2021, Vol. 28 
2. 盐城恒兴饲料有限公司，江苏 盐城 224100
2. Yancheng Hengxing Feed Company, Yancheng 224100, China
近年来，水产养殖中抗生素的使用日益突出，绿色、环保、安全、高效的饲料添加剂受到人们的关注。如何获得既无药物残留、无副作用，还能促进动物生长，增强机体免疫的饲料添加剂，成为科研工作者关注的焦点。果寡糖(Fructooligosaccharide, FOS)广泛存在于大多数植物中，是一种天然饲料添加剂，具有提高水产动物的免疫力、改善肠道微生物区系、降低血清胆固醇、促进营养物质吸收利用等生理功能[1], 已有研究表明果寡糖有提高水产动物的增重率，降低饵料系数，增强动物免疫力和抗氧化功能，降低死亡率的显著效果[2-3], 在水产上作为新型饲料添加剂受到人们的青睐。
德式乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)是一种优质、安全的益生菌，已有研究报道德式乳酸菌有增强鱼类对饲料的利用率、提高生长性能、促进机体免疫和调节肠道微生物平衡等多种功效[4-7]。研究发现益生菌和益生元联用，可以有效提高益生菌对鱼体的保护效果[8]。Addo等[9]发现，芽孢杆菌和半纤维素提取物联合使用效果好于单一使用益生菌。但是Cerezuela等[10]研究发现了不同的结果，芽孢杆菌联合菊粉在调节金头鲷(Sparus aurata)促炎因子表达上的效果并不好于单一使用芽孢杆菌。关于果寡糖和德式乳酸菌联用对锦鲤的生长性能、消化酶和免疫指标活性的影响还见未报道。果寡糖与德式乳酸菌在鱼类肠道中的作用关系较为复杂，更有待进一步探讨研究。
锦鲤(Cyprinus carpio)体色鲜艳，金鳞赤尾，肉质鲜美，具有生长速度快，适应性强、易饲养、市场价格高等优点，但是目前大规模、高密度养殖，使其抗病力有所下降[11], 因此如何提高锦鲤健康状况，是研究者有待解决的问题之一。本研究旨在研究饲料中添加果寡糖、德式乳酸菌及其复合物对锦鲤的影响，探讨二者对锦鲤的作用效果及作用机理，为果寡糖和乳酸菌在水产饲料中的合理利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验饲料根据锦鲤的营养需要配制实验用基础饲料，基础饲料的配方和营养水平组成见表1, 饲料原料购自洛阳奥华饲料有限公司，各饲料原料粉碎度均过60目筛; 果寡糖和德式乳酸菌分别与对应组的预混料混合均匀后(果寡糖和德式乳酸菌的添加量来自前期的实验结果), 再加入到相应的基础饲料中，各成分经充分混匀后，然后加入鱼油、豆油和足够的水分，在绞肉机上挤压成直径为2.5 mm的颗粒，自然烘干后，放自封袋中保存于4 ℃冰箱备用。
1.2 实验管理养殖实验在河南科技大学动物科技学院水族科学实验室进行，实验用锦鲤由洛阳市李楼镇某养殖场提供，实验室条件下暂养2周(暂养池：1.6 m× 1.0 m×0.8 m), 暂养期间投喂基础日粮，驯化后，挑选体格均一、健康初重(12.5±0.5) g的锦鲤240尾，将实验鱼随机分为4组，每组3个重复，每缸放20尾鱼，第1组投喂基础日粮(D1), 第2组投喂基础日粮+0.3%果寡糖(D2), 第3组投喂基础日粮+1×107德式乳酸菌(D3), 第4组投喂基础日粮+0.3%果寡糖和1×107德式乳酸菌(D4), 实验在室内玻璃缸(长宽高：60 cm×40 cm×40 cm)中进行，水质条件: 水温(25±1) ℃, 溶氧≥6 mg/L, 氨和亚硝酸盐<0.001 ppm, pH 7.3±0.3, 光照 : 黑暗14 h : 10 h, 每天对水质进行测定并记录，每隔两天换水1次，换水量为总水量的1/5, 每天投喂两次(8:00, 17:00)实验鱼，初期日投喂量为鱼体重的2%~5%, 后期根据增重情况和吃食情况进行调整，本养殖实验持续8周。
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表1 饲料配方及营养组成(风干基础) Tab. 1 Feed formulation and the nutrient composition of the diets (air dry basis) |
