从19世纪末期至今，世界各国相继开展了大量增殖放流实践，以试图解决世界性海洋渔业资源日益衰竭的问题，而对增殖放流活动的生态风险进行系统评价及有效的生态风险预警和防控，亦已成为目前增殖放流领域的研究热点^[1]。海洋渔业增殖放流效果评估方法有很多，虽然一些研究表明通过渔业资源评估模型可以间接地评估增殖放流效果^[2]，然而通过标记回捕方法对放流效果进行评估仍然是最精确、最直接的方法。传统物理标记放流法存在操作复杂、价格昂贵、标记易脱落以及损伤鱼体等缺点，不利于实际有效地开展放流效果评估。随着分子标记技术的发展，利用携带特定分子标记个体来替代传统物理标记个体，通过分子标记溯源分析来鉴别标记个体，已成为渔业生物增殖放流评估的一种可行途径^[3]。微卫星(simple sequence repeat, SSR)分子标记因其在基因组中具有分布广泛、多态性性高、共显性遗传等特点，是目前进行个体或系谱溯源跟踪的理想分子标记，其可靠性也已在一些鱼类的亲子溯源鉴定中得到证实。目前国际上如日本的Sekino^`等^[4]结合微卫星位点与线粒体DNA (mtDNA)控制区核苷酸序列作为遗传标记对日本养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)的放流群体进行溯源，成功地鉴别出35条放流个体；国内杨长平等^[5]利用微卫星标记亲子鉴定技术对珠江口海域的岩礁定居性鱼类黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)进行了增殖放流效果评估。但目前国内利用该技术进行洄游性海水鱼类增殖放流的效果评估工作尚未见公开报道。

大黄鱼(Larimichthys crocea)俗称黄花鱼，其分布范围覆盖北起黄海中南部、南至琼州海峡的中国近岸海域，是我国最重要的海洋经济鱼类之一^[6], 20世纪70年代以前的大黄鱼野生资源丰富，但由于过度捕捞和栖息环境恶化而导致我国大黄鱼野生资源量的急剧恶化和枯竭，已成为众所周知的人类活动破坏重要渔业资源的典型案例。为保护、恢复急剧衰退的大黄鱼渔业资源，随着大黄鱼人工养殖业的发展，特别是大黄鱼人工繁育关键技术的突破，福建省宁德市于1987年率先开始大黄鱼增殖放流尝试，通过释放人工繁育大黄鱼鱼苗到自然水域中补充野生大黄鱼种群数量，并验证了放流后代可在野外成功存活^[7]。2000年以后，基于大黄鱼规模化人工繁育产业的建立，福建宁德、浙江舟山和宁波等地开始了大黄鱼系统性增殖放流活动，2010年以后，江苏沿海和福建厦门、漳州等地区也开始了大黄鱼的增殖放流。作为大黄鱼主要的放流海区，据近10年官方统计，福建宁德三沙湾大黄鱼放流规模已达到年均500万尾左右。据《福建省渔业统计年鉴》数据显示，2000年迄今福建省大黄鱼年捕捞产量长期在4000 t左右波动，捕捞产量并未呈现逐年增长的趋势。而据2011—2014年福建省组织开展的大黄鱼增殖放流效果评估调查资料显示，官井洋大黄鱼繁殖保护区的大黄鱼资源量却有明显增加^[8]，表明增殖放流是增加自然海域大黄鱼渔业生物量甚至恢复资源量的有效途径之一^[9]。由于通过捕捞产量间接判断增殖放流效果可能存在较多因素的干扰，对特定区域的调查亦可能得出片面性的结果，而最关键的是，能直接体现放流效果及放流群体动向的传统物理标记评估一直难以在大黄鱼上进行大规模的应用。基于分子标记所具有的优点，本研究以所筛选的大黄鱼相关微卫星位点为基础，结合盲样实验验证了其在大黄鱼亲子溯源中具有准确性，在此前提下，对2019年福建三沙湾海域放流的大黄鱼进行跟踪溯源分析，尝试应用微卫星分子标记对大黄鱼增殖放流效果进行评估的可行性，以期为三沙湾大黄鱼增殖放流策略的制定提供数据支撑与理论指导。

