黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)隶属于硬骨鱼纲(Teleostei)，鲇形目(Siluriformes)，鮡科(Sisoridae)，原鮡属，又名藏鲇，主要分布于我国西藏的雅鲁藏布江流域及印度的印度河等，海拔分布范围为2800~4200 m^[1]。黑斑原鮡体表光滑无鳞，底栖，喜急流，具有极高的营养价值、药用价值和经济价值^[2]。近年来，因过度捕捞、水利工程开发、外来鱼类入侵等原因，黑斑原鮡的种群数量日益减少，资源衰竭严重，己被列为濒危物种，收录至《中国物种红色名录》^[3]。

研究证实，18种鮡科鱼类中，7种鮡科鱼类具有明显的副肝，另外11种不具有副肝^[4]。且这些鱼类的副肝具有形态特征、重量等差异以及随着分布海拔的升高逐渐增大的趋势。因此，副肝是鮡科鱼类适应高海拔、急流环境的过程中，随体形变化而形成的副肝叶^[5]。熊冬梅^[6]和张惠娟^[7]的研究表明，黑斑原鮡主、副肝脏在乳酸脱氢酶(LDH)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等代谢酶和蛋白酶、脂肪酶等消化功能方面不具有显著性差异，但在抗氧化功能基因表达方面具有显著性差异^[6-7]。目前，有关黑斑原鮡主副肝脏代谢差异分子机制的相关研究还尚未见报道。转录组测序技术(RNA-Seq)是通过高通量测序快速获取样本在某一状态下的转录本，以此来探索特异性状的控制基因和调控机制等的快速有效的方法，且在揭示鱼类生长发育、繁殖性状以及物质代谢分子调控机制等方面的应用越来越广泛^[8-9]。因此，本研究以黑斑原鮡主、副肝脏为研究对象，开展主、副肝脏显微结构比较、肝脏细胞线粒体数量差异分析以及转录组测序分析，获得主、副肝脏代谢差异的关键基因和信号通路，为揭示黑斑原鮡主、副肝脏代谢差异的分子调控机制奠定理论基础。

实验所用的黑斑原鮡采自雅鲁藏布江江段，平均体长(13.32±3.41) cm，平均体重为(58.16±26.65) g。

挑取个体大、体表无伤的黑斑原鮡放置于实验室的循环水养殖缸内暂养，养殖温度为11~12 ℃。

实验鱼用乙醚麻醉后，快速采集鱼体肝脏和副肝，体积大小约为0.5 cm×0.8 cm，将其置于Bouin’s液固定24 h后，70%乙醇洗涤脱色12 h。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，Leica RM2016型切片机连续切片(切向与身体长轴垂直)，厚度为5~6 μm，贴片、展片后HE染色，中性树胶封片。Leica DMI6000B电光学显微镜下观察，Leica软件测量并拍照。分别取3尾鱼的主肝、副肝于离心管中，−80 ℃冰箱暂存备用。

肝脏取材大小约0.1 cm× 0.1 cm，固定后于4 ℃冰箱保存。标本定位后用JEOL JMC-6000透射电子显微镜观察并拍照。

采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒提取肝脏线粒体蛋白。参照Bradford考马斯亮蓝法使用分光光度计对蛋白质进行定量检测。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测肝脏线粒体蛋白的组成。

利用RNA easy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)试剂盒提取每个个体总RNA，单个建池。采用Aglient 2100方法检测各RNA样品的纯度、浓度及完整性等。构建文库，应用ABI StepOnePlus Real-Time PCR和Agilent 2100分别对文库的浓度和插入片段大小(insert size)进行检测。基于边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)技术，利用Illumina Hi Seq 4000 (Illumina, America)平台进行高通量测序，测序读长为PE150。

测序数据去除接头及低质量数据后，利用Trinity软件将数据组装成转录本，进行转录注释及计算表达量。利用DESeq进行基因的差异表达分析，绘制差异表达基因火山图，并进行聚类分析。利用NR、NT、GO、KOG、KEGG、SwissPprot和InterPro数据库对Unigene进行功能注释。使用Bowtie2将clean reads比对到Unigene，然后使用RSEM计算各样品的基因表达水平。使用DEseq2方法进行差异基因检测，利用GO数据库对差异表达基因进行功能注释，采用COG (cluster of orthologous groups of proteins)对差异表达基因进行分类统计，运用KEGG数据库进行通路分析，FDR≤0.01的通路视为显著富集。

