草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)的基因组由11条分节段的双链RNA组成，无囊膜，有双层蛋白衣壳。根据其基因组S6片段的同源性，可以将国内已分离出的数十株草鱼呼肠孤病毒分为3个基因型，分别是以GCRV-873为代表的I型，以GCRV-HZ08为代表的II型以及以GCRV-104为代表的III型^[1]。由草鱼呼肠孤病毒感染引起的草鱼出血病给草鱼(Ctenopharyngodon idella)养殖业带来了严重的经济损失。防治草鱼出血病的手段主要有注射疫苗、使用免疫增强剂等。然而，我国目前只有针对I型GCRV的减毒活疫苗实现了商品化生产，且注射疫苗因操作繁琐面临较大推广难度。现有的免疫增强剂没有抗病毒特异性，临床治疗效果欠佳。鉴于针对单一基因型的草鱼呼肠孤病毒开发的药物和疫苗难以取得良好的临床防控效果，草鱼养殖行业急需价格适中、绿色环保的广谱抗GCRV的药物。

槲皮素(quercetin, Qct)是植物界分布最广的生物类黄酮之一^[2]。大量研究表明槲皮素具有很广泛的药理学活性，特别是在心血管方面，不仅可以降血压、降血脂，还具有抗血栓，抑制心肌肥厚等作用，此外还有广谱抗菌、消炎和抗病毒效果^[3]。本实验室前期研究发现，槲皮素可以降低I型和III型GCRV在草鱼细胞中的复制效率^[4]，在以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为感染模型的体内实验中可以降低II型GCRV的复制效率^[5]。但是，槲皮素在草鱼体内的药代动力学参数尚无研究，槲皮素的体外半数有效抑制浓度(EC₅₀)还没有测定。由于药代动力学参数和基本的药效学数据是确定槲皮素临床使用剂量的前提，槲皮素相关参数的欠缺影响了其在草鱼养殖过程中的合理应用。

为了评估槲皮素作为广谱抗GCRV感染药物的应用前景，本研究基于GCRV的草鱼细胞感染模型测定了槲皮素的EC₅₀，利用高效液相色谱法测定了槲皮素在草鱼体内的药代动力学曲线，确定了药代动力学参数，并以II型GCRV感染稀有鮈鲫为体内动物模型评价槲皮素的炎症抑制效应。本研究的结果为槲皮素在草鱼养殖中的抗病毒应用提供了理论支持。

健康草鱼购自南浔和孚鸿浩水产东庭农场，平均体重(30±10) g，放置于上海海洋大学国家水生动物病原库的鱼房内50 L的水族缸内暂养，暂养期间保证氧气充足，在(22±2) ℃温度条件下正常投喂，于试验前2 d停止投喂。稀有鮈鲫由中国科学院水生生物研究所提供，体长为2.1~2.8 cm，平均体重为0.3 g，安置在鱼房内30 L的水族缸中饲养。在(25±2) ℃温度条件下暂养7 d后进行实验，实验期间不喂食。

原始草鱼肾脏细胞系(CIK)购自武汉保藏中心，由本实验室保存。用于体外感染实验的草鱼I型呼肠孤病毒JX01株和用于体内感染实验的草鱼II型呼肠孤病毒GCRV-JX02株于2011年分离自江西省南昌市，由本实验室保藏^[6]。

槲皮素标准品(≥99%)购自上海生工生物工程股份有限公司；95%槲皮素粗提物由四川恒瑞通达生物科技有限公司提供；甲醇(质谱级)和正己烷(质谱级)购自国药集团化学试剂有限公司；L-抗坏血酸，乙二胺四乙酸二钠和4%多聚甲醛固定液购自上海生工股份有限公司；逆转录试剂盒RR036A和荧光定量试剂TBgreenRR820A购于TaKaRa公司。

高效液相色谱仪购自上海伍丰科学仪器有限公司；9 mm螺旋口自动进样瓶、9 mm自动进样瓶拧盖购自上海安普实验科技股份有限公司；0.22 μm针头式过滤器(有机系)购于上海生工生物工程股份有限公司。