本研究用于增殖放流标记的大黄鱼亲本(简称“标记亲本”)(雌雄各50尾)来自中国福建省宁德富发水产有限公司(简称“宁德富发”)的大黄鱼育苗场。用于盲样实验的子代共150尾，均为体长5 cm左右的幼鱼，其中50尾来自上述100尾标记亲本的子代群体，其余100尾来自于其他育苗场。

所有标记亲鱼置于室内同一水泥池中混合培养并促使其自然产卵，连续收集受精卵并将其放置于孵化槽内孵化，孵化后幼体培育至体长5~7 cm时进行放流。福建省宁德市三沙湾官井洋历史上一直是大黄鱼产卵场及育幼场，亦是宁德市大黄鱼增值放流的主要场所，本研究同样选择此海域作为放流及回捕的实验场所。2019年6月25日宁德市富发水产有限公司在三沙湾的青山岛东部海域(图1星号处)共放流300万尾大黄鱼幼鱼，其中13万尾为来源于标记亲本子代的幼鱼(简称“标记幼鱼”)，将作为内参用于回捕个体的检测和回捕率评估。从2019年7―9月，以官井洋为主，在三沙湾海域不同位置，随机回捕大黄鱼样本共295尾。回捕地点、时间、捕捞工具和回捕个体数量、样本体长体重数据等具体信息见表1。

图1

图1 　三沙湾采样站位分布图 Fig. 1 　The sampling sites in Sansha Bay

回捕群体共295尾，主要来自官井洋海域(包括青山岛四周海域、鸡公山岛东面和东冲口等海域)(图1)。所有大黄鱼样品剪取肌肉组织以备基因组DNA提取。样本基因组DNA提取采用传统的酚氯仿法^[10]，分别采用分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA纯度及完整度进行检测。

表1

表1 　大黄鱼回捕样本信息 Tab. 1 　The information of recaptured Larimichthys crocea samples 编号serial number 采样时间 sampling time 采样地点 sampling site 数量 n 平均体长/cm body length 平均体重/g  body weigth 捕捞工具 fishing tool SSW2019071601-120 2019/7/16 青山岛四周海域 120 11.00 21.60 定置网set net YCSS2019072963-70 2019/7/29 鸡公山岛东侧 8 10.24 19.35 定置网set net YCSS2019073101-62 2019/7/30 青山岛南侧 62 11.21 20.10 定置网set net YCSS2019081501-58 2019/8/15 鸡公山岛东侧 24 9.41 15.42 定置网set net 东冲口 11 9.55 16.15 定置网set net 青山岛东侧 23 11.56 13.76 定置网set net YCSS2019090301-47 2019/9/3 鸡公山岛东侧 16 10.49 19.89 定置网set net 青山岛南侧 31 10.30 18.67 定置网set net

表1 　大黄鱼回捕样本信息 Tab. 1 　The information of recaptured Larimichthys crocea samples

本研究首先利用100尾标记亲本对已发表文献中筛选出的15个大黄鱼候选微卫星位点进行多态性检测评估^[11-13]。从中筛选出8个多态性最为丰富的位点进行标记亲本微卫星PCR扩增，8个位点的等位基因数据用于构建标记亲本的基因分型数据库。

待测的150尾盲样先由采集人进行随机编号，在仅有采集人知道待测个体遗传背景的前提下进行微卫星分子标记的亲子溯源检测。根据检测结果再与已知的个体遗传背景进行对照，以确定通过所筛选的微卫星引物进行分子标记亲子溯源的准确率和该技术的有效性。

微卫星PCR扩增体系包括: PCR扩增预混液Taq Master Mix (Dye Plus) 12.5 µL (南京诺唯赞公司)，模板DNA (50 ng/µL) 1.0 µL，各位点微卫星正反向特异性引物(5 mmol/L)各1.0 µL，灭菌ddH₂O 9.5 µL补充至总反应体系25 µL。引物由生工(上海)生物工程股份有限公司合成，每个位点特异性扩增的正向引物5′端分别用下列4种荧光染料中的1种进行修饰: 6-FAM, HEX, ROX和TAMRA。PCR扩增体系和反应程序参考Lyu等^[14]的优化体系。PCR产物通过ABI 3730型全自动基因测序仪进行基因分型，等位基因大小由GeneScanTM-500 LIZ标准(ABI)进行测量，并使用GeneMapper™V4.1 (ABI)进行判读及数据收集。