为验证RNA测序结果，选取6个与代谢相关的基因通过荧光实时定量PCR确定其在肝脏和副肝(各3尾样本)中的表达水平。选用glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogena xse (gapdh)作内参，计算mRNAs的相对表达量。检测重复3次，每次设3个复孔，3次重复测量的值变异系数小于5%被认为有效。引物设计见表1。

表1

表1 　黑斑原鮡主、副肝转录组测序信息 Tab. 1 　Transcriptome sequencing of liver and exo-celiac liver in Glyptosternum maculatum 样品sample name 总数据/MB total raw reads 过滤后数据/GB total clean bases ≥Q30/% GC含量/% GC content 比对数据mapped reads N50 Z1 70.63 6.55 92.71 45.29 2581655 1594 Z2 83.59 6.58 92.85 45.18 1794806 1763 Z3 82.65 6.50 92.19 45.28 2655425 1674 F1 93.22 6.59 92.73 44.85 2154646 1639 F2 88.46 6.60 92.18 45.24 1666353 1695 F3 91.12 6.69 92.80 45.01 2223181 1693 注： ≥Q30表示Clean Data质量不小于30的碱基所占的百分比. Note: ≥Q30 denotes the percentage of bases with Clean Data mass not less than 30.

表1 　黑斑原鮡主、副肝转录组测序信息 Tab. 1 　Transcriptome sequencing of liver and exo-celiac liver in Glyptosternum maculatum

如图1所示，黑斑原鮡的副肝位于其腹腔上部，肝脏由3部分组成，分别为主肝、副肝和连接带(图2)。黑斑原鮡的主、副肝脏表面均覆有一薄层浆膜，结缔组织不发达，肝小叶分界不明显(图2, 图3a~c)。肝小叶内肝细胞呈多边形，界限明显，细胞核位于中央，呈圆形或卵圆形(图3a~b, 图3a~c)。每个肝小叶有一个中央静脉，管壁较薄，管腔不规则，肝细胞以中央静脉为中心向外呈放射状排列。肝细胞较大，细胞核明显，紧密、无规则地排列(图3a, 图3a~d)。主、副肝脏组织中血管丰富，肝实质中可见伴行的小叶间动脉和小叶间静脉，在肝板之间分布有血窦(图3a, 3c)。其中，主肝组织中的血管分布数量较副肝更多。

图1

图1 　黑斑原鮡副肝外观图a. 副肝；b. 皮肤；c. 肌肉. Fig. 1 　Exo-celiac liver morphology photograph of Glyptosternum maculatuma. Exo-celiac liver; b. Skin; c. Muscle.

图2

图2 　黑斑原鮡副肝外形图a. 主肝；b. 连接带；c. 副肝. Fig. 2 　Morphology of exo-celiac liver of Glyptosternum maculatuma. Liver; b. Band; c. Exo-celiac liver.

图3

图3 　黑斑原鮡主肝与副肝组织结构a, c. 主肝；b, d. 副肝. CV：中央静脉；HC：肝细胞；HS：肝细胞索；ILV：小叶间静脉；ILA：小叶间动脉；N：细胞核. Fig. 3 　Histological structure of the liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatuma, c. Liver; b, d. Exo-celiac liver. CV: central vein; HC: hepatocyte; HS: hepatic cords; ILV: interlobular veins; ILA: interlobular artery; N: nuclear.

超显微观察结果显示，黑斑原鮡肝细胞形态不规则，呈多边形，核仁1或2个。其中，主肝细胞中内质网和糖原均较副肝中发达，粗面内质网呈片层状排列，其上有大量核糖体附着(图4a, d)。与主肝细胞相似，副肝细胞中线粒体数量众多，不同形状的线粒体成群分布，呈棒状、椭圆状等，线粒体内脊清晰可见，有时粗面内质网分布于线粒体间(图4d~f)。此外，主肝和副肝的肝细胞胞质内还分布有滑面内质网、溶酶体和脂滴(图4b~d)。主肝和副肝显微组织结构未见明显差异。

