大口黑鲈(Micropterus salmoides)又称加州鲈，隶属于鲈形目(Perciformes)，太阳鱼科(Cehtrachidae)，黑鲈属，具有肉质鲜美、无肌间刺、生长快和适合集约化养殖等特点，深受广大消费者和养殖者欢迎。近些年大口黑鲈养殖产量持续攀升，至2020年已达47.8万t^[1]，养殖区域呈现出由南向北、由沿海向内陆发展的趋势。随着水产养殖业的迅速发展，良种缺乏已成为制约整个水产业发展的重要因素之一^[2-3]。前期，本课题组已培育出生长性能优良的新品种大口黑鲈‘优鲈1号’(GS01-004-2010)和‘优鲈3号’(GS01-001-2018)，推动了大口黑鲈养殖产业的快速发展，但仍无法充分满足产业规模快速发展对良种的需求。已有研究表明，大口黑鲈雌性个体较雄性个体生长更快，体型更大^[4]。基于此，使用外源性雄激素将XX雌性大口黑鲈逆转为XX生理雄鱼，再与正常的XX雌鱼进行配对，生产全雌大口黑鲈苗种，或可为开发快长型大口黑鲈新品种提供新的途径^[5]。

17α-甲基睾酮(17α-methyl-testosterone, MT)是广泛应用的转雄诱导激素之一，具有促进和维持雄性器官发育、诱导精子发生和释放的功能^[6]。目前，MT已经成功诱导了罗非鱼^[7](Oreochromis spp.)、黄颡鱼^[8](Pelteobagrus fulvidraco)和虹鳟^[9] (Oncorhynchus mykiss)等多种鱼类发生性逆转，以此获得的单性群体也已被广泛养殖。研究表明，MT主要通过影响鱼体的性类固醇激素含量，如雌二醇(estradiol)、睾酮(testosterone)等水平进而诱导雌鱼雄性化^[10]。Sun等^[11]研究发现，使用芳香化酶抑制剂诱导雌性尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)转雄过程中，实验组雌鱼血清中雌二醇的含量显著低于对照组雌鱼；Chi等^[12]研究发现，添加40 mg/kg的MT能够显著提高翘嘴鲌(Culter alburnus)血液中睾酮的含量，诱导雌性翘嘴鲌转雄。除此之外，MT也可通过影响硬骨鱼类性别分化相关基因的表达而促使鱼类发生性逆转。莫媛媛^[13]使用MT诱导雌性罗非鱼转雄过程中发现，实验组雌鱼性腺中P450arom 基因的表达水平较对照组雌鱼显著下调，而Dmrt1基因表达水平则显著上调；闫月明等^[14]使用MT诱导食蚊鱼(Gambusia affinis) 28 d后，发现MT处理组实验鱼性腺中Cyp19a基因的表达水平显著低于对照组雌鱼；贾永义^[15]使用MT投喂全雌翘嘴鲌40 d后，与对照组雌鱼相比，实验组生理雄鱼性腺中Foxl2和Cyp19a基因的表达显著下调，而Amh和Dmrt1基因的表达显著上调。

目前，已有关于MT诱导大口黑鲈转雄的研究报道。Arslan等^[16]、Garrett^[17]和Porter^[18]研究发现，在出膜后21~40 d使用50~60 mg/kg的MT诱导，其诱导效果不佳，且有部分鱼苗转雄不完全。因此，本研究以出膜后15 d的大口黑鲈为研究对象，通过不同浓度MT饲料饲喂，探讨其对大口黑鲈性别分化、性类固醇激素及相关基因表达的影响，从而进一步完善MT诱导大口黑鲈转雄的研究，旨在为大口黑鲈单性育种提供技术资料。

实验鱼购自广东梁氏水产种业有限公司，挑选健康且相同批次繁殖的大口黑鲈水花鱼苗，放入体积为7000 L的圆形水泥池内驯养。期间，每日投喂丰年虫(购自天津丰年虫水产养殖有限公司) 3次(8: 00、12: 00、17: 00)，投喂量约占鱼体重量的20%。投喂至出膜10 d后，开始投喂人工配合饲料(驯食期间和实验期间使用的配合饲料均购自福建天马科技股份有限公司)，驯食期间同样每日投喂3次，随后每日逐步减少丰年虫投喂量，增加饲料投喂量，驯化5 d后全部摄食人工配合饲料。

实验中所用的MT购自美伦生物科技有限公司(广州)。设置MT饲料0 (对照)、50 mg/kg和100 mg/kg (以下简称MT0、MT50和MT100) 3个浓度组。称取一定量的MT溶解在95%的乙醇中，配制成5 mg/mL的母液，4 ℃保存备用。配制饲料时使用95%的乙醇将母液稀释至所用浓度即可。激素饲料参照El-Greisy等^[19]采用乙醇喷雾法进行配制，均匀喷洒在饲料上，42 ℃烘干4 h，对照组饲料使用未添加MT的95%乙醇做同样处理。配制完成后，所有饲料避光干燥保存。