利用Cervus 3.0.7^[15]软件计算微卫星位点的等位基因频率、杂合度(H)、多态信息含量(PIC)及进行哈迪-温伯格平衡(HWE)分析，同时进行排除率和无效等位基因频率分析。利用Cervus 3.0.7模拟分析微卫星位点数量与累积排除概率的关系。根据累积排除率和建议LOD值等参数进行标记亲本和回捕个体亲权关系的分析。

剔除扩增不成功或多态性含量低的7个位点之后，从15个微卫星位点中筛选获得8个多态性较高的微卫星位点用于随后的亲子溯源分析。8个微卫星位点信息如表2所示。

表2

表2 　筛选获得的8个用于亲子溯源分析的大黄鱼微卫星位点信息 Tab. 2 　Basic information of eight selected SSR loci used for the parentage analysis in Larimichthys crocea 位点  locus 重复单元 repeat module 荧光引物标记dye lable 引物序列 primer sequence 片段大小/bp size 退火温度/℃ Tm LYC01 (CTTTT)9 FAM F: 5′-ATGCTGACCCATGTTGGACT-3′ 197′250 58       R: 5′-TGCATGCAGTCAAAATACCA-3′ LYC07 (CTTTT)9 ROX F: 5′-CCTGTTTTGCTCTCCTCTGG-3′ 185′227 58       R: 5′-GCAGCACACAATGGAAACAC-3′ LYC013 (CTTTT)8 FAM F: 5′-GAATGGCATAGAGCCCGTAA-3′ 161′274 56       F: 5′-GAATGGCATAGAGCCCGTAA-3′ LYC017 (CTTTT)8 HEX F: 5′-TTCAAGGAGCCCAGTATGGT-3′ 219′290 59       R: 5′-CTTGAGAATGAGCGCAACAG-3′ LYC033 (CTTTT)8 ROX F: 5′-TGCATGTCTCAGTCCCTGAA-3′ 245′285 59       R: 5′-AAGTCTTCCCAGCATGCACT-3′ LYC042 (CTTTT)9 FAM F: 5′-ATTCAGCGCGAAGCTCTTT-3′ 210′280 55       R: 5′-ATTTACTTTTCGGGGCTGCT-3′ LYC047 (CTGT)9 HEX F: 5′-AATGTGGACGGAGTTGCTTC-3′ 147′220 59       R: 5′-CCCCAATCTCCCACTAATCC-3′ LYC059 (ACAT)9 TAM F: 5′-CACAGCCTTTCTTTGGAATCA-3′ 120′180 59       R: 5′-CACTGTCACTTTTGCTGTATGGA-3′

表2 　筛选获得的8个用于亲子溯源分析的大黄鱼微卫星位点信息 Tab. 2 　Basic information of eight selected SSR loci used for the parentage analysis in Larimichthys crocea

8个微卫星位点在100尾大黄鱼标记放流亲本中共检测得到78个等位基因。其中等位基因数最少的位点为LYC033，只有5个等位基因，最多的位点为LYC017，检测到14个等位基因。观测杂合度(H_o)与期望杂合度(H_e)范围分别为0.511~0.939 (平均值为0.764)和0.643~0.897 (平均值为0.781)。8个微卫星位点多态信息含量为0.587~0.883 (平均值为0.751)，均表现出高度多态性(PIC>0.5)。此外，哈迪-温伯格平衡(HWE)检测结果显示，位点LYC033极显著偏离(P<0.001) HWE，位点LYC013也与HWE显著偏离(P<0.05) (表3)。

利用Cervus 3.0.7软件，评估出的8个微卫星位点单一及累积个体排除概率表明，在候选亲本基因型未知的情况下(NE-1P), 8个微卫星位点的单一非排除率(non-exclusion probability, NEP)为35.8%~77.2%，仅一个单亲已知基因型的情况下(NE-2P)非排除概率为21.7%~60.8%，个体双亲基因型均已知的情况下(NE-PP)非排除概率为7.4%~42.9% (表4)。在个体双亲基因型未知以及单一亲本基因型已知的条件下，8个位点的累积排除概率分别为99.43%和99.98%，而对于个体双亲基因型已知的情况下，8个位点的累积排除概率为99.99%，具有很高的累积排除概率(表4)。