图4

图4 　黑斑原鮡主肝与副肝超微组织结构a-c. 主肝；d-f. 副肝. G：糖原；HC：肝细胞；he：核仁；LD：脂滴；M：线粒体；mb：溶酶体；N：细胞核；RER：粗面内质网；SER：滑面内质网. Fig. 4 　Ultrastructure of the liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatuma–c. Liver; d–f. Exo-celiac liver. G: glycogen; HC: hepatocyte; he: nucleolus; LD: lipid droplet; M: mitochondria; mb: lysosomes; N: nuclear; RER: rough endoplasmic reticulum; SER: smooth endoplasmic reticulum.

由图5可见，黑斑原鮡主、副肝脏细胞呈圆形或多边形，胞质内的线粒体染色为绿色，分布于整个胞质中。由黑斑原鮡主肝与副肝肝细胞线粒体蛋白质电泳图谱可知，主、副肝细胞线粒体的蛋白质种类较为丰富，线粒体蛋白谱带组成上未见有明显差异，共计有23条谱带。其中，分子量大于116 kD的蛋白有2种。主、副肝细胞线粒体蛋白的其他蛋白谱带的分子量范围主要集中在35~66.2 kD之间(图6)。

图5

图5 　黑斑原鮡主肝和副肝细胞线粒体活体染色图a, c. 主肝中肝细胞线粒体活体染色；b, d. 副肝中线粒体活体染色. 箭头所示为线粒体活体染色的肝细胞. Fig. 5 　Mitochondria stain of hepatocytes in liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatuma, c. Mitochondria stain of hepatocytesin in liver; b, d. Mitochondria stain of hepatocytesin in exo-celiac liver. Arrow shows mitochonclria strain of hepatocytes.

图6

图6 　黑斑原鮡主肝和副肝脏线粒体蛋白电泳图M：标准蛋白质Marker; 1. 主肝蛋白质电泳；2. 副肝蛋肝细胞白质电泳. Fig. 6 　Electrophoretogram of mitochondriaprotein in liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatumM: protein ladder; 1. Protein SDS-PAGE electrophoresis of liver; 2. Protein SDS-PAGE electrophoresis of exo-celiac liver.

本研究共构建12个组织的12个转录组文库。从表1中可以看出，本研究共获得39.51 GB的Clean Data，各样品Clean Data均达到6.50 GB。另外，各样品GC含量均不小于44.85%, ≥Q30 (Clean Data质量不小于30的碱基所占的百分比)全在92.18%以上，该结果表明测序质量可靠，构建文库可用于后续分析。数据组装后共获得138515条Unigene，其Unigene长度均≥814 b。

黑斑原鮡主、副肝脏差异表达基因共有77个，其中45个基因上调表达，32个基因下调表达(图7)。差异基因表达热图(图8)所示，黑斑原鮡主肝与副肝组织样品间的差异基因表达模式不同，相同样品间的低表达基因与高表达基因的表达趋势相同，表明差异基因之间的数量差异主要为组织差异。将比对得到的77个显著差异基因进行功能注释，20个差异基因在GO分类中有功能意义。上述3个功能被区分为更具体的26个类别，分别包括了13、11和2个功能亚分类。由图9可知，在生物功能的组分中，主、副肝间的差异表达基因在代谢过程(metabolic process, GO: 0004419)、细胞过程(cell process, GO: 0003857)、细胞(cell, GO: 0032968)、细胞部分(cell part, GO: 0008277)与催化活性(catalytic activity, GO: GO:0006680)中数目比例最大(图7)。差异表达基因进行KEGG通路分析显示差异表达基因共富集到68条信号通路中。以P<0.05作为差异表达基因在该通路显著富集的标准，共鉴定出15个通路显著富集：包括丁酸盐代谢通路(butanoate metabolism)、过氧物酶体(peroxisome)、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解(valine, leucine and isoleucine degradation)、赖氨酸降解(lysine degradation)、色氨酸代谢(tryptophan metabolism)以及代谢途径(metabolic pathways)等信号通路。其中，与转运和分解代谢(transport and catabolism)相关基因7个，信号转导6个(signal transduction)，氨基酸代谢(amino acid metabolism) 10个，脂肪代谢(lipid metabolism) 6个(图10, 图11)。筛选出Paaf、Hmgcl、Usp1、Jak1等基因参与脂肪代谢、氨基酸代谢以及代谢途径。

图7

图7 　黑斑原鮡主肝与副肝差异基因图x轴代表主、副肝样品数量，y轴代表差异基因表达量. Fig. 7 　DEGs number between liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatumThe x-axis represents the sample number of liver and exo-celiac liver, y-axis represents the different gene expression.