将草鱼CIK细胞传至96孔板中，在27 ℃培养箱中培养至细胞单层铺满孔板的80%~90%后，去除上清，每孔加入2 mL 2%的M199培养基，后分别加入浓度为1、5、10、15、20和30 μg/mL的槲皮素标准品(用DMSO溶解)配制溶液进行预处理。密封6孔板后，将细胞放回27 ℃培养箱培养8 h。后加入JX01病毒(MOI=1)孵育1 h，去掉上清。每孔加入2 mL 2%的M199培养基后，再分别加入槲皮素浓度为1、5、10、15、20和30 μg/mL的溶液孵育36 h，取不同浓度的细胞上清液检测病毒滴度。

根据Trizol试剂说明书进行总RNA提取，测定总RNA浓度后使用5×PrimeScript^RT Master Mix酶试剂盒进行逆转录。逆转录得到的cDNA作为模板，引物序列为F: 5′-ACCCCTCTGACGACA CCC-3′; R: 5′-GAGCCTGAAGCCAGCACA-3′^[4]。通过比较槲皮素处理后的细胞与对照组细胞感染上清中子代病毒产量的减少来进行病毒抑制效果分析。利用SPSS 24.0中的probit分析计算EC₅₀。

选取大小合适、活力健康的90条草鱼分为3组，在25 ℃左右下暂养1周，用95%槲皮素粗提物按高(60 mg/kg)、中(40 mg/kg)、低(20 mg/kg) 3个剂量口灌草鱼。每组3条鱼设置平行组，在给药0.5、1、2、4、8、12、24、48、72和84 h后于草鱼尾静脉取血，同时取肝胰脏和肾脏组织样品。取出的血液样品立即加入2%草酸钾抗凝剂(V_抗凝剂∶V_血浆=1∶10)并混匀，4000 r/min离心10 min。所有的样品放置于-80 ℃冰箱保存待用。

样品前处理：500 μL血样加入750 μL甲醇，6000 r/min离心5 min，得到上清，重复两次。合并两次上清后12000 r/min下离心20 min，收集上清液。用0.22 μm针头式过滤器过滤，然后进行HPLC检测。分别取0.1 g的肾脏样品及肝胰脏样品于5 mL离心管中，加入0.5 mL甲醇后进行匀浆，重复4次，最终得到2 mL组织匀浆液。在其中加入20%的维生素C溶液40 μL和0.05%的Na₂EDTA溶液200 μL，混匀后，再准确加入等体积的正己烷，12000 r/min下离心20 min后吸除去上层正己烷，取下层澄清溶液用0.22 μm针头式过滤器过滤，保存于进样瓶中待测^[7]。

回收率和精密度：取未处理样品血液500 μL及未处理样品肝肾组织0.1 g，分别加入1 mg/mL的槲皮素溶液，之后稀释至5 μg/mL、10 μg/mL, 20 μg/mL，按照槲皮素样品前处理方法处理，测定回收率。每个浓度3个平行，取其平均值为实际测定浓度。

回收率=C_r/C₀×100%, C_r为空白样品测定后的浓度，C₀为加入的槲皮素的已知标准浓度。

精密度：同一样品1 d内不同时间测3次，连续测3 d，计算血液和组织中槲皮素的日内和日间变异系数，以判断该方法的精密度。

数据处理：标准曲线、药时曲线用Excel 2010绘制，使用药代动力学软件PKsolver对各组实验数据进行分析。

选取健康活力好的稀有鮈鲫16尾，分为2组，在(25±2) ℃条件下暂养1周，两组均腹腔注射30 μL GCRV-JX02, 2 d后，实验组腹腔注射30 μL 0.5 mg/mL的槲皮素粗提物，对照组腹腔注射等体积的PBS作对照。实验周期为12 d，观察并记录两组稀有鮈鲫的死亡情况。收集死鱼并对其肝、肾、鳃、心、脑、肠和脾组织进行PCR检测，以确认是否为GCRV-JX02感染，采用5×PrimeScript^RT Master Mix酶和GCRV-II的S6基因片段引物(P02-F: 5ʹ-GCTGATGCTGCAGACGGCTAAAC-3ʹ和P02-R: 5ʹ-TAATTGCCTGCTGCGCTGACT-3ʹ)逆转录。反应条件为：95 ℃预变性1 min 30 s; 94 ℃变性20 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸60 s, 34个循环；72 ℃延伸5 min, 4 ℃电泳保温。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。以逆转录得到的cDNA为模板进行RT-PCR，使用引物Q-vp56-F: 5ʹ-TAGCCACGGGAGAAGGGTTA-3ʹ和Q-vp56-R: 5ʹ-GCGACGGCTATAGGTGGAAA-3。反应条件为：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 58 ℃退火30 s，共39个循环。以计算对照组与实验组病毒基因组的拷贝数变化。