养殖实验结束后，采取24 h饥饿处理，采样前用浓度为100 mg/L的MS-222进行麻醉，统计每缸鱼的总数和总重量，计算其生长性能，每缸随机取出6尾鱼，尾静脉取血，转移至10 IU/mL抗凝剂(肝素钠)润过的离心管中，静止1 h后，用离心机在4 ℃、3000 g条件下离心10min, 吸取上清液放入–80 ℃保存，以备分析血液生化指标和免疫指标，采血后解剖实验鱼，快速分离肠道和肝脏，充分清洗干净后，用滤纸吸干，–80 ℃保存备用。
1.3.1 饲料营养成分分析饲料中营养成分的分析采用国标法，水分用烘箱在105 ℃下烘干至恒重，根据水分损失量计算饲料中水分的含量，粗脂肪的测定用索式抽提器(BUCHI公司，瑞士), 粗蛋白用凯氏定氮仪(Foss, 瑞士)测定，粗灰分的测定用马弗炉在550 ℃下灼烧。
1.3.2 生长性能测定增重率(weight gain, WG) = 100×(Wf – Wi)/Wi。
特定增重率(specific growth rate, SGR) = 100 × (lnWf –ln Wi)/t。
饵料系数(feed conversion ratio, FCR) = 摄食量(g)/(Wf–Wi)。
摄食率(feeding rate, FR, %)=100×W/[(Wf + Wi)/2]/t。
蛋白质效率(protein efficiency ratio, PER, %)= 100×(Wf – Wi)/Wp。
成活率(survival rate, SR) = Nf/Ni。
式中，Wf是末重(g); Wi是初重(g); t是实验天数; W是摄食饲料的总重量; Wp是摄食蛋白质的重量; Nf是实验结束时每缸鱼的总数; Ni是实验开始时每缸鱼的总数。
1.3.3 肠道消化酶的测定称取适量肠道，按照1 : 4加入生理盐水，冰浴条件下进行匀浆，然后在4 ℃、3000 g条件下进行离心10 min, 收集上清液放–20 ℃保存，以备后续分析。蛋白酶测定采用富林酚法，脂肪酶和淀粉酶的测定用分光光度计法，酶的单位为酶活力单位/mg蛋白(U/mg prot)。
1.3.4 血液生化指标测定血液生化指标谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)采用比色法测定，酶终点比色法测定甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC), 总蛋白(TP)采用双缩脲法，白蛋白(ALB)采用溴钾酚绿法，试剂盒购自南京建成生物有限公司。
1.3.5 血液免疫指标测定溶菌酶活性(LYS)用自身对照法测定，对硝基酚磷酸钠法测定酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活性，酶联免疫吸附法测定补体C3和C4的含量，试剂盒均购自南京建成生物有限公司。
1.3.6 肝脏抗氧化指标测定准确称取大约0.2 g的肝脏，按1 : 9(重量 : 体积)的比例制成10%的组织匀浆液，3000 g离心10 min, 取上清液–20 ℃保存备用，南京建成生物工程有限公司提供的试剂盒测定氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化酶(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量，单位分别以U/mg prot、nmol/mg prot表示，肝脏中蛋白质的含量用考马斯亮蓝商业试剂盒进行测定。
1.4 统计分析实验数据先用Excel整理，再用SPSS(17.0)进行双因素方差分析(two-way ANOVA)分析，然后用Duncanas进行多重比较分析，数据用平均值± 标准误($\bar{x}\pm \text{SE}$)表示，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤生长性能的影响由表2可知，与对照组相比，3个实验组的WG和SGR都有不同程度的提高，其中D4组效果最好，WG提高62.66%, 该组WG显著高于对照组(P<0.05), D2组和D3组之间差异不显著 (P>0.05); 各实验组FCR有不同程度的降低，其中D2和D4组显著低于对照组的FCR(P<0.05), FCR在D2、D3和D4组之间差异并不显著(P>0.05); 各组PER都有所提高，其中D4组显著高于对照组，各实验组差异不显著(P>0.05); 对照组和实验组之间成活率无显著差异(P>0.05)。