图8

图8 　黑斑原鮡主肝与副肝差异基因表达热图 Fig. 8 　DEGs phaetmap for liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatum

图9

图9 　黑斑原鮡主肝与副肝间差异基因的GO注释 Fig. 9 　Annotation categories of liver and exo-celiac liver DEGs in Glyptosternum maculatum mapped to GO database

图10

图10 　黑斑原鮡主肝与副肝差异表达基因显著富集的KEGG注释 Fig. 10 　Annotation categories of liver and exo-celiac liver DEGs in Glyptosternum maculatum mapped to KEGG database

图11

图11 　黑斑原鮡主肝与副肝差异基因的显著富集信号通路KEGG Fig. 11 　Significantly enriched signaling pathway KEGG of DEGs between liver and exo-celiac liver in Glyptosternum maculatum

转录组分析结果显示，Hmgcl、Rapgef3、Tbxas1、Cask、Dnm1l、Sumf1、Hdac1_2等基因具有组织表达差异性，仅在副肝中表达(表2)。其中，副肝内Tbxas1和Dnm1l基因的相对表达量具有显著性差异(P<0.05)。而Jak1、Ptk2b、Glxk等基因仅在主肝内表达，其中Ptk2b具有显著性表达差异(P<0.05)。

表2

表2 　转录组测序分析黑斑原鮡主肝、副肝中差异表达基因(DEGs)的表达量 Tab. 2 　The mRNA expression of DEGs in liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatum by transcriptomic analysis 基因 gene 基因ID gene ID 主肝 liver 副肝 exo-celiac liver Hmgcl CL13316.Contig1_All 0.00±0.00a 1.17±0.51b Rapgef3 CL2171.Contig1_All 0.00±0.00 0.35±0.19 Tbxas1 CL9566.Contig4_All 0.00±0.00a 2.45±1.25b Cask CL147.Contig1_All 0.00±0.00 0.44±0.21 Dnm1l CL7342.Contig2_All 0.00±0.00a 0.71±0.23b Sumf1 CL10094.Contig7_All 0.00±0.00 3.10±2.83 Hdac1_2 CL6237.Contig5_All 0.00±0.00 0.69±0.29 Jak1 CL5657.Contig9_All 0.43±0.24 0.00±0.00 Ptk2b CL4736.Contig3_All 0.24±0.06a 0.00±0.00b Glxk Unigene26224_All 0.65±0.16 0.00±0.00 注： 同行不同字母标注表示差异显著(P<0.05). Note: Different lowercase letters marked after the data in the same line indicate difference significance (P<0.05).

表2 　转录组测序分析黑斑原鮡主肝、副肝中差异表达基因(DEGs)的表达量 Tab. 2 　The mRNA expression of DEGs in liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatum by transcriptomic analysis

对黑斑原鮡主、副肝脏4个差异表达基因进行实时定量PCR检测。如图12所示，4个基因实时定量PCR检测的mRNA表达趋势与转录组RNA-seq结果基本一致，表明测序结果可靠。实时定量PCR检测结果表明，与主肝相比，副肝内Paaf基因的表达量显著高于主肝内Paaf基因的表达量(P<0.05)，而副肝Gba基因的相对表达量则显著低于主肝内Gba基因的相对表达量(P< 0.05) (图13)。

图12

图12 　黑斑原鮡主副肝脏4个差异表达基因的qRT-PCR与RNA-seq表达分析 Fig. 12 　Comparation of differentially expressed genes between liver and exo-celiac liver of Glyptosternum maculatum by qRT-PCR and RNA-seq

图13

图13 　黑斑原鮡主、副肝脏差异表达基因的相对表达量 Fig. 13 　Relative expression of DEGs between liver and exo-celiac liver in Glyptosternum maculatum