挑选体表出血症状明显的新鲜的稀有鮈鲫，解剖分离出肝、肾、鳃、心、脑、肠和脾组织后立即放入4%多聚甲醛中固定48 h。常温静置48 h；乙醇脱水：用由低到高浓度的乙醇依次浸泡，首先是70%乙醇40 min，其次是80%乙醇40 min，接着是90%乙醇和95%乙醇各40 min，最后用无水乙醇浸泡40 min两次；透明：组织依次在3个二甲苯容器中各浸泡1 h；浸蜡：组织依次在3个石蜡容器中各浸泡1 h；包埋：待液态的石蜡完全冷却变硬后，切成厚度均匀的切片(4~5 μm)；烘干：将切片放置65 ℃烘箱中6 h；石蜡切片脱蜡：依次将切片放入二甲苯I 20 min→二甲苯II 20 min→ 无水乙醇I 5 min→无水乙醇II 5 min→75%乙醇5 min→50%乙醇5 min梯度脱蜡，最后自来水洗^[8]; HE染色：石蜡切片放入苏木素染液染3~5 min，自来水洗，分化液分化，自来水冲洗，1%氨水水溶液返蓝1 min，流水冲洗数秒，然后切片依次放入85%、95%的梯度乙醇脱水各5 min，放入伊红染液中染色5 min；脱水封片：石蜡切片依次放入75%乙醇2 min→85%乙醇2 min→无水乙醇5 min→二甲苯5 min透明，将切片从二甲苯中取出用中性树胶封片。之后进行显微镜镜检，图像采集分析^[9]。

为了验证槲皮素在体外的抗病毒效果，利用不同浓度的槲皮素作用于感染了GCRV-JX01的CIK细胞。如图1a所示，不同剂量槲皮素处理感染GCRV-JX01的CIK细胞36 h后，在显微镜下可以看到与对照组相比，感染组(JX01)有大量漂死的细胞及细胞碎片，细胞病变效应(CPE)非常明显。槲皮素处理组与感染组(JX01)相比，随着槲皮素浓度的增加，漂死细胞及CPE减少，CIK细胞活力呈依赖性增加。如图1b所示，经过15 μg/mL以上槲皮素处理的CIK细胞对病毒感染的抵抗力增加，病毒复制水平明显受到槲皮素剂量依赖性抑制。CIK细胞中槲皮素抗GCRV-JX01的EC₅₀为4.796 μg/mL，说明槲皮素能够有效抑制GCRV-JX01的复制，具有开发成为小分子药物的潜能。

图1

图1 　槲皮素对草鱼肾脏细胞系(CIK)细胞中GCRV-JX01复制的抑制作用a. 不同剂量槲皮素作用感染了GXRV-JX01的CIK细胞；b. 利用SPSS 24.0中的probit分析计算EC50. Fig. 1 　Suppress of quercetin (Qct) on GCRV-JX01 replication in CIK cellsa. Different doses of Qct act on CIK cells infected with GXRV-JX01; b. Calculation of EC50 using probit analysis in SPSS 24.0.

口灌20、40和60/mg/kg体重95%槲皮素粗取物溶液后，草鱼存活率如图2a所示，各浓度处理组存活率都为100%，表明该浓度下，槲皮素对草鱼无毒性。由表1可知，含有槲皮素标准品5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的组织样品中，草鱼血液、肝胰脏和肾脏样品中的回收率分别为86.36%~94.24%、100.15%~107.41%和79.74%~ 104.49%；其日内变异系数分别为5.83%~6.63%、3.74%~7.05%和6.61%~13.48%；日间变异系数为9.17%~13.36%、8.75%~13.07%和4.65%~11.35%，表明此方法处理样品组织，可以得到较高的回收率，重复性良好。

