鱼类细胞培养技术是进行鱼类生物学基础研究的重要手段和方法，被广泛应用于病毒学、免疫学、遗传学、基因工程和细胞生物学等各个领域^[1-3]。世界上第一个鱼类细胞系是1962年由Wolf等^[4]建立的虹鳟生殖腺细胞系RTG-2。随着鱼类生物技术的发展，越来越多不同组织的鱼类细胞系被建立，据统计，截至2020年全世界已报道建立的鱼类细胞系共有780多种^[5]。肾脏是鱼类重要的淋巴器官，在鱼类抵抗外来病原菌入侵，进行免疫应答过程中发挥重要作用^[6-8]。近年来，由于鱼类免疫学研究的深入开展，已建立多种肾脏细胞系并分析了其生物学特性，用于探索鱼类免疫基因功能和进行病毒的分离纯化等研究，如鳗鲡肾脏细胞系^[9]、斑点叉尾鮰肾脏细胞系^[10]、松江鲈肾细胞系^[11]、金钱鱼肾细胞系^[12]、西伯利亚鲟头肾细胞系^[13]和宽口裂腹鱼中肾组织细胞系^[14]等。此外，Xue等^[15]建立了青鱼细胞系(MPK)，发现MPK细胞可成功感染鲤病毒血症病毒。Liu等^[16]建立了云纹石斑鱼肾脏细胞系(EMK)，发现EMK对新加坡石斑鱼虹彩病毒和神经坏死病毒易感。Zhou等^[17]发现金鲳肾脏细胞系对病毒和细菌的胞外产物均有易感性。由于鱼类免疫组织的多样性，同一种鱼的不同组织对同种病原体的敏感性不同，因此，为满足不同研究需求，对开发、培养鱼类不同的细胞系提出了更高的要求^[18]。

斑石鲷(Oplegnathus punctatus)隶属于鲈形目(Perciformes)，石鲷科(Oplegnathidae)，石鲷属(Oplegnathus)，广泛分布在朝鲜、日本和中国，属于温、热带鱼类，近年来在我国的养殖产量大幅度上升^[19-20]。然而，随着斑石鲷养殖规模的不断扩大，病害频发，严重影响了斑石鲷的产量和经济效益。虹彩病毒引起的虹彩病毒病^[21]和哈维氏弧菌引起的黑身病^[22]是斑石鲷养殖业中的主要疾病，死亡率高，病鱼均会出现脾肾肿大和脾肾造血组织坏死。研究表明，肾脏作为重要的免疫器官在斑石鲷抗细菌和抗病毒应答中发挥重要作用，斑石鲷在感染虹彩病毒后免疫相关基因TGF-β1在肾脏中的表达量与未感染组出现显著性差异^[23]，在感染鳗弧菌后，免疫相关基因MyD88在肾脏中的表达量也显著上调^[24]。斑石鲷基因组序列已经测定完毕，这为探讨斑石鲷分子免疫机制提供了研究基础，而稳定的细胞系则是斑石鲷抗病免疫相关基因筛选和功能分析的重要平台^[25]。迄今为止，斑石鲷仅建立了3种细胞系(脑细胞系、肌肉细胞系^[20]和肝脏细胞系^[26])，尚未见关于斑石鲷肾脏细胞系的相关报道。因此，急需建立斑石鲷肾脏细胞系，进行斑石鲷对不同细菌和病毒的易感性、免疫相关基因功能验证、分子免疫机制等研究，为解析斑石鲷抗病分子免疫机制提供重要的研究基础和保障。

本研究以斑石鲷肾脏为材料，采用胰酶消化法进行斑石鲷肾脏原代细胞的培养，在原代细胞稳定后进行传代培养，建立斑石鲷肾脏细胞系，并对斑石鲷肾脏细胞系的生长特性、特征、免疫刺激后的表达分析进行研究。旨在为进行斑石鲷免疫基因功能的探索、细菌性和病毒性疾病发病机制等研究奠定研究基础，同时推进了斑石鲷免疫学、病理学和生理学等研究进展。此外，斑石鲷肾脏细胞系的建立丰富了鱼类细胞系资源，为鱼类培养优良抗病育种和病害防治的研究提供重要的体外实验平台。

