2022, Vol. 29 
鸭绿沙塘鳢(Odontobutis yaluensis)属鲈形目(Perciformes)，虾虎鱼亚目(Gobioidei)，沙塘鳢科(Odontobutidae)，沙塘鳢属(Odontobutis)[1-2]，仅分布于中国东北地区的辽河东部山区支流太子河、鸭绿江中下游及其支流、大洋河、辽东半岛碧流河，为中国特产经济鱼类[3-4]。然而，近年来，由于酷渔滥捕和环境改变，其自然资源日趋枯竭，2016年被评估为《中国脊椎动物红色名录》易危(vulnerable, VU)鱼类[5]，因此其规模化人工繁殖和苗种生产迫在眉睫。关于鸭绿沙塘鳢的研究目前主要集中在其人工繁殖试验[6]、线粒体DNA基因组分析[7]、系统发育和种群遗传结构分析[8]、种群繁殖力和初次性成熟[9]等方面，其人工繁殖效率依然很低。
精液浓度、pH和精子密度是鱼类精子生理学特征的重要组成部分[10]，鱼类精子成熟和精子形成受孕激素的调节[11]，精子在精浆获能后具有运动和受精的能力，被释放到外界环境中进而被激活[12]。一般认为，在外界环境中，鱼类精子激活可通过两种不同的方式进行：离子激活模式和渗透性休克激活模式，离子模式存在于鲑和鲟中，由于淡水中K+的减少，精子在释放到淡水时被细胞内的K+外流激活；渗透模式存在于其他淡水鱼类和海洋鱼类中，精子释放到低渗透的淡水或高渗透的海水时被激活[13-14]。渗透性激活模式下，适当渗透水平的离子(Na+、K+等)和非离子(蔗糖、甘露醇等)都可以提高鱼类的精子活力，渗透性变化是渗透性激活模式的主要诱因[15-16]。王新荣等[6]发现鸭绿沙塘鳢精子密度低、活力差，人工受精率低，这严重制约了鸭绿沙塘鳢人工繁殖效率，而在鱼类的人工授精中，通过研究精子密度、精子激活液可控制精卵比和提高精子活力，进而提高卵的受精率[17-21]。本研究详细探讨了鸭绿沙塘鳢精子生理学特征并筛选出最适精子激活液，以期为提高其人工繁殖效率提供参考。
1 材料和方法 1.1 实验鱼来源及暂养2020年10月，于辽河水系新宾满族自治县太子河、碧流河水系碧流河水库上游、鸭绿江水系丹东凤城叆河流域采捕鸭绿沙塘鳢亲本，挑选体质健壮、成熟度较好雄鱼 60 尾，体长(12.61± 0.15) cm，体重(43.65±19.76) g, 3~4龄(实验后通过耳石进行年龄鉴定)，暂养于大连海洋大学养殖基地水泥池(3 m×1.5 m×1 m)，水深0.5 m，水温(14.7± 1.8) ℃，溶解氧(8.3±1.1) mg/L。
1.2 实验方法 1.2.1 人工催情2020年10月20日进行雄鱼人工催情，使用促黄体素释放素2号(LHRH-A2) 2 μg/kg+地欧酮(DOM) 2 mg/kg，背鳍基部肌肉一次注射，每尾鱼注射量为0.5 mL。催情后置暂养池暂养，48 h后，解剖取出精巢于冰上培养皿中，用于精子生理学指标的测定和精子活力实验。
1.2.2 精子生理学指标的测定临近生殖季节时，随着贮精囊的出现和逐渐膨大，鸭绿沙塘鳢精巢明显分为两部分：前部生精部和后部贮精囊，完全成熟时生精部较细呈棒状，贮精囊膨胀饱满圆厚(图1)。本实验将精巢分为3个部分：前段(图1a)，中段(图1b)和后段(图1c)，并分别进行精液浓度、pH、精子活力、精子密度的测定。
精巢前中后段精子活力观察：用解剖针分别挑取每段精巢中间部分的精液，进行精子的活力观察。
精液的采集方法：(1) 精巢整体。分别取3尾鱼的精巢，经80目筛绢挤压精液至培养皿中，用移液枪吸取精液到离心管中。(2) 精巢分段。取5尾鱼的精巢，按前、中、后分段，用剪刀依次剪断，将所有精巢前、中、后段分开，80目筛绢网布挤压，收集精液。
11-1574-15-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 鸭绿沙塘鳢雄鱼腹面观a. 精巢前段；b. 精巢中段；c. 精巢后段. Fig. 1 Ventral view of male Odontobutis yaluensisa. Anterior testis; b. Middle testis; c. Posterior testis. |
精液浓度、pH、精子密度的测定：用0.9% NaCl溶液将精液稀释200倍，用XB-K-25血细胞计数板在Olympus CX21显微镜下观察计数。精子密度测定：精子密度(个/mL)=(80 个小格子内的精子数/80)×400×104×稀释倍数。每个样重复测3次，结果取平均值。精液浓度测定：将精液装入离心管中，常温下4000 r/min离心30 min，移液枪吸取精浆，并计算精细胞与精液的体积比。精液pH采用精密pH试纸测定，检测3尾鱼，每尾重复测3次。