为了确定槲皮素在草鱼体内的代谢情况，分别单次口灌20、40、60 mg/kg 体重95%槲皮素粗提物溶液后，草鱼血液、肾脏和肝胰脏的药时曲线如图2b~2d所示。不同质量浓度槲皮素处理组在血液、肝胰脏和肾脏中的含量变化趋势一致，均呈现先上升后下降再上升后下降的变化趋势，一共出现了两个峰值。由图2b知，口灌20、40、60 mg/kg槲皮素溶液8 h后，草鱼血液中槲皮素的含量分别为0.072 μg/mL、0.109 μg/mL、0.097 μg/mL；口灌48 h后草鱼体内的槲皮素含量开始呈下降趋势，48 h时，血液中槲皮素的含量分别为0.129 μg/mL、0.983 μg/mL、1.216 μg/mL。由图2c可知，口灌20、40、60 mg/kg槲皮素溶液8 h后，草鱼肾脏中槲皮素的含量分别为1.321 μg/g、1.693 μg/g、2.095 μg/g; 48 h时槲皮素的含量分别为1.830 μg/g、2.674 μg/g、3.709 μg/g；由图2d可知，口灌20、40、60 mg/kg槲皮素溶液8 h后，草鱼肝胰脏中槲皮素的含量分别为1.363 μg/g、1.453 μg/g、2.413 μg/g; 48 h时槲皮素的含量分别为4.643 μg/g、7.377 μg/g、9.288 μg/g。

表2 所示，口灌20、40、60 mg/kg体重的95%槲皮素粗提物溶液后的药代动力学研究表明，血液中最大峰值浓度(C_max)分别为0.129 μg/mL、0.583 μg/mL、0.666 μg/mL；肝胰脏中C_max分别为3.822 μg/g、5.386 μg/g、6.252 μg/g；肾脏中C_max分别为2.437 μg/g、3.140 μg/g、3.447 μg/g。所有剂量在测试组织中被测到达到最高浓度的时间(T_max)均为48 h，说明槲皮素吸收较慢。血液中槲皮素的药物半衰期为18.564~19.707 h，肝胰脏中槲皮素的药物半衰期为19.048~21.398 h，肾脏中槲皮素的药物半衰期为18.601~22.329 h，表明药物半衰期与药物剂量呈依赖关系。曲线下面积(area under curve, AUC)在槲皮素浓度为20~60 mg/kg的范围内随着槲皮素浓度的增加而显著增加。在各时间点，肝胰脏中槲皮素的浓度明显高于肾脏，肝胰脏和肾脏中的槲皮素浓度高于血液中的槲皮素浓度。表明槲皮素更富集于肝胰脏中，肾脏次之；槲皮素在肝胰脏和肾脏中更长的平均驻留时间(MRT)也表明槲皮素在这些组织中存在的时间更长。

表1

表1 　草鱼血液、肝胰脏和肾脏中槲皮素的回收率和精密度 Tab. 1 　Recovery and precision of quercetin in blood, hepatopancreas and kidney of Ctenopharyngodon idella 组织tissue 含量/(μg/mL)content 回收率/% recovery 日内变异系数/% intra-day coefficient of variation 日间变异系数/% inter-day coefficient of variation 血液blood 5 86.36 6.06 9.17   10 91.69 6.63 13.36   20 94.24 5.83 11.11 肝胰脏 hepatopancreas 5 102.76 7.05 8.75   10 107.41 3.74 13.07   20 100.15 4.64 11.40 肾脏kidney 5 79.74 13.48 11.35   10 98.98 6.61 5.76   20 104.49 12.08 4.65

表1 　草鱼血液、肝胰脏和肾脏中槲皮素的回收率和精密度 Tab. 1 　Recovery and precision of quercetin in blood, hepatopancreas and kidney of Ctenopharyngodon idella

图2

图2 　草鱼的槲皮素安全浓度及口灌不同剂量槲皮素下的肝胰脏、肾脏、血液中槲皮素的药-时曲线 Fig. 2 　Safety concentration and drug-time curve of quercetin in hepatopancreas, kidney and blood in Ctenopharyngodon idella