本研究采用的健康无病斑石鲷，体重200 g，体长(18±2) cm，来自山东省莱州市明波水产有限公司。

实验试剂：Leibovitz's L-15培养基(Solarbio，北京)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Gibco，美国), 10 ng/mL碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(R&D，美国), 50 mmol/L β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol, 2-ME) (Gibco，美国), 200 IU/mL青链霉素混合液(Solarbio，北京), 100×青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(Solarbio，北京), 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio，北京), 1×PBS缓冲液(Solarbio，北京)，二甲基亚砜(DMSO, Solarbio，北京)，秋水仙素(碧云天，上海)，甲醇(沪试)，乙酸(沪试)，异丙醇(沪试)，乙醇(沪试), Tissue DNA kit试剂盒(OMEGA), TB Green® Premix Ex Taq™ (TaKaRa，北京), PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa，北京), Premix Taq™ (Ex Taq™ Version 2.0 plus dye) (TaKaRa，北京), TRIzol™ Reagent (Invitrogen，美国), pEASY-T1载体(全式金，北京)，大肠杆菌感受态细胞Trans T1 (全式金，北京), riboFECT^TMCP转染试剂(锐博，广州), Cy3-siRNA (锐博，广州)，吉姆萨染液(Solarbio，北京)，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) (Solarbio，北京)，聚肌胞苷酸(poly I∶C)(Sigma，美国)。

L-15完全培养基是在L-15培养基中添加20% FBS、10 ng/mL bFGF、50 mmol/L 2-ME以及200 IU/mL青链霉素混合液。

将斑石鲷在实验室暂养4 d后，用MS-222麻醉剂进行麻醉后放入75%的乙醇中消毒，在无菌条件下取出肾脏组织放在培养皿中移入超净工作台进行操作。将肾脏组织用含3%三抗的1×PBS冲洗3次，用手术刀将肾脏组织切成1 mm³的小块，再用1×PBS冲洗3次后移入15 mL离心管，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液室温消化肾脏组织块15 min后，用含20% FBS的L-15完全培养基终止消化。将消化液用100 μm的过滤筛收集细胞悬液，以1000 g离心5 min。倒掉上清液后用含20% FBS的L-15重悬细胞，1000 g离心5 min，如此重复两次。将冲洗后的细胞沉淀用3 mL L-15完全培养基悬浮后接种在25 cm²的细胞培养瓶中，并在培养瓶上记录细胞信息(细胞组织类型、时间和培养代数)。将细胞培养瓶放入24 ℃生化培养箱(SANYO，日本)中，每天观察细胞生长状况。

观察到细胞铺满培养瓶约85%~95%时，进行传代培养。移除培养液，加入2 mL PBS清洗贴壁细胞，如此重复两次。加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，静置30 s后移除0.5 mL胰蛋白酶，室温下消化至95%左右的细胞变圆脱离细胞培养瓶时加入L-15完全培养基，按1∶2的比例进行传代培养。

取传代后培养至细胞贴壁率达90%以上的斑石鲷肾脏细胞系，移除瓶内原有培养基后用PBS冲洗贴壁细胞两次，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，将消化后悬浮细胞收集到离心管中，1000 g离心5 min，加入2 mL细胞冻存液(50% L-15完全培养基、40% FBS、10% DMSO)重悬，充分混匀后移入无菌冻存管。将冻存管放入程序性降温盒中放入-80 ℃冰箱过夜，然后转入液氮中长期保存。

对冻存细胞进行复苏时，先将冻存的细胞从液氮中拿出，迅速在37 ℃水浴锅中不断摇晃解冻，然后1000 g离心5 min。将离心后的上清移除，加入1.5 mL的L-15完全培养基重悬细胞，接种到25 cm²细胞培养瓶中并将培养基补足至3 mL，放置于24 ℃生化培养箱中进行培养，次日观察细胞生长状态并更换培养基。

将第23代斑石鲷肾脏细胞以1×10⁵/孔的密度接种到12孔板上，将细胞培养板放在24 ℃生化培养箱中培养。培养16 h后，将旧的培养基更换为除FBS浓度不同而其他条件均相同的培养基，FBS浓度为0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%。在培养6 d后，用血球计数板(Brand，德国)对各个浓度下的每孔细胞分别进行计数，每个浓度处理组设置3个平行。

