2022, Vol. 29 
表1(Table 1)
2. 上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306
2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources, Ministry of Agriculture and Rural Areas; Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
硬骨鱼类生长调控的核心是生长轴，即生长激素(GH)/胰岛素样生长因子(IGF)。GH为脑垂体前叶释放的一种单链多肽类激素，通过生长激素受体(GHR)刺激肝脏等组织分泌IGFs，进而发生生物学效应[1]。GH居于生长轴中心位置，在鱼类的生长、代谢、生殖等生理功能中发挥着重要作用[2-4]。研究表明，鱼类GH基因的表达水平受性别[5-6]、季节[7]和生理状态[8]等影响，且研究结果显示在一定条件下GH基因表达水平高的鱼类其生长速度也快。如体重大生长快的银鲳(Pampus argenteus)垂体GH基因表达量是体重小生长慢个体的612倍[9]，极大组赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)垂体GH基因表达量是极小组的2.1倍[10]。因此，GH已成为研究鱼类生长性能的重要候选基因。
梭鲈(Sander lucioperca)属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Bacalao)、梭鲈属，因其体肥肉厚、营养丰富、肉质细嫩、味道鲜美，素有“淡水鱼王”之称。研究显示，梭鲈肌肉蛋白质含量为21.03%，多不饱和脂肪酸含量为45.67%, EPA和DHA含量达30.66%[11]，总氨基酸、多不饱和脂肪酸、DHA和EPA均高于加州鲈(Micropterus salmoides)和鳜(Siniperca chuatsi)[12]。梭鲈因其营养价值高、生长速度快、抗病力强等特点，深受广大消费者和养殖者的喜爱，目前在东北、西北、华北、华东、华南等地区均有养殖，已成为我国重要的淡水名优养殖鱼类。但养殖过程中出现梭鲈生长差异较大，导致出塘规格悬殊，一定程度上影响了梭鲈养殖业发展。因此，开展梭鲈生长调控的机制研究为遗传改良提供理论依据具有重要的实践意义。关于梭鲈生长性状遗传研究报道较少，韩晓飞[13]获得了5个与梭鲈生长性状显著相关的微卫星标记；Teng等[14]克隆了IGF-I、IGF-II和GHR基因，并在IGF-II中获得1个SNP与体重显著相关。本研究以生长轴GH基因入手，获得了GH基因cDNA全长序列并分析了序列特征，研究了其在梭鲈各组织的表达分布，分析了其表达量与梭鲈生长之间的相关性，探索GH基因在梭鲈生长性状中可能的遗传调控作用和分子育种潜力，旨在为梭鲈生长性状的分子选育研究提供候选基因资源。
1 材料与方法 1.1 样品制备梭鲈样本均来自黑龙江水产研究所呼兰试验场，选取同池塘养殖条件下的5尾1龄鱼，体重151~169 g，采取心、肝、脾、脑、垂体、肌肉、肠、胃、皮肤、鳃组织，迅速放入液氮保存。随机选取同池塘养殖条件下5月龄梭鲈500尾，挑选体重极大和极小个体各10尾(表1)，极小组(体长92.35~101.89 mm，体重6.6~9.7 g)和极大组(体长160~185 mm，体重33~58.4 g)，分别采集垂体、脑、肌肉、肝立即放于液氮中冷冻保存。依据ThermoFisher公司提供的TRIzol Reagent试剂盒说明书操作，提取梭鲈各组织样品的总RNA；利用NanoDropTM 8000分光光度计和1.2%的琼脂糖电泳对RNA样品进行浓度和质量检测。
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表1 梭鲈体重和体长性状统计 Tab. 1 Statistics of body weight and body length characters of Sander lucioperca |
以垂体RNA为模板，根据 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书反转录为cDNA第一链(TaKaRa，日本)。根据NCBI数据库亲缘关系较近硬骨鱼类的GH基因序列，选择保守区域和梭鲈转录组数据库进行序列比对，获得梭鲈GH基因的部分cDNA序列并设计引物进行序列验证(表1)。根据已获得梭鲈GH基因保守区域的序列设计RACE扩增引物(表1)，按照 SMARTer®RACE5′/3′试剂盒(TaKaRa，日本)说明书构建RACE 文库，SeqAmpTM DNA Polymerase (TaKaRa，日本)试剂盒进行巢式PCR扩增。
PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，对目的条带切胶后按照琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化目的产物(康为世纪，中国)，将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T克隆载体(TaKaRa，日本)，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，日本)，涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱过夜，次日进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。测序结果使用BLAST (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)比对，DNAMAN软件分析，Staden 1.7软件进行拼接，最终获得GH基因的全长cDNA序列。
1.3 推测蛋白质生物信息学分析及系统进化树构建使用DNAMAN软件查找基因的开放阅读框；使用在线软件ExPASy-Protparam Tool (https:// web.expasy.org/protparam/)预测蛋白理化性质；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件预测蛋白质是否跨膜；Signalp-4.1 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测蛋白质信号肽；Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/smart)预测蛋白质结构域特征；NetNGlyc 1.0 (https://services. healthtech.dtu.dk/)预测糖基化位点；DNAMAN软件进行氨基酸序列比对分析；利用MEGA 7.0和Clustal 2.1软件，采用邻接法(NeiGHbor-Joining method, NJ)构建系统进化树，Bootstrap (1000次)得出各分支置信度。
1.4 基因表达特征分析利用已经获得的GH基因全长cDNA序列的保守区域设计荧光定量检测引物(表2)。以梭鲈GAPDH基因作为内参基因，各组织样本cDNA为模板，使用SYBR® Premix Ex TaqTM II (Tli RNase H Plus)试剂盒(TaKaRa，日本), ABI 7500荧光定量PCR仪，检测梭鲈GH基因在不同组织和极大极小组中各组织的相对表达模式，每个样品设计3个重复。使用2-∆∆Ct相对定量方法计算基因的相对表达量，数据分析采用SPSS 22.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)方法，差异显著时进行Duncan’s多重比较，差异显著性以0.05为标准。
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表2 引物序列 Tab. 2 Primer sequence in this study |
克隆获得的梭鲈GH基因cDNA全长为926 bp (GenBank登录号：MT981414.2)，开放阅读框为615 bp，编码204个氨基酸，5′端非编码区序列(untranslated region, 5′-UTR)为74 bp, 3′端非编码区序列(untranslated region, 3′-UTR)为237 bp，带有典型的多腺苷酸化信号序列(AATAA)和多聚poly (A)尾巴(图1)；推导的GH蛋白分子式为C1025H1642N276O312S6，相对分子量23.02 kD，理论PI值为6.43，蛋白质的不稳定系数为58.99，脂肪系数为100.88，亲水性平均系数为-0.186；该蛋白无跨膜结构，为胞外分泌蛋白；GH氨基酸序列N端含有1个17个氨基酸组成的信号肽序列(1~17 aa)和一个187个氨基酸组成的成熟肽(18~ 204 aa)，还含有1个Hormone_1结构域(7~202 aa)，该结构域是受体活性位点(图2); GH蛋白存在1个N-糖基化位点和4个保守的半胱氨酸残基(Cys69, Cys177, Cys194, Cys202)。