将未经槲皮素注射组和30 μL 0.5 mg/mL槲皮素处理组同时腹腔注射GCRV-JX02，分别标记为对照组和治疗组。12 d实验周期结束后，立即收集鱼的组织样品，进行PCR检测及病理分析。图3a PCR检测结果表明，在稀有鮈鲫的心脏、肠、肌肉、鳃、肾脏、肝和脑中都能成功检测到GCRV-JX02，相比于只感染病毒的对照组，被槲皮素治疗组的条带更浅，肠和心脏组织甚至没有条带。图3b qRT-PCR结果显示，槲皮素治疗组的病毒拷贝数与对照组相比明显降低。图3c表明被槲皮素治疗后稀有鮈鲫的存活率从对照组的0%提升到80%，进一步表明槲皮素对感染了GCRV的稀有鮈鲫具有明显的保护效果。

表2

表2 　口灌不同剂量槲皮素在草鱼血液、肝胰脏和肾脏中的药代动力学参数 Tab. 2 　Pharmacokinetic parameters of different doses of quercetin in blood, hepatopancreas and kidney of grass carp after oral administration 药代动力学参数 pharmacokinetic parameteter 血液blood 肝胰脏hepatopancreas 肾脏kidney 20 mg/kg 40 mg/kg 60 mg/kg 20 mg/kg 40 mg/kg 60 mg/kg 20 mg/kg 40 mg/kg 60 mg/kg AUC (0-t)[mg/(L·h)] 7.002 29.78 34.304 195.174 275.972 317.119 125.330 160.520 176.841 AUC (0-∞)[mg/(L·h)] 8.024 33.889 39.709 229.126 327.781 363.477 151.007 189.025 201.353 MRT/h 27.458 26.782 28.431 29.771 30.871 27.481 32.213 30.062 26.836 T1/2z/h 19.032 18.564 19.707 20.636 21.398 19.048 22.329 20.837 18.601 T max/h 48 48 48 48 48 48 48 48 48 CLz/F (L/h/kg) 2.493 1.180 1.511 0.087 0.122 0.165 0.132 0.212 0.298 C max 0.129 μg/L 0.583 μg/L 0.666 μg/L 3.822 μg/g 5.386 μg/g 6.252 μg/g 2.437 μg/g 3.140 μg/g 3.447 μg/g 注：AUC (0-t)、AUC (0-∞)分别表示曲线下面积(0-t)和曲线下面积(0-∞); MRT表示平均驻留时间；T1/2表示消除半衰期；CLz/F表示总体消除速率；Tmax和Cmax分别表示最大峰值浓度时间和最大峰值浓度. Note: AUC (0-t) and AUC (0-∞) represent the area under the curve (0-t) and the area under the curve (0-∞), respectively; MRT represents the average residence time; T1/2 represents the elimination half-life; CLz/F represents the overall elimination rate; Tmax andCmax indicate the maximum peak time and concentration, respectively.

表2 　口灌不同剂量槲皮素在草鱼血液、肝胰脏和肾脏中的药代动力学参数 Tab. 2 　Pharmacokinetic parameters of different doses of quercetin in blood, hepatopancreas and kidney of grass carp after oral administration

图3

图3 　槲皮素对感染了GCRV-JX02的稀有鮈鲫的保护效果a. 对照组和治疗组稀有鮈鲫各组织电泳图. M：DNA标准物质2000; NC：健康鱼组织；H：心脏；I：肠；Mu：肌肉；G：鳃；K：肾；L：肝胰脏；B：脑；+表示Qct治疗组. b. 稀有鮈鲫感染GCRV-JX02后各组织病毒载量变化. b. 1：肌肉，2：肠，3：心，4：肾，5：鳃，6：肝，7：脑. c. 对照组和治疗组稀有鮈鲫存活率. Fig. 3 　Suppression effect of quercetin (Qct) on proliferation of GCRV-JX02 in Gobiocypris rarusa. Electrophoresis of G. rarusa tissues in the control and treated groups. M: 2000 DNA marker; NC: healthy fish tissue; H: heart; I: intestine; Mu: muscle; G: gill; K: kidney; L: liver; B: brain; + indicates Qct treated group. b. Changes in viral load by tissue in rare minnow infected with GCRV-JX02; b. 1: muscle, 2: intestine, 3: heart, 4: kidney, 5: gill, 6: liver, 7: brain. c. Survival rate of G. rarus in the control and treated groups.