将摄食配合饲料的1万尾鱼苗[体长(15.1± 0.09) mm、体重(40±0.1) mg]随机分为3个实验组，每组3个平行，分别置于9个网箱(3 m×2 m×1.2 m)内进行激素饲料投喂，每个网箱约1000尾。实验期间，每日分别在8: 00, 12: 00, 17: 00饱食投喂3次，每次投喂持续约30 min，以保证饲料被全部摄食，随后清理残饵粪便。水源为经曝气的自来水，实验期间保持水温(27±2) ℃、pH 7、光周期为12 h : 12 h。饲养期为60 d。

实验期间每隔20 d记录1次各组实验鱼的体长和体重数据。饲养实验结束后，禁食24 h，从每个组随机捞取24尾实验鱼(每个网箱8尾)。剪取少量鳍条，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA，利用本课题组已获得的大口黑鲈性别鉴定SNP标记(未公开发表)，对采集的大口黑鲈遗传性别进行准确鉴定。使用MS-222麻醉后通过尾部静脉采集血液，静置4 h, 3000 g离心20 min，吸上清−80 ℃保存备用。随后解剖取出性腺，通过性腺形态学判定雌雄性别，然后使用生理盐水将取出的性腺冲洗干净，将其中一半迅速放入液氮中冷冻，而后转入−80 ℃保存备用，用于提取总RNA。另一半放入4%的多聚甲醛(购自武汉塞维尔生物科技有限公司)中固定24 h，然后更换70%的乙醇备用，用于制作组织切片。

性腺组织样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后连续切片(厚度5~8 μm)，每条鱼的性腺至少横切3个不同的截面，切片经苏木精–伊红(HE)染色后，使用Leica DM2500显微镜观察并拍照，并参照Rhody等^[20]的方法确定其表型性别。

从采集的样品中挑选出实验组生理雄鱼以及对照组雌鱼的血清(每个网箱随机挑选3尾)进行雌二醇和睾酮含量测定。雌二醇和睾酮的含量测定采用酶联免疫法进行，试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，按照说明书进行测定。

从采集的RNA样品中挑选出实验组生理雄鱼和对照组雌鱼各6尾(每个网箱2尾)。使用Trizol (购自广州威佳科技有限公司)法提取性腺总RNA，提取的RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，而后使用酶标仪(Biotek Cytation 5)检测其浓度。

根据试剂盒说明书，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser商业试剂盒 (TaKaRa)将1 μg总RNA反转成cDNA。反转录体系为20 μL，反应条件为42 ℃ 2 min, 37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。cDNA稀释至10%后，使用SYBR^®Green real-time PCR Mater Mix plus (TaKaRa)和Bio-Rad CFX96触控检测系统进行Real-time PCR。Real-time PCR反应体系(20 μL)包括: 2 μL cDNA, 10 μL SYBR, 7.2 μL ddH₂O, 0.4 μL正向和反向引物。反应条件为: 95 ℃预变性2 min；然后95 ℃变性10 s, 60 ℃退火10 s; 72 ℃延伸10 s，循环40次，最后72 ℃延伸10 min。以β-actin为内参基因^[21]，采用2^–△△Ct计算结果，并表示为相对于β-actin的表达水平^[22]。本研究中使用的所有引物均委托广州艾基生物技术有限公司合成，引物见表1。

表1

表1 　荧光定量引物序列 Tab. 1 　Nucleotide sequences of real-time PCR primers 基因 gene 基因序列号 GenBank no. 正向引物 forward primer 反向引物 reverse primer Foxl2 ACD62374.1 5′-CACTCGACCCAGCCTGTGAG-3′ 5′-GCCGTCTCCTCCGAACAAGG-3′ Cyp19a1a ABL64075.1 5′-GTGAGGCAGTGTGTGCTGGA-3′ 5′-CAGCCGCAGCTCCACATCT-3′ Dmrt1 CAQ52797.1 5′-GCTCCCGCTGTAGGAACCAC-3′ 5′-CCTGAGCCTGCTGCCTTCTC-3′ Gsdf 120545463 5′-AGCAATGCCCACAGAGCCAT-3′ 5′-GGCTGGCAGGATGGATCACC-3′ β-actin XM020651307.1 5′-AAAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′ 5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGGG-3′

表1 　荧光定量引物序列 Tab. 1 　Nucleotide sequences of real-time PCR primers

所有数据均以平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$)表示，结果用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Duncan’s多重比较分析组间差异，P<0.05表示差异显著。

使用不同浓度的MT投喂大口黑鲈60 d后，实验鱼体长和体重变化如图1。结果显示，从投喂第20天至60天结束，实验组实验鱼的体长和体重均显著低于MT0组(P<0.05)。投喂第20~40天时，MT50组和MT100组实验鱼的体长和体重均无显著差异(P>0.05)。随着投喂时间延长至60 d时，MT100组实验鱼的体长和体重显著低于MT50组(P<0.05)。

图1

图1 　日粮中添加不同浓度MT对大口黑鲈全长和体重的影响相同日龄各组间字母不同表示组间差异显著(P<0.05). Fig. 1 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the body length and weight of Micropterus salmoidesDifferent letters between the treatments in the same period show significant difference (P<0.05).