1.2.3 精子激活液制备根据鸭绿沙塘鳢雌鱼最低产卵水温8 ℃[6]，设计水温梯度5~26 ℃；通过0.1 mol/L的HCl或NaOH滴定配制，设计pH梯度4~10；根据淡水鱼精子必须从高渗透精浆(渗透压摩尔浓度约300 mOsm/kg)释放至低渗透水环境中才能激活[15]，设计离子、非离子浓度梯度；碱度实验参考徐敏等[22]方法。本研究设计了不同梯度水温、pH、离子(NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2)、非离子(葡萄糖、Tris、甘油)、碱度(NaHCO3浓度)共10种单因子精子激活液(表1)。此外，根据鸭绿沙塘鳢精子在不同梯度单因子溶液中的活力实验结果，少量的葡萄糖、甘油和Tris可显著提升精子激活率，而30~70 mmol/L NaCl和KCl可大幅度提高精子活力，进行最适离子和非离子因子的组合，通过逐渐降低整体渗透压，摸索出最佳复合因子激活液组合，期间共设计了17组复合因子组合激活液(G1~G17)(表2)。实验试剂均为分析纯，用纯水配制。
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表1 不同梯度单因子精子激活液设计 Tab. 1 Design of single factor sperm activation solution of different gradients |
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表2 复合因子精子激活液设计 Tab. 2 Design of compound factor sperm activator |
渗透压摩尔浓度的单位，通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压摩尔来表示，可按下列公式计算渗透压摩尔浓度(mOsm/kg)[23]:
| $\begin{array}{l} {\rm{ 渗透压摩尔浓度}}({\rm{mOsm/kg}}) = \\ \;\;\;\;\frac{{{\rm{ 每千克溶剂中溶解的溶克质数 }}}}{分子量} \times n \times 1000 \end{array}$ |
式中，n为一个溶质分子溶解或解离时形成的粒子数。例如在理想溶液中，葡萄糖n=1，氯化钠或硫酸镁n=2，氯化钙n=3，枸橼酸钠n=4。
1.2.4 精子活力观察实验顺序为，先于载玻片上加一滴激活液，后用解剖针挑取少量精液与其混匀，并迅速盖上盖玻片置于OlympusCX21显微镜下观察，同时用秒表计时，每个梯度做3次重复实验。不同水温梯度参考赵会宏等[24]斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)精子活力实验方法，将纯水和精液混匀后，盖上盖玻片，放在不同温度的恒温箱中，每隔10~30 s取出置于显微镜下观察完毕后迅速放回原处。根据鲁大椿等[25]的方法，以精子激活率(activation rate, AR)、快速运动时间(fast movement time, FT)以及精子寿命(life time, LT)作为评价精子活力的指标，其中精子激活率是指随机视野中运动精子占该视野全部精子的百分数，快速运动时间是指从精子激活到70%精子转入慢速运动的时间，精子寿命是指从精子激活开始运动到90%精子停止运动的全部时间。
1.3 数据处理所有实验数据均以平均值±标准差($\bar{x}\pm \text{SD}$)形式表示。统计分析SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用 S-N-K (Student- Newman-Keuls)法进行多重比较方法和显著性差异分析，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析 2.1 鸭绿沙塘鳢精子生物学 2.1.1 鸭绿沙塘鳢精液浓度、pH和精子密度表3 可见，鸭绿沙塘鳢精巢前段精子密度显著高于中、后段(P<0.05)，精巢中、后段精子密度无显著差异(P>0.05)；精巢前段精液浓度远高于中、后段。整体精巢精子密度为(1.83±0.03)×109个/mL，精液浓度为23.10%，精液pH为6.9±0.1。
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表3 鸭绿沙塘鳢精子生理特性 Tab. 3 Physiological properties of Odontobutis yaluensis sperm n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
从表4可见，鸭绿沙塘鳢精子在用纯水激活时，精巢前段精子激活率[(69.67±1.53)%]、快速运动时间[(90.00± 6.56) s]和寿命[(206.33±4.04) s]均显著高于中、后段(P<0.05)。
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表4 鸭绿沙塘鳢精巢前、中、后段精子在纯水中的活力 Tab. 4 Sperm motility in the anterior, middle and posterior segments of Odontobutis yaluensis testis in pure water n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