表3

表3 　8个微卫星位点的遗传多样性信息 Tab. 3 　The information of genetic diversity for eight SSR loci 位点 locus 等位 基因数K 观测 杂合度 Ho 期望 杂合度 He 多态性 PIC 哈迪- 温伯格平衡 HWE LYC01 8 0.511 0.691 0.662 NS LYC07 9 0.82 0.82 0.793 NS LYC013 10 0.653 0.795 0.766 * LYC017 14 0.869 0.852 0.831 NS LYC033 5 0.839 0.643 0.587 *** LYC042 13 0.939 0.897 0.883 ND LYC047 9 0.77 0.771 0.739 NS LYC059 10 0.71 0.779 0.745 NS 平均值mean 9.8 0.764 0.781 0.751   注: ND表示无结果；NS表示偏离哈迪-温伯格平衡不显著(P>0.05); *指显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.05); ***表示极显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.001). Note: ND means no results; NS means no significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05); * means significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05); *** means extremely significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.001).

表3 　8个微卫星位点的遗传多样性信息 Tab. 3 　The information of genetic diversity for eight SSR loci

表4

表4 　8个微卫星位点的单一及累积排除概率 Tab. 4 　Single-locus exclusion probability and combined exclusion probability (CEP) of eight SSR loci 位点 locus 无效等位 基因频率 frequency of null 非亲权排除概率non-exclusion probability 累积排除 概率 CEP NE-1P NE-2P NE-PP LYC01 0.151 0.698 0.510 0.300 0.870853 LYC07 −0.004 0.533 0.359 0.179 0.990452 LYC013 0.101 0.570 0.392 0.201 0.998491 LYC17 −0.016 0.464 0.300 0.129 0.999647 LYC033 −0.155 0.772 0.608 0.429 0.999929 LYC042 −0.025 0.358 0.217 0.074 0.999984 LYC047 −0.009 0.604 0.424 0.228 0.999997 LYC059 0.044 0.602 0.423 0.234 0.999999 注: NE-1P指双亲基因型未知时单亲本的非亲权排除概率；NE-2P指单亲基因型已知时的另一亲本的非亲权排除概率；NE-PP指双亲基因型已知时父母本的非亲权排除概率；CEP指代累积排除概率. Note: NE-1P means non-exclusion probability for one candidate parent; NE-2P means non-exclusion probability for one candidate parent given the genotype of a known parent of the opposite sex; NE-PP means non-exclusion probability for a candidate parent pair; CEP means combined exclusion probability.

表4 　8个微卫星位点的单一及累积排除概率 Tab. 4 　Single-locus exclusion probability and combined exclusion probability (CEP) of eight SSR loci

8个微卫星位点提供的大黄鱼亲子溯源能力及准确性在盲样实验中得到了验证: 将亲本已知50尾子代与其他100尾个体作为盲样，基于8个微卫星位点对100尾标记亲本与上述150尾盲样进行了亲子溯源分析，成功鉴别出47尾来自于放流亲本的子代，匹配率达到了94%，累积排除率在99.99%以上。

利用软件Cervus 3.0.7对100尾标记亲本与回捕的295尾大黄鱼子代基因型数据进行亲子溯源鉴定分析。判定结果在95%置信区间且LOD值超过临界值的亲子关系，视为来自于标记亲本的子代。亲权鉴定结果显示，共有5尾回捕大黄鱼样本是来自于100尾放流亲本(表5)，这5尾标记放流个体分别在青山岛附近海域(2尾)、鸡公山岛东北面海域(1尾)和青山岛南面海域捕获(2尾)。