性腺形态学以及组织学性别鉴定结果见表2。结果显示，MT0组的雄性比例为45%, MT50和MT100组均为100%。性腺组织切片显示(图2)，实验组遗传雌鱼的性腺已经完全发育为精巢，且精巢结构与对照组的雄鱼相似。MT0组雄鱼性腺中分布着大量的精母细胞，而实验组生理雄鱼性腺中以精原细胞和间质组织为主，精母细胞较少，在精巢中央形成了一个中空的精小叶。

表2

表2 　日粮中添加不同浓度MT对大口黑鲈性别比的影响 Tab. 2 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the sex ratio in Micropterus salmoides n=24; % 组别 group 形态学 morphology 组织学 histology 雌性 female 雄性 male 雌性 female 雄性 male MT0 55 45 55 45 MT50 − 100 − 100 MT100 − 100 − 100

表2 　日粮中添加不同浓度MT对大口黑鲈性别比的影响 Tab. 2 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the sex ratio in Micropterus salmoides n=24; %

图2

图2 　日粮中添加不同浓度MT对大口黑鲈性腺结构的影响a. MT0组雄鱼；b. MT50组生理雄鱼；c. MT100组生理雄鱼. Spc: 精母细胞；Spg: 精原细胞；SL: 精小叶. Fig. 2 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the structures of gonads in Micropterus salmoidesa. Male in MT0 group; b. Physiological males in MT50 group; c. Physiological males in MT100 group. Spc: spermatocyte; Spg: spermatogonia; SL: seminiferous lobule.

血清中雌二醇和睾酮的含量变化如图3所示。雌二醇测定显示，MT50和MT100组生理雄鱼雌二醇的含量显著低于对照组雌鱼(P<0.05)。睾酮含量测定显示，MT50组生理雄鱼睾酮含量显著高于MT100组(P<0.05)，但均与对照组雌鱼无显著差异(P>0.05)。

图3

图3 　日粮中添加不同浓度MT对大口黑鲈血清中雌二醇和睾酮含量的影响不同字母表示组间差异显著(P<0.05). Fig. 3 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the serum content of estradiol and testosterone in Micropterus salmoidesDifferent letters indicate significant differences between groups (P<0.05).

投喂MT后，与对照组鱼相比，MT50和MT100组生理雄鱼性腺中与精巢发育和分化相关基因Dmrt1和Gsdf的表达水平显著上调，而与卵巢发育和分化相关基因Foxl2和Cyp19a1a的表达水平则显著下调(图4)。

图4

图4 　日粮中添加不同浓度的MT对性别分化相关基因表达的影响不同字母表示组间差异显著(P<0.05). Fig. 4 　Effects of different concentrations of MT supplementation on the gene expression in Micropterus salmoidesDifferent letters indicates significant differences between groups (P<0.05).

MT作为一种高效的性逆转诱导激素，除了对性别分化产生影响外，对鱼类的生长同样具有显著的影响。研究表明，低剂量的MT对鱼类的生长具有促进作用，而高剂量的MT则会产生抑制作用^[23]。在黄姑鱼中MT添加剂量高于0.2 mg/L时会抑制实验鱼生长，低于0.2 mg/L则无显著影响^[24]；而在樱桃鲃(Barbus titteya)中的研究结果相反，日粮中添加100 mg/kg的MT能够促进其生长^[25]。上述研究表明，对于不同鱼类，MT对生长产生促进和抑制作用的浓度差异很大。在本研究中，使用50 mg/kg和100 mg/kg的MT添加投喂后，两个实验组大口黑鲈的体长和体重均显著低于对照组。这与稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)和食蚊鱼中的研究结果相似^[26-27]。另外本研究发现，MT添加投喂40 d内，50 mg/kg组和100 mg/kg组的体长和体重无显著差异(P>0.05)，至60 d时，100 mg/kg组的体长和体重显著低于50 mg/kg组(P<0.05)。表明投喂时间越长，高浓度的MT添加投喂对大口黑鲈的生长抑制作用越显著。