由于鸭绿沙塘鳢精巢前段精子密度大、活力好，后续精子活力实验均使用前段精巢。表5可见，精子活力随着水温的上升呈现出先上升后下降的趋势，20 ℃时精子活力最高，AR、FT、LT分别为(82.33±3.06)%, (121.67±10.97) s、(206.67±16.26) s，且AR、FT显著高于其他组(P<0.05)。
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表5 鸭绿沙塘鳢精子在不同水温中的活力情况 Tab. 5 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different water temperatures n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
表6 可见，随着pH的上升，鸭绿沙塘鳢精子活力先上升后下降，在pH 6.0时，活力最强，AR、FT和LT分别为(74.00±4.58)%、(160.67±10.02) s、(246.00± 14.18) s, pH 6.0~10.0，精子活力随着pH上升而下降。
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表6 鸭绿沙塘鳢精子在不同pH中的活力情况 Tab. 6 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different pH n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
从表7可见，在NaCl 17~120 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势，在NaCl 68 mmol/L时，精子活力达最高值，其AR、FT和LT分别为(85.00±5.00)%、(322.67±19.14) s、(1839.67±215.28) s。在NaCl 17 mmol/L时，FT显著高于纯水(P<0.05)。在NaCl 120 mmol/L时精子不激活。
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表7 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度NaCl中的活力情况 Tab. 7 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of NaCl n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
从表8可见，在KCl 13~121 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度升高呈现先上升后下降的趋势，在KCl 54 mmol/L时，精子活力最强，其AR、FT和LT分别为(92.67±3.79)%、(237.33±15.57) s、(1194.00±118.88) s。在KCl 13 mmol/L时，AR显著高于纯水(P<0.05)。在KCl 121 mmol/L时精子不激活。
2.3.3 CaCl2对鸭绿沙塘鳢精子活力的影响从表9可见，在CaCl2 9~90 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势，在CaCl2 27 mmol/L时，精子活力最高，其AR、FT和LT为(82.33±4.04)%、(233.33±8.50) s、(376.33±26.73) s。在CaCl2 90 mmol/L时，仍有少许精子被激活，未出现精子聚集情况。
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表8 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度KCl中的活力情况 Tab. 8 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of KCl n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
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表9 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度CaCl2中的活力情况 Tab. 9 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of CaCl2n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
由表10可见，在MgCl2 11 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子AR达到最高值，为(86.67±5.77)%，在MgCl2 53 mmol/L时，FT和LT达到最高值，分别为(178.67±11.24) s、(474.67±14.15) s。在MgCl2 95 mmol/L时，精子不激活。