感染了GCRV的稀有鮈鲫组织病理学表现为全器官坏死和局部充血，取健康鱼及病鱼组织分别进行病理切片，结果如图4所示。与健康鱼相比，病鱼的肠道组织表现为肠绒毛膜从毛细血管壁分离，固有层充血；健康鱼的肌肉组织纵向排列整齐，可以清楚的看到横纹的结构，病鱼的肌肉组织肌纤维水肿甚至断裂^[10]；与健康鱼相比，病鱼的脾组织含铁血黄素沉积严重，并有局部出血的症状，红血球被严重破坏^[11]；正常鱼的肝细胞核位于中心位置，病鱼的肝组织出现细胞质空泡化、细胞变性坏死，肝细胞肿胀，肝窦减少；与对照组相比，病鱼的脑组织结构变得疏松，大量脑细胞坏死；正常鱼的鳃组织结构正常，鳃丝软骨细胞排列整齐，可见一级鳃瓣和二级鳃瓣，病鱼的鳃组织上皮细胞与毛细血管分离，鳃丝软骨细胞排列紊乱，次生板层大量弯曲变形；病鱼的肾脏组织中肾小管上皮细胞坏死脱落，肾小管扩张与周围组织之间有间隙、边界模糊，大量炎性细胞浸润，造血组织变得松散坏死^[12]；病鱼的心脏组织有明显心肌水肿及心肌溶解，心肌细胞肌纤维排列紊乱^[13]。被槲皮素治疗后的稀有鮈鲫组织充血减少，病变组织得到明显改善，说明槲皮素具有良好的治疗作用，除了抑制病毒复制外槲皮素在稀有鮈鲫中也展现出典型的炎症抑制效果。

槲皮素是一种植物源的膳食类黄酮，也是哺乳动物中已知的热休克因子1 (HSF-1)的转录抑制因子，它负责上调热休克蛋白在压力刺激下的转录激活^[14]。前期研究表明，GCRV感染过程中会诱导草鱼热休克蛋白Hsp70升高^[15]，促进GCRV的复制，而槲皮素可以抑制I型和III型GCRV在草鱼细胞系的复制^[4]。为了定量评估槲皮素在草鱼体内的抗病毒药效，本研究测定了槲皮素在草鱼细胞中拮抗病毒感染的半数有效抑制浓度EC₅₀为4.796 μg/mL，若鱼体组织药物浓度高于EC₅₀值，则药物能发挥治疗效果。

利用药代动力学能够有效地筛选和评价药物的药效，为临床制定合理的用药方案提供理论支持，确保临床用药的安全^[16]。了解不同剂量的槲皮素在不同组织部位的分布、吸收情况可以精准制定用药剂量和频率，更好地发挥药物抗病毒效果。口灌20~60 mg/kg的槲皮素粗提物后，槲皮素在草鱼组织中吸收迅速，消除快，尤其在GCRV的靶向感染组织中富集。槲皮素粗提物在不同组织中的含量由高到低依次为肝脏、肾脏、血液，这可能是由于肝胰脏作为主要的解毒器官，相比于其他组织吸收更快。药代动力学研究显示，20 mg/kg的剂量下血液中的C_max为0.129 μg/mL，肝胰脏中的C_max为3.822 μg/g，肾脏中的C_max为2.437 μg/g，结合体外抗病毒实验EC₅₀值为4.796 μg/mL，表明20 mg/kg槲皮素粗提物并不能有效抑制病毒复制。口灌40 mg/kg槲皮素粗提物后，血液、肝胰脏和肾脏中的C_max为0.583 μg/mL、5.386 μg/g和3.140 μg/g。该剂量下肝胰腺中药物含量可以达到体外抗病毒实验的EC₅₀，表明40 mg/kg的剂量下体内药物浓度可以达到一定的抗病毒效果。为了取得更好的临床效果，可以采取连续两次给药的方法。根据槲皮素微溶于水、肠道吸收差的特点，临床上可以采用拌饲投喂草鱼的给药方式。

