复合系谱和基因组亲缘关系的H矩阵，通过对不同群体的奠基者个体进行基因型鉴定，可以更为准确的计算奠基者群体间(内)的亲缘关系，进而更为准确的评估基础群体的遗传参数。基于H矩阵的单步基因组BLUP (single step genomic BLUP, ssGBLUP)方法，已在凡纳滨对虾、罗氏沼虾等育种群体中开展应用^[8,9]。然而，由于ssGBLUP方法假定不同基础群体祖先个体间没有亲缘关系，这种方法并不适用于可能有亲缘关系的多个基础群体的联合遗传评估。因此，Legarra等^[10]和Garcia-Baccino等^[11]提出了“元奠基者”(Metafounders)方法，基于奠基者及其后代基因型信息，构建多个基础群体间(内)奠基者祖先个体间的亲缘关系矩阵，进一步提升ssGBLUP遗传评估的准确性。

水产动物选育研究相对于畜禽育种发展历程较短，对UPG效应研究报道较少。特别是在基因组水平上，缺少UPG效应的对比分析研究^[12,13,14]。本文收集生长速度和养殖存活率差异较大的3个凡纳滨对虾种质资源群体作为奠基者群体，利用不完全双列杂交方法生产家系，组建育种基础群体，并对家系部分个体进行高通量SNP基因型鉴定，然后建立多个pBLUP和ssGBLUP模型，对比分析UPG对遗传参数估计值和估计育种值(estimated breeding value, EBV)或基因组EBV (genomic EBV, GEBV)的影响。研究结果为准确地评估凡纳滨对虾育种基础群体提供可借鉴的育种分析模型和评估方法。

课题组在广东海茂投资有限公司东海岛育种基地开展育种基础群体构建工作。奠基者群体包括3个：生长速度中等存活率高的E群体、生长速度慢存活率中等的P群体、生长速度快存活率低的S群体。2018年，从奠基者群体中选择93个父本和86个母本，构建了G0代基础群体，共包括93个家系。本实验所用材料为其中的60个全同胞家系(包括13个母系半同胞家系), 这些家系由60个父本和53个母本产生。

每天观察亲虾的性腺发育情况，2018年11月开始，按照群体间不完全双列杂交配种方案，挑选生长健康、性腺发育成熟的雌虾，移入雄虾池，通过自然交尾方式生产家系。将每个家系受精卵转移到120 L的圆桶内进行孵化。

孵化出幼体后，进行第一次家系标准化：每个家系随机挑选20000尾幼体放入孵化桶培育至仔虾。P15阶段时进行第二次家系标准化：每个家系随机准确计数2000尾活力强的仔虾放入圆桶中继续培育。经过14 d左右的养殖后进行第三次家系标准化：每个家系随机准确计数600尾活力强的仔虾放入圆桶中继续培育。再经20 d左右养殖后，挑选450尾活力强的仔虾转移到1 m³圆桶继续培育。仔虾培育期间投喂虾片、卤虫及凡纳滨对虾配合饲料。每4 h投喂一次，投喂量及比例根据不同发育时期适时调整。换水方式采用流水方法，日换水量逐渐增加，幼体后期换水量为每天55%。每3天测量一次水环境中亚硝酸盐、氨氮浓度。

当仔虾平均体长为3~4 cm时，将每个家系个体以不同的颜色组合在虾第6腹节注射“可视嵌入性荧光标记”(visible implant elastomer, VIE)荧光染料，以区分不同的家系^[15]。标记后，每个家系分别放置20尾虾在1号和2号养殖池内进行混合养殖，养殖池的面积为14.5 m³。

2019年5月8日至5月10日，即荧光标记后第74天，对混合养殖的凡纳滨对虾进行回捕，并进行性状测试。初始总数量为2400尾，收获时1号池和2号池的实际数量分别为945尾和996尾，存活率约为80%。测量每尾虾的收获体重，记录家系编号、性别、池号和收获日期等信息。