通过微卫星分子标记放流个体溯源，依据放流群体中“标记”大黄鱼的投放比例，结合所“检出”标记大黄鱼数量来推算出回捕群体中来自于宁德富发的大黄鱼放流数量，进而实现回捕率精确估算。在放流群体中，“标记”个体与混合背景群体(300万)的比例为4.33% (13/300)。7月从官井洋海域回捕到的190尾大黄鱼中，共鉴定出“标记”个体5尾，按照放流时的比例4.33%，可推算出回捕的样本中放流群体数为115尾，由此推算，7月回捕样本中富发放流个体所占比例为60.53% (115/190)。8、9月的回捕样本中未能检出标记个体。在本次的放流评估中，根据推算出来的回捕样本中放流群体数量(M)和实际放流数量(N)，可算出7月富发公司的放流大黄鱼回捕率为0.0038%。此外，按照回捕样本中宁德富发放流个体所占的比例60.53%，也可推算出2019年6月底(放流前)官井洋海域内与放流大黄鱼同规格体长的已有个体总数约有195.87万尾，考虑到放流群体在放流初期可能比原存群体具有更高的死亡率，其数值可能还存在一定程度的高估。

表5

表5 　三沙湾回捕样本中用微卫星分子标记大黄鱼个体的亲子溯源结果 Tab. 5 　The results of parentage analysis for Larimichthys crocea individuals marked with microsatellite markers from recaptured samples in Sansha bay 子代编号 offspring no. 候选亲本编号 candidate  parent no. 似然率对数值 pair LOD score 95%置信度 95% pair  confidence SSW2019071634 Y7/Y20 10.80 * SSW2019071669 Y28/Y55 7.98 * YCSS2019072964 Y35/Y95 8.54 * YCSS2019073121 Y18/Y99 7.65 * YCSS2019073122 Y30/Y84 7.78 * 注: *表示LOD值在95%置信度下显著. Note: * means the significance of the LOD value with a confidence level greater than 95%.

表5 　三沙湾回捕样本中用微卫星分子标记大黄鱼个体的亲子溯源结果 Tab. 5 　The results of parentage analysis for Larimichthys crocea individuals marked with microsatellite markers from recaptured samples in Sansha bay

微卫星位点的等位基因数目决定了其遗传多态性以及杂合度水平，基于BOTSEIN提出的多态性水平判定标准^[16]，本实验筛选出的8个微卫星位点的PIC均值为0.751，具有较高的多态性水平。杂合度是衡量群体遗传多样性水平的重要指标，本研究筛选获得的8个微卫星位点观测和期望杂合度均大于0.5，且平均观测杂合度和期望杂合度均在0.75以上，表明所筛选的8个位点能够提供比较丰富的遗传信息。哈迪-温伯格平衡检测结果显示，除去微卫星位点LYC017和LYC01在放流亲本群体中表现为极显著(P<0.001)和显著偏差(P<0.05)水平外，其余6个位点均表现为与HWE偏差不明显(P>0.05)。少量偏离HWE平衡的位点可能与所分析的亲本群体有关(如存在一定程度近交)，不会对亲子溯源分析结果准确性产生显著影响^[17]。因此本研究筛选出的8个微卫星位点在群体中表现出丰富的遗传多样性水平，且多数位点在群体表现稳定遗传状态，可以满足后续大黄鱼亲子溯源分析需求。

累积排除率(CEP)与微卫星位点数量成正比，是反映亲子鉴定有效程度的重要标准^[18]。本研究中微卫星位点累积到3个时，在个体双亲基因型已知的情况下，CEP大于99.84%，位点数累积到8时，CEP大于99.99%。Vankan等^[19]的研究表明，亲子鉴定结果在亲子排除概率为0.99及以上时具有98%~99%的可靠性，间接表明8个微卫星位点在大黄鱼亲子鉴定的准确度是可信的。同时，为了避免由于微卫星PCR扩增时无效等位基因及基因分型误差对判定结果的影响，一方面本研究选用无效等位基因频率较低的8个微卫星位点，尽量避免在杂合位点读取时产生误差；另一方面本实验采用荧光标记法和毛细管电泳技术相结合对样品的DNA片段进行基因分型，提高了判读杂合位点和等位基因大小数据的准确性。在盲样实验中，利用8个微卫星位点基因分型信息，从150尾子代中确证了其中47尾与放流亲本存在亲子关系。8个微卫星位点组合的亲子关系个体识别率为94%，所识别出的47尾子代的准确率在99.99%以上水平，验证了这8个微卫星位点在大黄鱼亲子溯源中的准确性。