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表2 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤生长性能的影响 Tab. 2 The effects of dietary FOS and Lactobacillus delbrueckii on growth performance of Cyprinus carpio$\bar{x}\pm \text{SE}$ |
由表3可知，各实验组肠道消化酶活性均有不同程度的升高，其中蛋白酶和脂肪酶活性在D4组最高，D4组蛋白酶活性显著高于对照组和D2组(P< 0.05), 脂肪酶在实验组均显著高于对照组(P<0.05), 淀粉酶在D2组显著高于对照组(P<0.05), 但脂肪酶和淀粉酶活性在各组之间差异不显著(P>0.05)。
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表3 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤肠道消化酶的影响 Tab. 3 The effects of dietary FOS and Lactobacillus delbrueckii on intestinal digestive enzymes of Cyprinus carpio$\bar{x}\pm \text{SE}$ |
血液生化指标分析见表4, 各实验组的AST、ALT酶活性以及TG、TC含量与对照组相比，均有不同程度的降低，其中D4组的AST和ALT活性显著低于对照组(P<0.05), 但各实验组的AST和ALT活性差异不显著(P>0.05); TG含量在各实验组均显著低于对照组(P<0.05); D4组TC含量显著低于对照组(P<0.05), D2组、D3组与对照组相比差异不显著(P>0.05), 各组血清TP和ALB均无显著差异(P>0.05)。
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表4 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤血液生化指标的影响 Tab. 4 The effects of dietary FOS and Lactobacillus delbrueckii on blood biochemical indexes of Cyprinus carpio$\bar{x}\pm \text{SE}$ |
由表5可知，血液免疫指标活性在实验组都有不同程度的升高，各指标在果寡糖和德式乳酸菌复合组活性最高，其中LYS和ACP活性以及补体C3含量在D3组和D4组均显著高于对照组(P<0.05), 但是与D2组差异不显著(P>0.05), 补体C4含量在D2、D3和D4组均显著高于对照组(P<0.05), 但D2、D3和D4组之间差异不显著(P>0.05); 血浆AKP活性在各组之间差异均不显著(P>0.05)。
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表5 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤血液免疫指标的影响 Tab. 5 The effects of dietary FOS and Lactobacillus delbrueckii on blood immune indexes of Cyprinus carpio$\bar{x}\pm \text{SE}$ |
饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤抗氧化指标的影响见表6, 抗氧化指标SOD、CAT、GPX和T-AOC活性均有不同程度的升高，其中SOD和T-AOC活性在D3组和D4组显著高于对照组(P<0.05), 各实验组之间差异不显著(P>0.05); D4组的CAT活性最高，显著高于对照组(P<0.05), 但是D2、D3 和D4组之间差异不显著(P>0.05); GPX活性有一定的升高趋势，但是各组之间差异不显著(P>0.05); 实验组MDA含量有不同程度的降低，其中D3和D4组的MDA含量显著低于对照组(P<0.05), 但是各实验组之间差异不显著(P>0.05)。