对60个家系进行取样，每个家系随机取样3~7尾，共326尾个体，样品放置在–80 ℃保存，用于基因分型。用SDS法提取对虾肌肉组织的基因组DNA, 然后于北京诺禾致源生物信息科技有限公司对326尾个体进行重测序。重测序基于Illumina测序平台和双端测序方法，首先使用BWA软件将有效高质量测序数据与参考基因组进行比较，根据比对率、覆盖深度和覆盖范围确定每个样本与参考基因组的相似性是否达到重测序分析的要求^[16]。然后用SAMTOOLS软件检测群体SNPs, 通过筛选获得高质量的SNPs^[17]。用ANNOVAR软件对SNPs检测结果进行注释^[18]。

由于createHmf软件生成包含Metafounders的H矩阵时不允许有缺失基因型^[19], 本研究使用Beagle 5.1软件进行了基因型填充，窗口为1 Mb, 重叠区域为100 kb^[20]。

使用PLINK软件进行质量控制，质控标准为最小等位基因频率(MAF) > 0.05。质量控制后，保留的个体数量为326尾，SNP位点数3004471个^[21]。由于createHmf软件对读取的SNP位点数量有限制，因此随机选择了40万个SNP位点用于后续分析。

利用EXCEL软件汇总所有个体的信息，计算凡纳滨对虾不同群体收获体重性状的描述性统计参数，包括个体数量、家系数量、平均值、标准差和变异系数等。

本文建立了4种模型：pBLUP模型，包含遗传组的pBLUP-GG (pBLUP with genetic groups)模型，ssGBLUP模型和包含Metafounders的ssGBLUP-MF (ssGBLUP with Metafounders)模型。利用4种模型进行分析时，采用了1、2号池的945尾和996尾虾的系谱及表型数据。

使用ASRemlR V4包的ainverse函数，生成亲缘关系A矩阵和包含遗传组的A矩阵^[22]。与生成一般的A矩阵不同，生成包含遗传组的A矩阵需要在系谱中加入遗传组信息，即将3个奠基者群体设为虚拟的UPG个体，作为系谱祖先个体^[3]。利用BLUPF90软件中的preGSf90模块，生成包括系谱和SNP信息的H矩阵^[23]。利用createHmf软件生成包含Metafounder的H矩阵，位点间的平均ρ值为0.5^[19]。

利用ASReml-R V4包的平均信息REML方法，结合个体动物模型估计凡纳滨对虾收获体重的遗传参数^[22]。育种分析模型如下：

其中，y_ijkm表示第m尾虾的收获体重；μ表示收获体重的总体均值；S_i表示第i个性别的固定效应；T_j表示第j个测试池的固定效应；T_j(S_i)表示第i个性别和第j个测试池的交互效应；M_k(S_i∙T_j)表示嵌套在第i个性别和第j个测试池交互固定效应内的第m尾虾标记时初始体重协变量，b₁为回归系数；a_m表示第m尾虾的加性遗传效应，假设该效应呈正态分布，$a\~$$(0,A{\sigma _a})$或$a\~(0,H{\sigma _a})$, 其中${\sigma _a}$是加性遗传方差，A为加性亲缘关系矩阵，H为复合系谱和基因组信息的亲缘关系矩阵；ε_ijkm表示第m尾虾的随机残差，$e\~(0,I{\sigma _e})$, 其中σ_e是残差方差，I是单位矩阵。

在本研究中，体重的表型方差$({\sigma _p})$通过以下方法计算：

体重的遗传力(h²)计算方法如下：

使用交叉验证方法来比较不同模型的预测精度。共设置两种交叉验证场景，进行5折交叉验证。两种交叉验证场景的目的分别为评估不同模型对分型和未分型个体的EBV (GEBV)估计准确性的影响。在第一种交叉验证场景中，分型个体被随机分成5组，每个组包括相同数量的个体，在每次分析中，随机选取1组作为验证集，验证个体的体重值被设为缺失，其余4组加未分型个体作为训练集。在第二种交叉验证场景中，未分型个体被随机分成5组，每个组包括相同数量的个体，在每次分析中，随机选取1组作为验证集，验证个体的体重值被设为缺失，其余4组加分型个体作为训练集。用训练群体来预测验证群体的估计育种值。