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表10 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度MgCl2中的活力情况 Tab. 10 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of MgCl2n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
由表11可见，在葡萄糖14~194 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度升高呈现出先上升后下降的趋势，在葡萄糖28 mmol/L时，精子活力最高，其AR、FT和LT分别为(92.33±2.31)%、(157.67±9.50) s、(567.00±71.11) s。在葡萄糖194 mmol/L时，精子不激活。
2.4.2 Tris对鸭绿沙塘鳢精子活力的影响由表12可见，在Tris 4 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子AR达到最高值(93.67±1.15)%，在Tris 99 mmol/L时，FT和LT达到最高值，分别为(215.00±21.28) s、(1484.67±121.01) s。在Tris 198 mmol/L时，精子不激活。
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表11 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度葡萄糖中的活力情况 Tab. 11 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of glucose n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
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表12 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度Tris中的活力情况 Tab. 12 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of glucose n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
由表13可见，在甘油浓度11~195 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度升高呈现出先上升后下降的趋势，在甘油65 mmol/L时，精子活力达到最高值，其AR、FT和LT分别分别为(94.67± 0.58)%、(146.67±9.61) s、(341.33±37.10) s。在195 mmol/L时，精子不激活。
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表13 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度甘油中的活力情况 Tab. 13 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of glycerol n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
从表14可见，在碱度12~119 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力随着溶液浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势，在碱度60 mmol/L时，精子活力达到最高值，其AR、FT和LT分别为(85.00± 1.00)%、(284.33±41.10) s、(1692.00±61.39) s。在碱度119 mmol/L时，少许精子被激活。
2.6 复合因子对鸭绿沙塘鳢精子活力的影响从表15可见，精子在G10组混合溶液中活力最强，其AR、FT和LT分别为(97.00±1.73)%、(558.67±44.41) s、(2359.00±81.30) s。G1组渗透压偏高，精子不激活。以NaCl主导下的G2、G4组，G2组渗透压较G4组大，AR无显著差异(P>0.05)，而FT和LT存在明显差异(P<0.05)，这跟以KCl主导下的G3、G5组情况相似。而以NaCl为主导的G2、G4组，AR显著低于以KCl为主导的G3、G5组(P<0.05)。加入葡萄糖的G6、G7组，对比单因子51、68 mmol/L的NaCl, 40、54 mmol/L的KCl，只延长了FT和LT。G8组虹鳟(Oncorhynchus mykiss)精子激活液[26]并不适用于鸭绿沙塘鳢精子，精子在G9、G10、G17组活力显著高于G8组(P<0.05), G17组在G10组基础上加入葡萄糖，导致整体渗透压偏大，根据单因子及复合因子精子活力情况，精子最适渗透压为110~130 mOsm。G14组较G7组添加4 mmol/L的Tris，精子在G14组AR显著高于G7组，G10较G12、G13组添加4 mmol/L的Tris, G10精子活力显著高于G12、G13组，说明组合中加入4 mmol/L的Tris对精子的AR有提升。