2.2 GH氨基酸序列比对及系统进化树分析将GH氨基酸序列同其他物种进行多序列比对(图3)，结果显示，梭鲈与黄金鲈(Perca flavescens)和尖吻鲈(Lates calcarifer)氨基酸序列同源性最高，相似性分别为97.04%、94.05%，而梭鲈与哺乳类相似性低于40%。鱼类和哺乳类都含有4个保守的半胱氨酸残基(Cys69, Cys177, Cys194, Cys202)，靠分子间的二硫键形成二聚体维持蛋白质的三级结构。系统发育树结果显示(图4)，鱼类聚为一大支，其中同为鲈科鱼类的梭鲈、黄金鲈、河鲈(Perca fluviatilis)聚为一小支，亲缘关系最近，鲈形目、鲤形目(Cypriniformes)和鲑形目(Salmoniformes)各聚为一支；人和小鼠等哺乳动物则聚为另一大支，亲缘关系较远。
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图1 梭鲈GH基因cDNA序列及其推导氨基酸序列黑下划线表示梭鲈GH前体蛋白的信号肽为前17个氨基，成熟肽为第18~204个氨基酸，方框表示4个保守的半胱氨酸残基，蓝色阴影为N-糖基化位点，黄色阴影表示加尾信号，“*”表示终止密码子. Fig. 1 cDNA sequence of Sander lucioperca GH gene and deduced amino acid sequenceThe signal peptide of GH precursor is 17 amino acids and is marked by black line; mature peptide is number 18-204 amino acids; Hormone_1 domain is number 18-204 amino acids, and the four conserved cysteine residues are annotated respectively by a square; putative N-glycosylation sites are annotated respectively by a blue circle. The yellow shadow indicates tailing signal; “*” indicates the stop codon. |
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图2 梭鲈GH基因结构域特征 Fig. 2 Characterization of GH gene domain in Sander lucioperca |
根据NCBI数据库梭鲈GH基因组序列可知，GH基因组DNA全长2875 bp (GenBank登录号：116063544)。通过比较研究斑马鱼(Danio rerio)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的基因组DNA结构，结合已克隆获得的GH基因CDS区序列，发现梭鲈GH基因组包含6个外显子和5个内含子，而斑马鱼、人和小鼠有5个外显子和4个内含子。斑马鱼、小鼠和人的GH基因组长度分别是梭鲈的1.8倍、1.2倍和0.5倍(图5)。梭鲈GH基因外显子长度分别10 bp、134 bp、117 bp、144 bp、147 bp、63 bp，内含子分别为150 bp、556 bp、660 bp、200 bp、394 bp。
2.4 GH基因在不同组织中表达特征分析采用实时荧光定量PCR技术检测了GH基因在梭鲈10个组织中的表达情况(图6)。结果显示，该基因在所有检测组织中均有表达，但存在组织差异性。10个组织中基因相对表达量从高到低依次是垂体、脑、脾、鳃、胃、皮肤、心、肌肉、肠和肝，以心脏组织中GH表达水平为对照，垂体中GH表达量是心的64倍，垂体和脑的表达量相对高于其他组织且差异极显著(P<0.01)，同时垂体和脑之间的表达量差异极显著(P<0.01)，脾、鳃、胃等其他组织之间相对表达量差异不显著。
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图3 梭鲈GH与其他物种氨基酸序列的同源性多重比较序列中相同氨基酸残基用黑色背景表示，相似性超过75%用粉红色背景表示，相似性超过50%用浅蓝色背景表示，矩形框表示4个保守的半胱氨酸残基. Fig. 3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of Sander lucioperca GH with the corresponding sequence from other speciesPosition with>50% similarity is shaded in blue; position with > 75% similarity are shaded in pink, while completely conserved positions are shaded in black; four conserved cysteine residues are boxed. |