本次放流实验中，在7月的回捕样本中，来自宁德富发的放流个体占60.53%左右，说明本次官井洋的增殖放流在7月的三沙湾大黄鱼渔业资源生物量中占据重要组成部分。不过在本次的放流评估中，计算出的富发公司的当次回捕率仅为0.0038%，明显低于传统的标志放流法的回捕率^[20-21]。这是由于外标式的传统标记有利于渔民的识别和回缴，而本实验中的内标式标记则因难以通过肉眼鉴别而无法将未经检测的捕获个体纳入统计。但本研究所采用的微卫星分子标记在理论上可以基于其遗传学特性，高效、“自主”地完成大量终身携带的标记，而且不会造成标记个体损伤，因此利用微卫星标记法换算所得的“放流个体占回捕样本比例”相比于传统标记放流更接近真实回捕数据。

放流回捕率的准确估算受到多种因素影响，包括放流时间与放流地点、回捕方法、回捕地点及放流持续时长。官井洋大致位于青山岛至鸡公山东侧一带主航道上(图1)，该海域水流湍急，是刺激大黄鱼亲鱼成熟的理想场所，而附近水域由于岛礁庇护水流较缓，兼以丰富的浮游动物作为适口饵料，这一切优势使得三沙湾成为我国大黄鱼最大的内湾型产卵场和育幼场^[22]。本实验中所检测出的标记个体，均捕获于官井洋两侧水流较缓的水域，进一步佐证了该海域是大黄鱼适合的育幼场所。需要注意的是，在2019年7、8和9月回捕样本中，7月回捕样本中宁德富发放流个体所占比例为60.53%，而8月和9月均为 0%，出现这种情况的可能原因之一是分子标记个体(13万尾)在整个宁德富发放流群体中(300万尾)的比例偏低且回捕样本较少(休渔期的管理制度下难以获得充足样本数)，导致存在取样误差。同时，考虑到7月回捕样本中来自于宁德富发的放流个体比例较高(60.53%)，笔者认为亦有可能是放流群体已发生较大范围的迁移或分散于湾内其他海域。根据对闽东野生大黄鱼洄游路线的相关研究可知^[23]，在闽江口到四礵列岛禁渔线外侧越冬的大黄鱼经过洄游，于5月中旬到6月中旬在三沙湾官井洋产卵。10月，随着近海水温下降，湾内的幼鱼一部分会留在湾内越冬，尚有部分鱼群会游出三沙湾越冬洄游至四礵列岛，并形成秋冬季大黄鱼渔汛。由此推测，8、9月份时未发现富发放流标记个体的原因除回捕样本量较少之外，亦有可能因当其时的大黄鱼放流群体已发生了较大范围的扩散。

宁德市三沙湾官井洋海域是历史上重要的大黄鱼产卵场和育幼场，也是大黄鱼理想的放流区域，在该水域进行大黄鱼增殖放流对于恢复大黄鱼资源量有重要意义。为了更好地对大黄鱼增殖放流效果进行评估，根据本研究结果提出以下两点建议: (1)制订严格的大黄鱼放流规范。据现场调研，2019年除了由政府主管部门组织的宁德富发公司规范性放流外，其他育苗场也存在少量无序放流，以及出于商业利益的大规模排苗行为，大量小规格、残次苗(数量超2亿尾)被人为排入三沙湾。不过从7月回捕样本中宁德富发放流个体所占60.53%的高比例来看，可以推测这种无序放流及排苗行为未对三沙湾大黄鱼渔业生物量增加产生明显效果。(2)建立亲鱼基因库，增加检测个体数量。放流效果评估需要长期的监测数据支撑才能得到更为准确的判断，越庞大的亲鱼基因型数据库、越高比例的标记放流数量及越多的规格齐全的检测个体(从技术水平，可以实现对所有放流个体的跟踪溯源)，将会带来更多的参考信息，为准确评估大黄鱼的放流效果，放流群体的生活习性及对野生群体、资源恢复影响的研究提供可靠的数据支持。