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表14 鸭绿沙塘鳢精子在不同浓度碱度中的活力情况 Tab. 14 Activity of Odontobutis yaluensis sperm in different concentrations of alkalinity n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
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表15 鸭绿沙塘鳢精子在不同复合因子溶液中的活力情况 Tab. 15 Motility of Odontobutis yaluensis sperm in different compound factor combination solution n=3;$\bar{x}\pm \text{SD}$ |
精液浓度和精子密度是精子生物学重要组成部分[10]，为保证卵受精率和后代存活率，鱼类在长期的进化过程中形成了不同的繁殖策略[18,27]。通常，不筑巢繁殖的鱼类，精液浓度和精子密度较高，如鲤(Cyprinus carpio)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)等的精液浓度为57.90%~69.10%，精子密度为(29.4~ 35.6)×109个/mL[25]。此外，同为不筑巢繁殖的中华鲟(Acipenser sinensis)、达氏鲟(A. dabryanus)、俄罗斯鲟(A. gueldenstaedtii)，精液浓度为7.67%~ 17.37%，精子密度为1.52×109~3.26×109个/mL[28-30]。为弥补精子密度较低的缺陷，雄鱼常具较大的排精量，如1尾中华鲟雄鱼精液量可达1000~ 5952 mL[30]。筑巢繁殖的鱼类，精液浓度和精子密度较低，如纹缟虾虎鱼(Tridentiger trigonocephalus)精子密度为(1.73±0.08)×109个/mL[31]，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)精子密度为0.01×109~0.1×109个/mL[32]，通过在狭小的鱼巢内受精，增加精卵结合机会，保证卵受精率，产卵受精后，雄鱼护卵孵化保证后代存活率(表16)。
本研究发现，鸭绿沙塘鳢作为筑巢繁殖的鱼类，精液浓度、精液量和精子密度较低，分别为23.10%、0.7 mL、1.83×109个/mL，在繁殖期，为保证卵受精率，鸭绿沙塘鳢雄鱼寻找巢穴，引诱雌鱼入巢，一系列发情动作后，雌鱼产卵，雄鱼立即将精液排到鱼巢上部内表面，鸭绿沙塘鳢精液为白色，粘稠状，遇水缓慢散开，这进一步保证卵受精率，此外，雄鱼腹部朝上护卵孵化进一步保证后代存活率[33]。
研究精子密度可为人工授精提供参考，使用适宜的精卵比可节省精液并提高卵受精率、孵化率，但不同鱼类人工授精最适精卵比在103~106∶1，之间存在较大差异[18]。已有研究表明，虹鳟精卵比20×104∶1时，卵受精率最高，为80.42%[34]；大西洋鲑(Salmo salar)精卵比50×104∶1时，卵受精率和孵化率最高，分别为71.29%、68.18%[21]；大西洋鳕(Gadus morhua)精卵比10×104∶1时，卵受精率可达60%以上[35]；黄颡鱼精卵比10×104∶1时，卵受精率和孵化率最高，分别为97.55%、92.00%[36]；草鱼和鲢精卵比(30~40)×104∶1时，卵受精率85.0%以上[25]；翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)精卵比10×104∶1时，卵受精率和孵化率最高，分别为69.42%、59.82%[36]；西伯利亚鲟(A. baerii)精卵比100×104∶1时，卵受精率和孵化率最高，分别为81.50%、68.2%[37]。参考同为鲈形目的翘嘴鳜精卵比10×104:1的标准，鸭绿沙塘鳢1尾成熟雄鱼平均精液量为0.7 mL，平均精子密度为1.83×109个/mL, 1尾雄鱼可供12810粒卵完成受精，鸭绿沙塘鳢个体绝对繁殖力为1200粒[9]，雌雄比经计算为10.7∶1，但这与自然条件下，1个鱼巢雌雄比1~4∶1有较大出入，鸭绿沙塘鳢人工授精适宜的精卵比(雌雄比)还有待进一步研究。
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表16 几种鱼类精液浓度、精子密度比较 Tab. 16 Comparison of sperm concentration and sperm density of several fishes |