取斑石鲷第24代肾脏细胞进行核型分析。在传代后的细胞培养2 d后，细胞生长铺满瓶底约60%，在培养基中加入秋水仙素，使其终浓度为0.5 μg/mL。将细胞放在24 ℃继续培养4 h后，吸除原培养基，用PBS冲洗两次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后收集细胞，1000 g离心5 min。弃上清，用5 mL 0.075 mol/L的KCl溶液在24 ℃低渗30 min。现配卡诺固定液(冰醋酸∶甲醇=1∶3)并放在冰里预冷，同时将载玻片放在酒精中置于-20 ℃预冷。低渗结束后，加入5 mL预冷的卡诺固定液预固定5 min。将细胞150 g离心5 min，弃上清，加入5 mL卡诺固定液重悬细胞，冰浴10 min，离心弃上清，固定步骤重复两次。根据细胞的残存量加入0.5~1 mL的固定液回溶细胞。用冷滴片法进行滴片，用吸管将含有细胞的卡诺固定液以30 cm以上的高度滴到预冷的载玻片上。将载玻片放在通风处自然晾干，10%吉姆萨染液染色10 min后，用缓水流轻轻冲掉吉姆萨染液，放在通风处晾干后用FISH与核型高端分析系统(徕卡仪器有限公司，徕卡Cytovision, MB8)拍照观察。

取适量细胞，使用动物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)，按照操作步骤提取斑石鲷肾脏细胞的基因组DNA，将提取好的基因组DNA放置4 ℃备用。使用线粒体基因组DNA CO I (cytochrome oxidase subunit I, CO I)基因引物进行PCR扩增(表1)，引物设计参考张宏祥等^[26]。使用PCR仪(Bio-rad，美国)进行目的片段扩增，PCR反应体系为50 μL: 2×Ex Taq Master Mix (TaKaRa, Cat: RR902A) 25 μL，上、下游引物各2 μL, DNA模板2 μL，加RNA-Free水补足至50 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性1 min, 57 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min, 12 ℃保温。取5 μL PCR产物在1%琼糖凝胶中进行电泳检测，并使用多色荧光/化学发光成像系统(法国VILBER, FX6)拍照。将PCR产物纯化后连接到pEASY-T1载体(全式金，北京)并转化到大肠杆菌感受态细胞Trans T1 (全式金，北京)中，挑阳性单克隆送至擎科生物科技有限公司(青岛)测序，将测序结果通过NCBI的BLAST工具进行序列比对分析。

将第23代斑石鲷肾脏细胞以2×10⁵的密度接种在12孔板中，待细胞完全贴壁后，移除旧的培养基，用PBS清洗细胞表面，重复此操作两次，确保洗净细胞表面的双抗，换为每孔931 μL的无双抗完全培养基。转染使用riboFECT^TMCP转染试剂(锐博，广州)，按照以下步骤进行转染：在60 μL 1×riboFECT^TMCP Buffer中加入3 μL Cy3-siRNA荧光标记，轻轻混匀；然后加入6 μL riboFECT^TMCP，轻轻吹打均匀，室温孵育15 min，制备成转染复合物。然后将转染复合物加入12孔板中的一个孔，混匀。24 h后使用倒置荧光显微镜(日本尼康公司，尼康ECLIPSE, TE2000-U)观察细胞荧光信号。

将第23代斑石鲷肾脏细胞以1×10⁵的密度接种在12孔板中，待每孔细胞长满培养孔80%~ 90%时，分别加入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和聚肌胞苷酸(poly I∶C)对OPK进行刺激。LPS组的终浓度分别为1.5、5、15、50、150、500 μg/mL, poly I∶C组的终浓度分别为1.5、5、15、50、150、500 μg/mL，每个浓度设置3个重复，均以PBS为对照组。在LPS和poly I∶C刺激12 h后收取细胞，用于RNA提取。

将处理12 h后的细胞，用TRIzol法提取总RNA，用Nanodrop2000 (Thermo，美国)检测RNA的质量和浓度，并使用反转录试剂盒(TaKaRa, Cat: RR047A)将RNA反转录为cDNA。使用7500 Fast荧光定量PCR系统(ABI，美国)检测免疫相关基因的表达量，引物如表1所示。实时荧光定量实验的反应体系按照TB Green^® Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Cat: RR420A)说明书介绍的方法进行。反应体系为20 μL: SYBR Taq (2×) 10 μL、Rox DyeⅡ (50×) 0.4 μL，上游和下游引物分别为0.4 μL，模板cDNA 2 μL, RNA-Free为6.8 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 40个循环；95 ℃, 15 s; 60 ℃, 1 min; 95 ℃, 30 s; 60 ℃, 15 s。根据实验结果的C_t值，使用2^-ΔΔCt法计算每个样品的相对表达量。实验数据使用SPSS软件进行单因素方差分析，设定P<0.05为差异显著。