在每个场景下，5折交叉验证重复了10次。预测精度用两个参数衡量，分别是预测准确性和偏差。预测准确性为验证集的表型值和EBV (GEBV)的皮尔逊相关系数。预测偏差被计算为表型值对EBV(GEBV)的回归系数，回归系数与1的偏离程度表示了偏差大小，回归系数为1时表示对育种值的估计没有偏差。计算50次相关系数和回归系数的平均值，作为预测准确性和偏差。

凡纳滨对虾不同群体收获体重的描述性统计参数见表1。5个群体的平均体重为(20.70±5.23) g。其中，群体S平均收获体重最大，为(26.04±5.43) g, 同时存活率最低，为69.62%, 表明该群体生长速度快；群体E平均收获体重介于群体S和P之间，为(19.50±3.66) g, 存活率最高，为91.83%; 群体P平均收获体重最小，为(16.58±3.40) g, 存活率低于群体E和两个杂交群体PS和SP, 为77.54%; 杂交群体PS和SP, 平均收获体重高于群体P, 分别为(20.86±3.89) g和(22.99±4.58) g, 存活率高于群体S和P, 分别为80.50%和82.92%, 体现出杂种优势。5个群体的收获体重的变异系数范围分别为18.65%~20.85%, 属于中高等的变异水平，表明收获体重性状进行遗传改良具有较大潜力。

表1

表1 　凡纳滨对虾不同群体收获体重性状的描述性统计参数 Tab. 1 Descriptive statistical of harvested weight traits in different populations in Litopenaeus vannamei 群体population 家系数量/个number of  families 个体数量/尾number of  individuals 最大值/g maximum 最小值/g minimum 平均值/g mean 标准差/g standard  deviation 变异系数/% coefficient of  variation 存活率/% survival rate E 15 551 32.04 4.80 19.50 3.66 18.76 91.83 S 13 362 44.91 12.25 26.04 5.43 20.85 69.62 P 15 435 36.46 7.50 16.58 3.40 20.51 77.54 PS 5 161 33.57 13.51 20.86 3.89 18.65 80.50 SP 14 432 36.40 9.90 22.99 4.58 19.90 82.92 注：PS和SP为杂交群体. Note: PS and SP are the hybrid strains.

表1 　凡纳滨对虾不同群体收获体重性状的描述性统计参数 Tab. 1 Descriptive statistical of harvested weight traits in different populations in Litopenaeus vannamei

利用ssGBLUP-MF模型估计的奠基者群体间的亲缘关系矩阵(表2)。其中群体P和群体E的亲缘关系最高，为0.049, 其次为群体S和群体E的亲缘关系，为0.046, 群体S和群体P的亲缘关系最低，为–0.021。

利用四种模型估计的凡纳滨对虾收获体重遗传参数见表3。其中，pBLUP-GG模型估计的加性遗传方差和遗传力最低，为8.76±1.83和0.49± 0.08; 其次为ssGBLUP和ssGBLUP-MF, 两种模型估计的加性遗传方差分别为11.34±2.17和18.91±3.92, 遗传力分别为0.59±0.08和0.77±0.09; pBLUP模型估计的加性遗传方差和遗传力最高，为22.58±4.39和0.91±0.10。与利用pBLUP模型获得的估计值相比，利用pBLUP-GG、ssGBLUP和ssGBLUP-MF模型获得的加性遗传方差分别降低了61.20%、49.78%、16.25%, 遗传力分别降低了46.15%、35.16%、15.38%。

表2

表2 　ssGBLUP-MF模型估计的奠基者群体间的亲缘关系矩阵 Tab. 2 Genetic relationship matrix between founder population estimated by the ssGBLUP-MF model 群体 population P S E P 0.184 –0.021 0.049 S – 0.151 0.046 E – – 0.112