研究表明，胡鲇科(Clariidae)、沙塘鳢科(Odontobutidae)、虾虎鱼科(Gobiidae)、鳚科(Blennidae)、鲿科(Bagridae)、三鳍鳚科(Tripetrygiidae)和蟾鱼科(Batrachoididae)等鱼类具贮精囊，贮精囊除贮存精子外，也可能包括激素合成、物质分泌及储存等几个方面[42]。虾虎鱼类因其贮精囊结构致使精液难以挤出[43-44]，江寰新等[45]发现中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)精巢生精部为小叶型结构，不具辐射状，精原细胞存在于精小叶四周，且在原位发育成熟后，精小囊破裂，精子汇集进入许多小叶腔相互连通的精子通道中，最后精子由靠近输出管的小叶腔进入输出管；贮精囊为网状管状结构，长度约是生精部的1/3，贮精囊旁具膜状突起，其组织学结构与贮精囊一样，在生殖季节，贮精囊内管状囊腔存在大量分泌物，只贮存少量精子，贮精囊一侧具输精管。同样，赵晓勤[46]发现河川沙塘鳢(O. potamophila)精子在生精部成熟后，精囊腔隔膜破裂，成熟精子流向贮精囊，虽然贮精囊和生精部基本组成单位都是小室腔，但贮精囊腔截面积约为生精囊腔的8~13倍，且内含分泌物较多，包括黏多糖、单糖、黏蛋白等，同时精子密度也低于生精囊腔部位。贮精囊功能具种的差异，如异囊鲇(Heteropneustes fossilis)贮精囊不作为精子贮存用，只有少量精子存在于贮精囊与精巢连接处，但贮精囊是最佳的受精条件所必不可少的[47-48]。棕鮰(Ictalurus nebulosus)和长吻鮠(Leiocassis longirostris)贮精囊无贮存精子作用，但其上皮细胞分泌物可供给精子在输精管中的运动能量及具有稀释精子作用[49-50]。黄颡鱼贮精囊主要分泌各种物质调节精子活力，同时也作为精子贮存用[51]。绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis) 生殖前期贮精囊囊腔内贮存大量精子，后期囊腔结缔组织更薄，囊腔体积不断扩大，大量精子呈漩涡状，贮精囊精子蓄积期较长，当蓄积到一定量的时候，轻压鱼体腹部即有乳白色精液流出[42]。大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)、中华乌塘鳢、河川沙塘鳢在繁殖期时贮精囊的近端、中央或远端均先后贮存大量精子，并混合在分泌物中[45-46,52]。
表4 可见，本研究人为将鸭绿沙塘鳢精巢分为前段、中段、后段，发现鸭绿沙塘鳢精子密度前段显著高于中后段，这在很多鱼类精巢中很少见，如绿鳍马面鲀贮精囊可蓄积大量精子，轻压鱼体腹部即可流出[42]。一般情况下，越靠近生殖突精子量应该越高，但本研究与同属河川沙塘鳢、中华乌塘鳢研究结果一致[45-46]，推测鸭绿沙塘鳢贮精囊其功能也只是贮存少量精子，贮精囊分泌和贮存的物质随着精液排出体外后，对精子起到保护作用。鸭绿沙塘鳢精巢结构和功能与其繁殖行为紧密相关，在繁殖期，1个鱼巢内往往存有1尾雄鱼和1~4尾雌鱼，雌鱼产卵后，雄鱼立即将精液排到鱼巢上部内表面，为了完成受精，雌雄鱼需多次排卵、排精。鸭绿沙塘鳢精巢前段精液浓度、精子密度和活力均高于中、后段，鉴于此，生产上可通过剖开鱼腹取出精巢，剪取前段精巢进行人工授精。
3.1.3 精浆pH精浆pH的变化是影响精子能否获能的因素之一，如自然条件下，日本鳗鲡(Anguilla japonica)精巢精子被精浆中的低pH(pH 7.5)和高K+包围，但当它移动到精子导管时，它会经历pH升高(高达8.0)，同时精浆中K+的浓度也会降低，进而能被激活。从日本鳗鲡、虹鳟、大马哈鱼(O. keta)精巢中收集的未经精子导管的精子不能激活，而将收集的精子在含有高pH溶液中培养后可被激活[53-56]。不同个体、种类的鱼精浆pH会有不同，鸭绿沙塘鳢精液pH 6.7~7.0，呈弱酸性，这与洛氏鱥(Rhynchocypris lagowskii Dybowski) 6.67接近，与精浆呈弱碱性的鱼有差异，如圆口铜鱼、鲢、拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)、松浦镜鲤(C. carpio Songpu)、方正鲫(C. auratus) 7.0~7.5，大口鲇(Silurus meridionalis) 7.3~7.5，团头鲂、鲤、青鱼、鳙6.5~7.5，大黄鱼6.72~7.25，草鱼6.5~8.0[40,57-58]。
3.2 水温、pH对精子活力的影响水温是影响精子活力的关键因素之一，一般认为水温与精子活力之间的关系是一条呈下降趋势的二次曲线[24]。本研究得到类似的结果，表5可见，在5~20 ℃时，随着水温的上升，精子活力增强，在20 ℃达到最高值，在20~26 ℃时，随着水温的继续上升，精子活力减弱。
研究表明，大多数鱼类精子在弱碱性溶液中活力最强，过碱或过酸都会降低其活力[24,59]。表6可见，本研究中，pH在5.0~8.0时，存在50%以上的精子被激活。在弱碱性的NaHCO3中(pH 8.2~8.4)鸭绿沙塘鳢精子仍然可保持较高的活力，精子活力最适pH为6.0，这与马口鱼(Opsariichthys bidens)、中华乌塘鳢最适pH相同[44,60]，与其他淡水鱼有一定差异。