表1

表1 　引物序列 Tab. 1 　Primer sequences 基因gene 引物序列primer sequence COⅠ F: 5′-CACAAAGATATCGGCACCCT-3′   R: 5′-CCTGCAGGGTCAAAAAAGGTGGT-3′ IL-1β F: 5′-CTCAGTTCCAGCGGTTTG-3′   R: 5′-GTTCCCTTGATGCCCAGA-3′ IL-8 F: 5′-CCAGCAACCGCCTTCTGTAACAA-3′   R: 5′-AGGTGGAAGTGAACTCAGTTGGTCT-3′ IκB F: 5′-GGAGGACGAGCTGGTGAA-3′   R: 5′-GAGGGCATGATCTGTGGC-3′ IRF3 F: 5′-CAGGAGCAGACAGCCAGAAGAGA-3′   R: 5′-GCCGCCTACAACAGCCATATTCTT-3′ β-actin F: 5′-GCTGTGCTGTCCCTGTA-3′   R: 5′-GAGTAGCCACGCTCTGTC-3′

表1 　引物序列 Tab. 1 　Primer sequences

将用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后分离的细胞悬浮液置于细胞培养瓶中，3 d后发现有贴壁细胞，并随着培养时间的延长，贴壁细胞逐渐增多，细胞呈现纤维状(图1a)。2~3 d更换1次培养基，在原代细胞培养10~14 d之后，细胞能够铺满培养瓶底部大约90%，然后按照1∶1的比例进行传代。细胞初次传代后，大约7 d能够铺满细胞培养瓶。随着传代次数的增加，斑石鲷肾脏细胞生长速度加快，5 d即可传一代，同时细胞类型逐渐趋于单一(图1a)，命名为OPK细胞系。

用分别添加0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% FBS的L-15完全培养基对OPK细胞进行培养，6 d后对不同FBS浓度处理组的细胞数量进行计数。结果如图2所示，在FBS浓度为0%~20%这个范围内，细胞生长速度与FBS浓度呈正相关。当FBS浓度为0%时，细胞几乎不生长，当FBS浓度为20%时细胞生长最快，细胞数量约为2.5×10⁵，是添加0% FBS组的2.5倍。当FBS浓度为25%时细胞数量与添加0%, 5%, 10%, 15% FBS组相比，具有显著差异(P<0.05)，但与20% FBS组无显著差异(P>0.05)。

图1

图1 　原代和传代细胞培养的斑石鲷肾脏细胞系(OPK)细胞a. 原代培养9 d的细胞；b. 第20代的OPK细胞. Fig. 1 　The Oplegnathus punctatus kidney cell line (OPK) cell in primary culture and subculturea. Primary cultured OPK cells at 9 d; b. Subcultured OPK cells at passage 20.

图2

图2 　不同浓度的胎牛血清(FBS)对斑石鲷肾脏细胞系(OPK)细胞生长的影响不同字母代表用不同浓度的胎牛血清培养的细胞生长差异显著(P<0.05). Fig. 2 　The effects of different concentrations of fetal bovine serum (FBS) on growth of Oplegnathus punctatus kidney cell line (OPK) cellsDifferent letters represent significant differences in cell growth between different concentration FBS treatment group (P<0.05).

染色体核型分析结果显示(图3)，第24代OPK细胞染色体数目分布在35~72之间，但大部分为48条(2n=2sm+46t)。在已报道的研究中，斑石鲷染色体核型在雌性和雄性中的数目分别为2n=2sm+46t和2n=1m+2sm+44t^[27]。

将OPK细胞系基因组进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果为特异性单一条带，与预期结果一致(图4a)。将OPK细胞测序结果与斑石鲷线粒体CO I (GenBank No. MN927588.1)序列进行比对，结果显示(图4b), OPK细胞系与斑石鲷线粒体CO I序列相似性约为100%，说明OPK细胞系来源于斑石鲷。

通过riboFECT^TMCP转染试剂(锐博，广州)将Cy3-siRNA成功转入OPK细胞中。结果显示，在转染24 h后可观察到荧光信号(图5)，转染效率约为60%。结果表明OPK细胞系可以进行siRNA转染并基因敲降，可用于基因功能分析等研究。

图3

图3 　第24代斑石鲷肾脏细胞系(OPK)细胞染色体核型分析a. 一个二倍体数目为48的斑石鲷肾脏细胞系(OPK)细胞的染色体；b. OPK细胞染色体二倍体核型. Fig. 3 　The chromosome analysis of Oplegnathus punctatus kidney cell line (OPK) cells at passage 24a. Chromosome from one OPK cells with a diploid number of 48; b. Diploid karyotype morphology of OPK.