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表6 饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤抗氧化指标的影响 Tab. 6 The effects of dietary FOS and Lactobacillus delbrueckii on antioxidant indexes of Cyprinus carpio$\bar{x}\pm \text{SE}$ |
关于果寡糖和德式乳酸促进鱼类生长的研究已有报道，唐娟等[4]、Zhang等[8]研究得出饲料中添加适量的果寡糖和德式乳酸菌能有效提高三角鲂和黄河鲤的生长性能和肠道消化酶活性; Poolsawat等[12]的研究表明在石斑鱼饲料中添加果寡糖能够提高其增重率和肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性; 赵峰等[13]实验结果表明，饲料中添加0.4%果寡糖+0.2%芽孢杆菌能提高奥尼罗非鱼的生长性能，并且二者联用的效果要好于单独使用任何一种添加剂; 本研究结果与上述研究基本一致，饲料中添加果寡糖、德式乳酸菌和二者复合物均能不同程度的提高锦鲤的增重率、特定生长率和肠道消化酶活性，降低饵料系数，提高了饲料的有效利用率。生长性能和肠道的功能密切相关，比如肠道消化酶活性的提高，肠道菌群、代谢物、pH等的变化都有助于鱼类对饲料中营养成分的消化、吸收和利用，具体还需进一步研究; 另外，益生菌自身含有丰富的蛋白质、维生素等营养物质，其在增殖过程中分泌的酶可以促进宿主对营养物质的消化吸收[14]。本研究得出果寡糖和德式乳酸菌二者联用效果要好于单独使用，类似的研究在卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)上也有报道，研究结果表明饲料中添加5.62×107枯草芽孢杆菌和0.2%果寡糖，卵形鲳鲹的特定生长率比单独添加果寡糖或者芽孢杆菌效果都要好[15]; 日本鳗(Anguilla japonica)饲料中添加甘露寡糖和枯草芽孢杆菌以及二者的复合物，研究结果得出复合组的增重率、特定生长率和蛋白质效率都显著高于对照组[16]。但是Ai等[17]研究果寡糖和枯草芽孢杆菌对大黄鱼的生长并无显著的复配作用，这可能与养殖品种、养殖环境以及饲料添加剂的添加量有关。
3.2 果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤肠道消化酶活性的影响肠道消化酶活性是评判肠道消化功能的重要指标[18]。蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶主要用来消化营养物质中的蛋白、脂肪和淀粉[19], 消化酶活性的升高证明添加果寡糖和德式乳酸菌能提高锦鲤对三大营养物质的消化利用率，提高蛋白质效率和生长性能。肠道消化酶的提高可能是由于肠道内微生物的菌群的结构发生变化，比如，双歧杆菌、乳酸杆菌有益菌的数量增多，而大肠杆菌、梭状杆菌等有害菌的数量减少，大多数的有益菌能促进消化酶的分泌和胃肠蠕动[20]。果寡糖和芽孢杆菌的添加能提高肠道消化酶活性和促进肠道微绒毛发育，在三角鲂上的研究已有报道[8]; 并且已有研究报道果寡糖和芽孢杆菌能提高肠道黏膜免疫防御机能，改善肠道内环境，促进肠道健康，这都可能是提高锦鲤肠道消化酶活性的原因[21]。