表2 　ssGBLUP-MF模型估计的奠基者群体间的亲缘关系矩阵 Tab. 2 Genetic relationship matrix between founder population estimated by the ssGBLUP-MF model

表3

表3 　凡纳滨对虾4种模型下估计的收获体重遗传参数 Tab. 3 Genetic parameters of harvest weight estimated under four models in Litopenaeus vannamei 模型model 遗传参数 genetic parameter σ a 2 σ e 2 σ p 2 h 2 pBLUP 22.58±4.39 2.24±2.24 24.82±2.23 0.91±0.10 pBLUP-GG 8.76±1.83 9.14±1.02 17.90±1.01 0.49±0.08 ssGBLUP 11.34±2.17 7.81±1.16 19.15±1.18 0.59±0.08 ssGBLUP-MF 18.91±3.92 5.61±1.63 24.52±2.39 0.77±0.09

表3 　凡纳滨对虾4种模型下估计的收获体重遗传参数 Tab. 3 Genetic parameters of harvest weight estimated under four models in Litopenaeus vannamei

利用4种模型获得的凡纳滨对虾收获体重EBV (GEBV)的准确性和偏差见表4。当以分型个体作为验证个体时，pBLUP-GG、ssGBLUP和ssGBLUP-MF模型的预测准确性最高(0.76), pBLUP模型的预测准确性最低(0.68)。与pBLUP模型相比，利用其他3种模型获得的预测准确性高10.53%。4种模型的预测偏差范围在1.10±0.11~ 1.19±0.13, 其中ssGBLUP模型的预测偏差最小(1.10), pBLUP模型的预测偏差最大(1.19), 前者比后者低9%。

表4

表4 　不同模型对凡纳滨对虾体重性状进行交叉验证的结果 Tab. 4 Results of cross-validation of weight traits by different models in Litopenaeus vannamei 方法 method 交叉验证方法 cross-validation methods 分型个体genotyped individuals 未分型个体ungenotyped individuals 预测准确性prediction  accuracy 偏差bias 预测准确性prediction  accuracy 偏差bias pBLUP 0.68±0.06 1.19±0.13 0.64±0.03 1.06±0.08 pBLUP-GG 0.76±0.05 1.19±0.12 0.69±0.03 1.03±0.08 ssGBLUP 0.76±0.04 1.10±0.11 0.69±0.03 1.07±0.08 ssGBLUP-MF 0.76±0.04 1.16±0.11 0.69±0.03 1.03±0.08

表4 　不同模型对凡纳滨对虾体重性状进行交叉验证的结果 Tab. 4 Results of cross-validation of weight traits by different models in Litopenaeus vannamei

当以未分型个体作为验证个体时，pBLUP-GG、ssGBLUP和ssGBLUP-MF模型的预测准确性最高(0.69), pBLUP模型的预测准确性最低(0.64)。与pBLUP模型相比，利用其他3种模型获得的预测准确性高7.25%。4种模型的预测偏差范围在1.03±0.08~1.07±0.08, 其中pBLUP-GG和ssGBLUP- MF模型的预测偏差最低(1.03), ssGBLUP模型的预测偏差最大(1.07), 前者比后者低4%。

本文利用pBLUP、pBLUP-GG、ssGBLUP和ssGBLUP-MF 4种模型，首次系统分析了UPG对凡纳滨对虾收获体重遗传参数估计值的影响。结果表明，与pBLUP模型相比，在模型中考虑UPG效应可避免基础群体加性遗传方差组分被高估，且进一步提高了EBV (GEBV)的预测准确性。

在本研究中，与利用pBLUP模型获得的估计值相比，利用pBLUP-GG模型获得的加性遗传方差降低了61.20%, 遗传力降低了46.15%, 预测准确性提高了7.25%~10.53%, 未分型个体预测偏差降低了2.83%。这表明，遗传组模型可有效地避免基础群体的加性遗传方差被高估^[24,25]。Lu等^[6]利用包括遗传组效应的个体动物模型估计凡纳滨对虾基础群体收获体重的遗传参数，其遗传力从0.09±0.08降低到0.07±0.05, 也表明不同奠基者群体的遗传性能存在差异。Pieramati等^[25]模拟了加入遗传组效应对加性遗传方差的影响，包含遗传组效应后加性方差从9.48±2.66降低到9.15± 2.72。Díaz等^[24]对西班牙Limousine肉牛育种群体210 d体重进行遗传参数估计，包括遗传组的分析模型使加性遗传方差估计值降低13.63%。