图4

图4 　斑石鲷肾脏细胞线粒体CO I基因PCR扩增与序列比对a. OPK细胞线粒体CO I基因PCR扩增产物；b. OPK细胞线粒体CO I测序序列与斑石鲷线粒体CO I序列(GenBank No. MN927588.1)比对分析；深蓝色为一致序列. Fig. 4 　PCR amplification and sequence alignment of CO I gene of Oplegnathus punctatus kidney cells (OPK)a. PCR amplification products of CO I gene of OPK; b. Comparative analysis of sequences between CO I in O. punctatus mitochondria (GenBank No. MN927588.1) and CO I in OPK cells; Dark blue indicates the same nucleotide sequence.

OPK细胞系经LPS和poly I∶C刺激后，使用实时荧光定量PCR检测免疫相关基因IκB、IL-1β、IL-8和IRF3的表达水平。经LPS刺激后IκB、IL-1β、IL-8和IRF3的相对表达量随着LPS浓度的增加而增加(图6a, b, c和d)。如图7显示，在经poly I∶C刺激后，IκB的相对表达量随着poly I∶C浓度的增加表达量不断上升(图7a)，并且在poly I∶C浓度为500 μg/mL的表达量最高。IL-1β的相对表达量呈现先下降后上升的趋势(图7b)。IL-8和IRF3的基因相对表达量呈现先上升后下降的趋势(图7c, 7d)。

斑石鲷作为一种新型的工厂化养殖鱼类，在养殖过程中病害的频发严重制约了斑石鲷养殖业的发展。因此，研究斑石鲷分子免疫机制，进行抗病育种迫在眉睫。鱼类细胞系是进行鱼类免疫学、病理学、转基因和鱼类资源保护与遗传育种等研究的重要工具^[28]。本研究建立了斑石鲷肾脏细胞系，测定了在相同条件下含不同浓度FBS的L-15完全基培养对其生长的影响，并对OPK细胞进行转染、核型分析、细胞系来源鉴定，同时对OPK细胞系进行LPS和poly I∶C刺激后，检测免疫相关基因的相对表达量。斑石鲷肾脏细胞系的建立，为OPK细胞系的进一步应用奠定了基础，同时为斑石鲷的免疫机制研究提供了重要的研究材料，对培育优良的抗病新品种，促进斑石鲷养殖业的健康可持续发展具有重要的意义。

图5

图5 　斑石鲷肾脏细胞系Cy3-siRNA转染a. b的相应光镜图像；b. 转染48 h表达情况，有荧光信号. Fig. 5 　Transfected Oplegnathus punctatus kidney cell line (OPK) cells with Cy3-siRNAa. Light microscope image of b; b. OPK transfected with Cy3-siRNA plasmid after 48 h, and fluorescence signal appeared.

图6

图6 　不同浓度脂多糖(LPS)刺激斑石鲷肾脏细胞后免疫相关基因的表达a. IκB在不同浓度LPS刺激后的相对表达量；b. IL-1β在不同浓度LPS刺激后的相对表达量；c. IL-8在不同浓度LPS刺激后的相对表达量；d. IRF3在不同浓度LPS刺激后的相对表达量. 基因表达量计算以β-actin作为内参；不同字母表示不同LPS浓度间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 6 　Expression analysis of immune related genes in OPK cells after lipopolysaccharide (LPS) stimulationa. Expression level of IκB after LPS stimulation; b. Expression level of IL-1β after LPS stimulation; c. Expression level of IL-8 after LPS stimulation; d. Expression level of IRF3 after LPS stimulation. The expression of gene is calculated relatively to the gene β-actin. Different letters indicate significant difference between different LPS concentration groups (P<0.05).