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图4 不同物种间GH蛋白序列N-J系统进化树 Fig. 4 N-J phylogenetic tree of GH protein sequence in different species |
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图5 GH基因组结构分析 Fig. 5 Genomic organization of GH |
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图6 GH基因在梭鲈各组织的表达特征不同小写字母代表不同组织的差异极显著(P<0.01)，相同字母代表不同组织之间差异不显著(P>0.05). 心为参考样本. Fig. 6 The expression of GH in different tissues of Sander luciopercaDifferent lowercase letters indicate the very significant differences between different tissues (P<0.01); the same letter indicate no significant differences between different tissues. Heart is reference sample. |
通过实时荧光定量PCR技术分析了GH基因在梭鲈生长极端差异两组间脑、垂体、肝和肌肉组织中表达水平(图7)。结果显示，4个组织中GH基因表达量均为极大组高于极小组，其中垂体和脑组织中差异呈极显著水平(P<0.01)，差异表达倍数分别为12.3、14.1倍，肌肉组织中差异呈显著水平(P<0.05)，差异表达倍数为3倍，但在肝组织中差异不显著(P>0.05)。
3 讨论 3.1 GH基因序列特征的生物信息学分析本研究中梭鲈GH基因存在四个保守的半胱氨酸残基和两个二硫键，多序列比对结果显示，梭鲈同其他硬骨鱼类一样都存在四个保守的半胱氨酸残基，且近C-端区域内的序列高度保守，这对生长激素与受体结合发挥生物学作用及维持蛋白质结构起着重要作用。梭鲈GH蛋白质C端只存在一个N-糖基化位点Asn-Cys-Thr，和鲈形目的银鲳[9]、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)[15]的糖基化位点数目一致，但鲤形目的赤眼鳟[10]存在两个糖基化位点，可能是物种间的进化过程差异导致N-糖基化位点个数不同，还有待进一步研究。多重氨基酸序列比对和系统进化树分析显示，梭鲈GH的氨基酸序列在进化上与同为鲈科鱼类的黄金鲈、河鲈最为接近，与其他物种亲缘关系远，鲤形目、鲑形目、哺乳动物各聚为一支，这与传统形态学分类较为一致，说明该基因在进化的过程中较为保守，该系统进化树较真实地反映了该物种进化的关系。
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图7 GH基因在梭鲈极端大小个体差异的表达分析**表示极显著性差异 (P<0.01); *表示显著性差异(P<0.05)，极小组垂体为参考样本. Fig. 7 The different expression level of GH in big and small of Sander lucioperca** indicates the very significant difference (P<0.01); * indicates significant difference (P<0.05); the pituitary of the small group is reference sample. |
基因结构比较分析发现，梭鲈GH基因有6个外显子和5个内含子，这与斜带石斑鱼[15]、翘嘴鳜(Siniperca scherzeri)[16]等鲈形目鱼类外显子和内含子数目一致。斑马鱼、人和小鼠GH基因有5个外显子，赤眼鳟[10]、斑鳢(Channa maculata)[17]、河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)[18]等鱼类也含有5个外显子，这与梭鲈外显子数目不一致，主要是第5外显子和第6外显子之间插入一个内含子造成的，说明GH基因结构在不同的物种中存在相似性和特异性，可能与物种间进化速率不同有关。同时，也发现不同物种间GH基因长度差异主要是内含子长度差异引起的，说明外显子相对内含子来说比较保守。