3.3 离子浓度对精子活力的影响表7 ~10可见，低渗溶液会激发淡水鱼的精子活力，受离子组成的影响。在本研究中，所有的激活液，无论是否存在离子，都能够激活鸭绿沙塘鳢精子活力，这一点在拉氏鱥(Phoxinus lagowskii)[61]、北方须鳅(Barbatula barbatula nuda)[62]中也可观察到，这证明鸭绿沙塘鳢精子是被低渗透性休克激活。本研究表明，当NaCl、KCl、CaCl2浓度分别为68、54、27 mmol/L时鸭绿沙塘鳢精子活力较强；当MgCl2浓度为11 mmol/L时，激活率较高，在53 mmol/L时，快速运动时间和寿命较高。
3.4 葡萄糖、甘油、Tris对精子活力的影响表11 ~13可见，低浓度的葡萄糖、甘油、Tris均可显著提高鸭绿沙塘鳢精子激活率。现有观点普遍认为，外源葡萄糖可为精子运动供能，白斑狗鱼(Esox Lucius)、高白鲑、乌原鲤(Procypris merus)鱼类的精子处于一定浓度的葡萄糖溶液中，可有效提高其精子活力[38,63-64]。本研究中，精子在葡萄糖28 mmol/L时活力最高。
Tris常作为精液冷冻保存稀释液中的缓冲物质，可以缓冲精液的酸碱度、调节渗透压以及为精子提供适宜的环境以暂时存活，这有助于解冻后精子运动[65]。本研究中，4 mmol/L的Tris可显著提高鸭绿沙塘鳢精子激活率，99 mmol/L的Tris可显著延长精子快速运动时间和寿命(P<0.05)，这与少量的Tris就使拉氏鱥[61]、北方须鳅[62]精子活力降低不同。
甘油常作为渗透性保护剂，可提高精子质膜的通透性，引起水流入，同时水流入导致的细胞膨胀可能继而打开膜张力依赖的离子通道，精子被激活[66]。在精子激活液方面，使用适宜浓度的甘油可增强许多鱼类精子活力，如高白鲑和高体雅罗鱼(Leuciscus idus)精子最适甘油浓度分别为219 mmol/L和180 mmol/L[67-68]，本研究中，鸭绿沙塘鳢精子在65 mmol/L的甘油中，精子可保持较高活力。
3.5 碱度对精子活力的影响表14 可见，NaHCO3在水溶液电离、水解成Na+、HCO3-、OH-、CO32-、H+，在20 ℃下，NaHCO3溶液浓度10~120 mmol/L时，pH呈8.2~8.4，水溶液中的Na+、高pH环境及游离的CO2都会影响精子活力。已有研究表明，日本鳗鲡、虹鳟、大马哈鱼精巢中的精子在高pH溶液中可被激活[53-56]。本研究下，碱度在60 mmol/L时，鸭绿沙塘鳢精子活力最强，随着碱度浓度升高，精子活力降低，渗透压增大是影响精子活力的主要原因。
3.6 复合因子对精子活力的影响表15 可见，在复合因子激活液中，精子活力与渗透压、离子(Na+、K+)和非离子(甘油、Tris)相关。本研究中，组成成分具差异的G1、G8组，其渗透压基本相同，但激活率却相差10%。此外，葡萄糖在组合 (G6、G7、G14、G15、G16、G17)中无法提高精子激活率，而甘油、Tris在组合(G9、G10、G12、G13、G14、G17)中，对提升精子激活率效果明显。其中精子在KCl 40 mmol/L、甘油33 mmol/L、Tris 4 mmol/L组合成的激活液中精子活力最高。
研究表明，多数淡水鱼类精浆渗透压为286~334 mOsm/kg，鲟类精浆渗透压较鲤科、鲑科鱼类低，通常精子需释放到低渗透的外界环境中才能运动，精浆与激活液渗透压相等或接近时，精子活动将受到抑制，如鲤、鲫和团头鲂精子活动最适渗透压为150~200 mOsm/kg；中华鲟为50 mOsm/kg[30]。不同鱼类精子对渗透压的适应性不同，部分淡水鱼类精子可在较高渗透压激活液中快速运动，如乌鳢精子在激活液渗透压达到300 mOsm/kg时，仍可快速运动，北方须鳅、拉氏鱥精子分别在激活液渗透压626、350 mOsm/kg时，精子活力最高，这可能是由于鱼类精浆渗透压较高所导致[61-62]。与北方须鳅、拉氏鱥精子在单因子激活液中活力较好，通过单因子的累加即可得到最适复合精子激活液不同，鸭绿沙塘鳢精子在单因子累加的复合激活液中不激活，需通过降低复合溶液渗透压，再进行多种组合，进而筛选出最佳复合因子激活液。
4 结论鸭绿沙塘鳢精液浓度23.10%，精子密度(1.83±0.03)×109个/mL, pH为6.9±0.1，精巢前段精液浓度、精子密度和活力高于中、后段，生产上可通过剖开鱼腹取出精巢，剪取前段精巢进行人工授精。单因子下，适当浓度的NaCl、KCl、碱度、CaCl2溶液可增强鸭绿沙塘鳢精子活力，低浓度的MgCl2、葡萄糖、甘油、Tris对鸭绿沙塘鳢精子激活率有较大提升。多因子下，鸭绿沙塘鳢精子在由KCl 40 mmol/L、甘油33 mmol/L、Tris 4 mmol/L组合成的激活液中活力最好，生产上可使用此复合激活液，有效解决鸭绿沙塘鳢人工授精中精子活力低的问题，同时，本研究内容也可为其他珍稀鱼类精子激活液的筛选提供参考。
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