由于加入基因组信息可以更精确的评估群体及个体间的亲缘关系^[9], 本文将H矩阵引入模型，利用ssGBLUP模型对基础群体收获体重进行遗传评估。结果表明，与pBLUP模型相比，利用ssGBLUP模型获得的加性遗传方差降低了49.78%, 遗传力降低了35.16%, 预测准确性增加了7.25%~ 10.53%, 分型个体预测偏差降低了7.56%。这表明利用家系内部分同胞个体的基因型信息构建H矩阵，可以修正群体间(内)家系间的亲缘关系，从而能够更为准确地估计方差组分^[9]。因此，当构建基础群体的奠基者个体其群体归属不明确时，利用ssGBLUP模型进行遗传评估可有效的避免加性遗传方差估计不准确的问题。国内外利用ssGBLUP模型对虾类育种群体进行遗传评估的报道较少，Liu等^[9]利用pBLUP模型和ssGBLUP模型估计了罗氏沼虾核心育种群体(由4个奠基者群体组成)四个世代收获体重性状的遗传力，分别为0.11±0.02和0.25±0.03, 结果显示，利用家系亲本的基因型信息进行遗传评估可以避免加性遗传方差被低估。在其他水产动物中，Sae-Lim等^[26]发现ssGBLUP模型对大西洋鲑体重均一性的预测能力比pBLUP模型提高了19%。

利用ssGBLUP模型对育种群体进行遗传评估，理论上要求奠基者个体来自同一祖先群体。当基础群体由多个来源的奠基者组成时，在A或H矩阵中包括UPG, 利用ssGBLUP模型进行评估会产生偏差，使用ssGBLUP-MF模型进行评估可能更为有效^[27]。本研究中，与pBLUP模型相比，利用ssGBLUP-MF模型获得的加性遗传方差降低了16.25%, 遗传力降低了15.38%, 预测准确性增加了7.25%~10.53%, 预测偏差降低了2.52%~ 2.83%。与ssGBLUP模型相比，ssGBLUP-MF模型的预测准确性并没有提升，推测主要原因是3个奠基者群体间为低度的亲缘相关，亲缘关系较远所致(表2)。Granado-Tajada等^[28]比较了pBLUP和ssGBLUP-MF模型对奶羊遗传评估效果的影响，结果显示二者的预测准确性相同，主要是因为青年公羊同胞个体数量少(仅2~3只)、基因分型个体比例低(只对雄性分型，仅占全部动物的0.19%)等导致参考群体与验证群体间的遗传联系不够紧密所致。

在本研究中，凡纳滨对虾收获体重的遗传力估计值(0.49±0.08~0.91±0.10)高于大部分已报道的估计值(0.07±0.05~0.52±0.03)^[6,29,30]。推测其原因，主要是因为基础群体家系间缺乏有效的遗传联系，半同胞家系占比仅为21%, 导致加性遗传效应和共同环境效应混淆在一起，遗传力被高估^[31]。在斑节对虾^[32]、日本囊对虾^[33]、斑点叉尾鮰体重^[31]和凡纳滨对虾饲料转化率^[34]的遗传参数估计报道中，均存在由于家系间遗传联系较弱，导致遗传力估计值偏高问题。因此，进一步增加单世代半同胞家系数量占比，以及利用多世代数据进行综合遗传评估，是避免遗传力被高估的有效途径^[9]。然而利用多世代数据，可能会存在由于亲子代间遗传联系不足以剖分出世代间环境差异，从而导致遗传力被低估的问题，已在罗氏沼虾^[35]和罗非鱼^[36,37]等相关研究中报道。