图4

图4 　草鱼呼肠孤病毒GCRV-JX02感染的稀有鮈鲫病理切片分析1-8分别表示稀有鮈鲫的肠、肌肉、脾、肝、脑、鳃、肾和心脏，N为健康对照组，P为感染GCRV-JX02的实验组，Q为Qct治疗感染GCRV-JX02组. iv：肠绒毛脱落；mf：肌纤维水肿；he：含铁血黄素沉积；lh：局部出血；hs：肝窦；sh：肝细胞肿胀；ne：细胞坏死；v：空泡化；h：充血；gf：鳃丝软骨细胞；s：上皮细胞脱落；pl：原生板层；sl：次生板层；b：次生板层弯曲；nrt：肾小管上皮细胞坏死；lht：造血组织松动；me：心肌水肿；mc：心肌溶解. Fig. 4 　Pathological section analysis of Gobiocypris rarus infected by grass carp reovirus GCRV-JX021-8 refer to intestines, muscle, spleen, liver, brain, gills, kidney, and heart of rare minows, respectively. N is the healthy control group, P is the experimental group infected with GCRV-JX02, and Q is the group treated with Qct after GCRV-JX02 infection. iv: intestinal villi abscission; mf: muscle fiber edema; he: hemosiderin deposition; lh: local bleeding; hs: hepatic sinus; sh: swelling hepatocytes; ne: cell necrosis; v: cavitation; h: hyperemia; gf: gill filament chondrocyte; s: exfoliation of epithelial cells; pl: native board layer; sl: secondary lamella; b: secondary plate bending; nrt: necrosis of renal tubular epithelial cells; lht: hematopoietic loosening; me: myocardial edema; mc: cardiolysis.

尽管在自然条件下由GCRV导致的草鱼出血病对草鱼养殖行业危害很大，但在实验室环境下尚未找到具有明确遗传背景的无特定病原(specific pathogen free, SPF)的草鱼可供研究。稀有鮈鲫是我国特有的鲤科鮈鲫属的一种小型鱼类^[17]，其具有对环境耐受能力强、繁殖周期短等优点，被作为一种新的模式物种广泛应用于毒理学、胚胎学和生理生态学等领域^[18]。实验室感染的稀有鮈鲫可模拟了临床上由GCRV感染引起的草鱼出血病，具有明确遗传背景的稀有鮈鲫或被认为是阐明GCRV发病机制以及宿主抗GCRV反应的潜在模型^[19]。前期的研究中，本文作者已建立了II型GCRV感染稀有鮈鲫模型来评估槲皮素的抗病毒活性^[5]。为了更进一步评估槲皮素的炎症抑制效果，在本研究中作者对感染了II型GCRV的稀有鮈鲫的各个组织进行qRT-PCR检测和病理切片分析。qRT-PCR结果显示病毒感染成功，槲皮素可以有效降低病鱼各个组织病毒的复制，在心脏、肾组织中病毒抑制效果更明显。被GCRV- JX02感染后病毒载量最高的组织是脑，这一点可以解释临床上草鱼感染GCRV后出现反应迟钝、游动缓慢、孤僻不合群的现象。心脏组织是病毒载量被抑制最明显的组织，作者推测由于心脏是机体血液循环的动力中心，槲皮素经血液循环后在心脏脏中有所蓄积，因此槲皮素可能最先作用于心脏组织。组织病理切片结果显示被GXRV-JX02感染后稀有鮈鲫各个组织均有明显的出血症状，与临床上草鱼感染GCRV后全身性出血症状一致。肌肉和肠道的炎症病变程度最明显，肠道组织被大量炎症因子浸润，毛细血管充血扩张，这也与临床上感染GCRV后草鱼出现严重的肠炎症状符合。槲皮素治疗后的稀有鮈鲫各组织病变炎性症状明显减轻，显示槲皮素具有减轻机体炎症的作用，这表明槲皮素可作为抗炎药用于治疗GCRV引起的炎症反应，从而发挥抗病毒作用。其对心脏组织和肠道组织更好的作用效果为后续鉴定槲皮素的作用靶点及研究具体抗病毒机制提供了新的切入点。综上所述，本研究显示槲皮素对草鱼呼肠孤病毒的半数有效抑制浓度为4.796 μg/mL, 40 mg/kg或60 mg/kg的槲皮素处理组可以保障药物在鱼体组织内的抗病毒活性。槲皮素不但对GCRV感染有直接抑制效果，也可能通过抑制体内炎症反应，提高草鱼抗病力。本研究为槲皮素在临床上的应用提供了理论支持，为开发绿色、高效的抗GCRV药物提供了新的选择。