3.3 果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤血液生化指标的影响鱼类血液生化指标能够反映机体的生理状况和健康情况。AST和ALT主要存在肝组织中，当肝脏受损时，AST和ALT会渗入血液，血液中二者活性越高，证明肝脏受损越严重。本研究结果表明复合添加剂组AST和ALT显著低于对照组，Hassaan等[22]研究得出尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲料中添加芽孢杆菌和酵母提取物，血清AST和ALT活性显著下降; Marzouk等[23]对罗非鱼的研究得出了相似的结果; 但是赵峰等[24]研究得出罗非鱼饲料中添加果寡糖和枯草芽孢杆菌，血清AST和ALT活性并无显著变化。实验组TG和TC含量有不同程度的降低，这表明果寡糖和德式乳酸菌有调节脂肪代谢的作用，TG和TC是反映脂肪代谢的重要指标，若血液中二者含量过高，表明体内脂肪积累较多，容易引起脂肪肝、肝肥大等疾病，研究发现果寡糖能降低血液TG和TC含量，这可能与果寡糖降低体内脂肪合成代谢酶含量，抑制脂肪合成，从而降低细胞内TG含量有关[25]。
3.4 果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤免疫指标的影响鱼类的非特异性免疫是鱼类免疫的重要组成部分，能抵抗所有的病原体。血清溶菌酶活力是非特异性免疫的一个重要指标，存在鱼类的皮肤、血清和各类腺体分泌物中，能够杀灭革兰氏阳性菌，对于抵抗各种病原体的入侵具有重要意义[26]。ACP和AKP是机体内重要的磷酸酶，主要参与机体的信号传导、能量转化和磷酸酯的代谢等，同时也是溶酶体的重要标志，在参与机体免疫方面起到重要作用[27]。补体C3、C4含量在一定程度上也能反映机体的免疫力。本研究结果得出饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌不同程度的提高了血液LYS、ACP、AKP的活性以及补体C3、C4含量，增强机体的非特异性免疫。这可能是因为果寡糖和德式乳酸菌作为调节肠道微生态平衡的因子[28], 能够促进有益菌比如乳酸菌、双歧杆菌的增殖，可降低大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌的数量，有益菌能分泌大量的胞外糖苷酶，可降解肠道上皮细胞的多糖类物质，这些物质又是病原菌分泌的凝聚素或者是细菌的受体，从而阻止病原菌在肠道黏膜的定植，已有大量研究得出果寡糖和有益菌有提高鱼类免疫力和抑制有害菌增殖的作用[29-31], 此外果寡糖还有结合病原菌表面凝聚素的能力，使病原菌失去致病能力[1]。在饲料中添加适量壳聚寡糖和芽孢杆菌后，投喂锦鲤，复合组的免疫指标活性和抗病力有显著提高[29]; Zhang等[32]研究指出海参饲料中添加果寡糖和枯草芽孢杆菌显著增强海参的免疫力，提高其抗病力，降低死亡率; 类似的研究结果在三角鲂[31]、日本鳗鲡[16]和南亚野鲮(Homarus gammarus L.)[33]上都有报道; 果寡糖和德式乳酸菌的联合作用可能因为果寡糖可以为益生菌提供碳源，促进有益菌的生长、增殖，而不能被梭状芽孢杆菌、大肠杆菌等有害菌利用[34]。
3.5 果寡糖和德式乳酸菌对锦鲤抗氧化指标的影响正常状态下，机体的氧化系统和抗氧化系统处于平衡状态，鱼体内的SOD、CAT和GPX在机体抗氧化过程中发挥着重要作用，其中SOD主要催化O2–生成H2O2,从而清除O2–, 而CAT进行下一步，把H2O2催化生成水和氧气[35]。本研究得出饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌能使这些抗氧化酶的活性不同程度的提高，证明果寡糖和德式乳酸菌能增强锦鲤抗氧化的能力，调节体内氧化和抗氧化的平衡。关于果寡糖和有益菌的抗氧化功能在以前的研究也有报道，Zhang等[31]研究得出在三角鲂饲料中添加适宜水平的果寡糖和芽孢杆菌，显著提高了三角鲂的抗氧化能力; Poolsawat等[12]研究指出，果寡糖提高了罗非鱼血清抗氧化酶活性，降低了血清MDA含量。Dawood等[36]研究得出乳酸菌提高了罗非鱼血清SOD和CAT酶活性。本研究还得出饲料中添加果寡糖和德式乳酸菌能降低MDA的含量，MDA是脂质过氧化的反应产物，在一定程度上能反映机体过氧化受损状况，本研究结果表明果寡糖和德式乳酸菌有增强锦鲤的抗氧化功能，降低脂质过氧化产物的含量，防止机体受损。
4 结论在本研究条件下，锦鲤饲料中添加0.3%果寡糖和1×107德式乳酸菌可提高锦鲤的生长性能、肠道消化酶活性，改善免疫和抗氧化功能，且果寡糖和德式乳酸菌配伍效果更佳
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