鱼类原代细胞的培养方法主要有胰酶消化法、组织块培养法和机械分离法、悬浮细胞培养法和微载体细胞培养法等^[29-30]。本研究采用胰蛋白酶消化法获取原代细胞，此方法简单方便、成功率高，胰酶消化法在将组织分散成细胞悬液时可以去掉妨碍细胞生长的细胞间质，使大量的分散细胞直接黏附于细胞培养瓶，同时还可以避免对分离出的原代细胞产生机械损伤^[31-32]。斑石鲷肾脏组织原代细胞系1~2 d就可贴壁，前几代生长较慢，生长稳定后可5~6 d传代。FBS是细胞基础培养基中常用的添加物，在细胞培养中FBS不仅含有细胞生长所需的生长因子、激素、各种蛋白等营养物质，同时还可以促进细胞贴壁、铺展和生长^[33]。之前的研究表明，在同一培养条件下，不同FBS浓度培养的细胞的数量具有明显差异，说明不同的FBS浓度对原代细胞的生长有显著影响^[34-36]。在本研究的FBS浓度实验中，不添加FBS的细胞可以正常贴壁，但细胞未生长，说明FBS是OPK细胞增殖所必需的添加剂。当FBS浓度在5%~20%的范围内，OPK细胞的生长速度与FBS浓度呈正相关，当FBS浓度为20%和25%时，细胞生长并无明显差异，考虑降低成本和节约资源的因素，OPK细胞培养的最适血清浓度为20%。细胞的染色体核型分析是进行细胞系鉴定的一项重要指标，本研究中斑石鲷第24代与之前的研究一致^[27]。对OPK细胞提取DNA后，用斑石鲷线粒体色素细胞C氧化酶I (CO I)基因检测，测序结果显示OPK细胞系与斑石鲷线粒体CO I序列相似性约为99.37%。染色体核型分析和OPK细胞来源鉴定均说明OPK细胞系来源于斑石鲷。

图7

图7 　不同浓度聚肌胞苷酸(poly I:C)刺激斑石鲷肾脏细胞后免疫相关基因的表达a. IκB在不同浓度poly I∶C刺激后的相对表达量；b. IL-1β在不同浓度poly I∶C刺激后的相对表达量；c. IL-8在不同浓度poly I∶C刺激后的相对表达量；d. IRF3在不同浓度poly I∶C刺激后的相对表达量. 基因表达量计算以β-actin作为内参；不同字母表示不同数据间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 7 　Expression analysis of immune related genes in OPK cells after poly I∶C stimulationa. Expression level of IκB after poly I∶C stimulation; b. Expression level of IL-1β after poly I∶C stimulation; c. Expression level of IL-8 after poly I∶C stimulation; d. Expression level of IRF3 after poly I∶C stimulation. The expression of gene is calculated relatively to the gene β-actin. Different letters indicate significant difference between different poly I∶C concentration groups (P<0.05).

肾脏作为硬骨鱼类主要的淋巴器官，在鱼类免疫应答中发挥重要作用^[37-38]。本研究发现，斑石鲷肾脏细胞系经LPS刺激后，细胞中部分免疫相关基因(IκB、IL-1β、IL-8和IRF3)的表达水平随着LPS浓度的增加而增加。经不同浓度的poly I∶C刺激后，斑石鲷肾脏细胞中的IκB、IL-1β、IL-8和IRF3的相对表达量均发生显著变化。白介素 1 (IL-1β)和白介素8 (IL-8)是重要的促炎细胞因子，通常用作激活炎症反应的标志物^[39]。岩鲷(Oplegnathus faciatus)在经LPS和poly I∶C刺激后，头肾中促炎因子IL-1β和IL-8的表达量均出现显著变化^[40]。IκB为NFκB抑制剂，可以防止核易位，在NFκB激活中起着重要作用^[41]。干扰素调节因子3 (IRF3)是干扰素调节因子家族中的重要成员，在先天性免疫抗病毒攻击中发挥重要作用^[42]。虹鳟IRF3在脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(poly I∶C)刺激后表达量上调^[43]。斑石鲷肾脏细胞在受到LPS和poly I∶C刺激后能产生免疫反应，说明斑石鲷肾脏细胞可以作为体外研究免疫相关基因功能和表达调控的重要工具。细胞转染实验是进行体外水平研究目的基因功能的重要途径。在本研究中通过转染Cy3-siRNA，成功表达荧光，说明斑石鲷肾脏细胞系可以用于目的基因的敲降，表明OPK可为斑石鲷基因功能研究提供重要的体外研究平台。

本研究以斑石鲷为研究对象，以其肾脏组织为材料，采用胰酶消化法建立了斑石鲷肾脏组织细胞系，细胞生长状态良好，已持续传代至34代。研究表明，斑石鲷肾脏细胞的最适FBS浓度为20%，可转染Cy3-siRNA并成功表达荧光。斑石鲷肾脏细胞在受到脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(poly I∶C)刺激后，免疫相关基因的表达水平显著上升。斑石鲷肾脏细胞系的建立对斑石鲷的功能基因的分析和鉴定、病毒的鉴定和分离，以及进一步研究斑石鲷的疾病感染机制和疾病防控技术提供了重要材料。