研究表明，激素诱导的浓度、激素诱导开始时间以及诱导持续时间是成功控制鱼类性别的3个关键因素^[28]。Arslan等^[16]对出膜后40 d (体长33.5 mm)的大口黑鲈幼苗分别进行了持续30 d、45 d和60 d添加60 mg/kgMT的投喂实验，结果分别获得了49.0%、48.9%和52.4%的雄性率，表明诱导持续时间对大口黑鲈性别比可能没有影响。与之相比，Garrett^[17]使用相似浓度(50 mg/kg)的MT投喂出膜35 d (体长20~30 mm)的大口黑鲈幼苗持续60 d，结果获得了90%雄性率；同样地，Porter^[18]使用添加50 mg/kg MT的饲料对出膜21~28 d (体长15~25 mm)的大口黑鲈幼苗进行持续70 d的投喂后，最高获得了95%的雄性率。这些研究表明激素诱导开始时间是影响大口黑鲈性别比的关键因素之一。另外，本课题组在前期的研究中对大口黑鲈早期性腺发育进行了组织切片及基因表达研究(另文发表)。结果显示，原始性腺在出膜后12 d首次出现；同时，卵巢发育相关的基因在出膜后20 d出现高表达。故推断雌性大口黑鲈性别分化的关键时间可能在出膜后20 d之前。在本研究中，使用的激素浓度及诱导持续时间与上述研究相似，但激素诱导开始时间更早[出膜后15 d，体长(15.1±0.09) mm]，结果两个实验组均获得了100%的雄性率，并且不存在性逆转不完全的大口黑鲈。由此可见，大口黑鲈最佳的激素诱导时间在出膜后20 d之前，在此阶段进行激素诱导可以获得更好的性转率。

鱼类早期性别分化难以从表观形态学进行区分，其内部性腺组织的形态特征变化如卵巢腔和输精管的形成等可作为鱼类早期性别分化的标志^[29]。在本研究中，通过性腺组织学观察显示，实验组生理雄鱼的精巢结构与对照组的雄鱼相似，但实验组生理雄鱼的精巢中以精原细胞和间质组织为主，精母细胞较少，且在精巢中央形成了一个中空的精小叶，这种现象在黄鳝(Monopterus albus)中也有类似的报道^[30]，推测出现这种现象可能的原因是使用MT剂量过高，超过了大口黑鲈性腺承受范围造成的结构异常^[31]。

雌二醇和睾酮作为最主要及活性最强的内源性雌性和雄性激素，主要参与卵巢和精巢分化、卵母细胞和精子成熟等过程。已有研究表明，抑制雌二醇的合成是大多数鱼类雌性个体雄性化的必要条件，如在罗非鱼^[32]、石斑鱼^[33](Epinephelu ssp)等鱼类雌性个体向雄性转化的过程中，实验组雌鱼中雌二醇的含量均低于对照组雌鱼。在本研究中，添加MT后，实验组生理雄鱼血清中雌二醇的含量显著低于对照组雌鱼，表明抑制雌二醇的分泌是诱导大口黑鲈雌性个体雄性化的必要因素^[34]。姚汶励等^[35]使用50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg的MT诱导雌性草鱼45 d，结果显示随着MT浓度的升高，睾酮含量降低。同样在本研究中，随着MT浓度升高，MT100组血清中睾酮的含量显著低于MT50组。在雌性鲻(Mugil cephalus)^[36]和雌性日本鳗鲡(Anguilla japonica)^[37]中也观察到类似现象。推测出现这种现象可能是鱼体出现了负反馈调节作用，抑制高浓度组睾酮的合成^[38]。

Real-time PCR结果表明，与对照组雌鱼相比，实验组生理雄鱼显著上调了Dmrt1和Gsdf的表达水平。相反地，实验组生理雄鱼Foxl2和Cyp19a1a基因的表达水平显著低于对照组雌鱼，这与食蚊鱼^[27]、翘嘴鲌^[18]以及泰国斗鱼(Betta splendens) ^[39]等的研究结果类似。雌二醇含量减少以及卵巢发育相关基因表达水平的下调，会抑制卵巢发育，而精巢发育相关基因表达的上调，则会启动精巢的发育，进而导致了性逆转的发生^[40]。由此可见，MT可能通过影响性腺发育相关激素水平及相关基因表达的丰度进而导致大口黑鲈发生性逆转。

综上所述，本研究用含有50 mg/kg和100 mg/kg 17α-甲基睾酮的饲料投喂出膜后15 d的大口黑鲈60 d，均获得100%的雄性率。MT通过降低雌二醇含量、下调Foxl2和Cyp19a1a基因表达水平和上调Dmrt1和Gsdf基因表达水平来促使大口黑鲈发生性逆转。然而，本研究中诱导获得的生理雄鱼性腺结构异于正常雄鱼，关于生理雄鱼能否进一步发育成熟及繁殖还需要进一步研究。本研究建立了一种大口黑鲈生理雄鱼诱导技术，为大口黑鲈单性品种培育奠定了基础。