3.2 GH基因在不同组织中的表达分析GH基因在组织中的分布已在鲤形目[10]、鲈形目[19]、鲇形目(Siluriformes)[20]、鲽形目(Pleuronectiformes)[21]等鱼类中得到广泛的研究。本研究中，GH在检测的10个组织中均有表达，其中垂体中相对表达水平最高，这也意味着GH作为生长轴上的关键基因对鱼体的各个器官组织发挥重要的调控作用。在少数鱼类中，GH基因仅在垂体中表达，如赤眼鳟[10]、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[19]的脑、肝、肌肉、肠、脾、心、鳃、肾、皮肤组织中均未检测到表达。Deng等[22]在具有雌雄生长差异特性的金钱鱼(Scatophagus argus)中研究发现，生长快速的30月龄雌鱼垂体GH基因表达量是雄鱼的6.34倍。说明垂体是GH合成和分泌的关键部位，GH在鱼类个体生长过程中发挥关键作用且在不同物种间存在组织表达差异性。类似的，GH基因在梭鲈脑、肝、脾、鳃、心、胃、肠、皮肤等组织均有表达，但具有组织表达差异性，通常在垂体中表达量最高，这与瓦氏黄颡鱼[20]、大刺鳅[23]结论一致，但大刺鳅[23]脾和鳃中GH基因表达量较低，而本研究梭鲈脾和鳃中表达量较高，这说明垂体外的GH可能以自分泌或旁分泌的形式作用于自身或相邻细胞发挥多种生物学功能，其中，GH可能通过免疫和渗透压调节过程增强梭鲈对环境的适应能力进而促进自身生长，但还需进一步研究。瓦氏黄颡鱼[20]GH表达量除垂体和脑以外在肌肉中表达量较高，说明GH也参与肌肉的生长调节，但在本研究中梭鲈肌肉的表达量较低，可能是一龄梭鲈此时正处于快速生长时期，垂体中GH的合成和分泌非常旺盛，GH直接通过GH/IGF轴刺激肝脏合成IGFs促进各组织细胞的生长分化，减弱了肌肉中GH的表达。
3.3 GH基因在生长差异个体间表达分析鱼类在生长发育过程中存在个体大小和生长速度的差异，除了温度、养殖密度、饵料种类等外界因素的影响之外，其生长轴上的基因表达水平也决定了鱼类生长的快慢。鱼类GH基因在垂体组织的转录水平反映了GH基因mRNA合成速度，是鱼类生长速度的有效指标之一[19]。Figueroa等[7]发现鲤鱼(Cyprinus carpio)在生长快速季节垂体GH基因表达水平显著高于生长慢速季节(P< 0.01), Zhong等[24]研究表明生长快速的尼罗罗非鱼雄鱼垂体中GH基因表达水平显著高于雌鱼(P<0.05)，林明德等[25]研究发现生长快速的褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus) F1子代脑中表达水平高于生长慢的亲本。这些与本研究中GH基因在梭鲈极大组垂体和脑中表达量极显著高于极小组(P<0.01)的结果相一致，反映出GH可能通过调控神经系统的生长发育及组织分化来影响梭鲈的生长。
肝脏是GH发挥生理作用的主要靶器官，GH通过与肝细胞膜表面生长激素受体GHR结合诱导IGFs生成进而促进动物的生长。Ma等[21]研究表明生长快速的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌鱼和极大雄鱼肝中GH基因表达水平显著高于雄鱼(P<0.05), Ma等[26]研究发现生长快速的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)雄鱼肝中GH基因表达水平高于生长慢的雌鱼，这与本研究中GH基因在梭鲈极大组肝中表达量高于极小组的结果一致。推测肝脏中GH基因的表达水平差异可能影响GH与肝脏表面受体GHR的结合，从而影响梭鲈的生长速度。
肌肉占体重的50%~70%，鱼类的生长主要依赖肌肉质量的增加，GH可刺激肌肉组织中蛋白质的合成代谢和细胞增殖分化从而加快鱼类生长速度[22]。刘加林等[27]研究发现太湖鲂鲌(Culter alburnus♀×Megalobrama terminalis♂)F2极大组肌肉中GH基因表达量是极小组的4.6倍，臧坤等[28]研究表明生长快速的星突江鲽(Platichthys stellatus)雌鱼肌肉中GH基因表达量显著高于生长慢的雄鱼(P<0.05)，傅建军等[29]研究显示青灰色组鲤的体重、体高、体长等生长性状极显著或显著高于橘红色组，其肌肉中GH基因表达量极显著高于橘红色组(P<0.01)，本研究也得到了相同结论，GH基因在梭鲈极大组肌肉中表达量显著高于极小组(P<0.05)。已有证据也表明，GH可直接与肌肉等器官上的受体结合而影响细胞营养物质的合成代谢与生长发育[30]。总的来说，GH基因在梭鲈体重极大组生长相关组织表达水平高于极小组，充分说明了GH基因的表达量与鱼类的生长呈正相关关系，GH对鱼类的生长速度具有促进作用。因此，GH基因可作为梭鲈生长发育的标记基因并用于生长性状的分子选育。
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