肝脏作为鱼体内最大的消化腺，是其机体的消化代谢中心，承担代谢、解毒、分泌蛋白质等多种功能^[10]。目前，已报道的部分鮡科鱼类以及尖齿胡鲶等鲇形目鱼类中具有以连接带连结的腹腔外肝脏^[6,11]。谢从新等^[6]和曹天玲等^[11]通过比较研究将鱼类这种腹腔外肝脏定义为副肝。人体解剖学中，将小块肝组织生长在胆囊表面或胸腔内，不与肝脏相连者叫做副肝，而将与肝脏连结，且本身叶数增多者称为副肝叶^[11-12]。与谢从新等^[6]的研究结果一致，本研究中黑斑原鮡的主、副肝脏在重量与形态特征上具有显著差异，而在显微结构和超显微结构上均无明显差异。此外，其主、副肝脏细胞中线粒体数量及线粒体蛋白质组成也无显著差异。

目前，转录组测序技术广泛地应用于鱼类组织的差异分析，在鲤(Cyprinus carpio)肌肉、虾虎鱼(Gobiopterus lacustris)性腺、圆口铜鱼(Coreius guichenoti)肝脏，以及红白锦鲤(C. carpio)皮肤等多种鱼类组织上都有应用^[13-16]。圆口铜鱼亲本与子代肝脏转录组特征分析表明，丙酸盐代谢、丙酮酸代谢、原核生物固碳途径、乙醛和二羧酸代谢、脂肪酸代谢、萜类骨架生物合成是圆口铜鱼亲本与子代肝脏KEGG差异表达基因的核心代谢途径。本研究的转录组测序结果表明，黑斑原鮡主、副肝脏差异基因主要富集在丁酸盐代谢通路，过氧物酶体，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，赖氨酸降解，色氨酸代谢以及代谢途径等信号通路中。其中，涉及的主要代谢通路为脂肪代谢和氨基酸代谢通路。肝脏是脂肪代谢和脂肪酸β-氧化的主要场所，长链脂肪酸在肝脏细胞中的氧化不完全，氧化的产物乙酰辅酶A既可以直接进入三羧酸循环进一步分解，也可以转变成酮体以提高其在肝外组织中的利用率。肝脏中产生酮体的速度与肝组织利用酮体的速度相关^[17]。差异基因表达分析表明，黑斑原鮡Hmgcl、Tbxas1、Dnm1l等基因仅在副肝中具有表达量，且差异显著。而Jak1、Ptk2b、Glxk等基因仅在主肝内表达，表明黑斑原鮡主、副肝脏在酮体能量代谢、线粒体功能维持等方面具有明显差异。Hmgcl作为肝脏酮体生成途径关键限速酶基因之一，在机体能量代谢、维持机体内稳态、调控生理和病理代谢等方面具有重要的作用^[18]。本研究中，副肝中3种酮体生成相关酶基因Hmgcl、Acaa2、Bdh1显著高于主肝(P<0.05)，而2种酮体分解途径相关酶基因Acaa2、Bdh1则无显著性差异，表明黑斑原鮡副肝的酮体生成能力高于主肝，而酮体的分解能力与主肝无显著性差异^[19]。

研究证实，Gba基因编码葡萄糖脑苷脂酶(GCase)，是一种可溶性的糖酯类物质，广泛存在于细胞溶酶体内，参与糖蛋白的回收利用^[15-16]。该酶的减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能正常分解成神经酰胺和葡萄糖，造成葡萄糖脑苷脂在各器官中大量沉积，从而引起组织细胞大量增殖^[20-21]。本研究中，黑斑原鮡主肝中Gba基因显著高于副肝(P<0.05)，且主肝细胞中内质网和糖原数量均较副肝中发达，表明主肝中葡萄糖的合成代谢能力高于副肝。此外，主肝细胞内的糖原数量显著高于副肝脏细胞内的糖原数量，其原因可能与主肝Gba基因的表达量更高有关^[15]。Dnmll编码线粒体动态相关蛋白1 (DNMlL)，介导细胞的线粒体分裂，参与细胞凋亡及多种疾病，是线粒体自噬发生的必要条件^[22]。研究表明，DNMlL通过促进细胞线粒体分裂、降低线粒体融合速率，导致线粒体自噬过度，引起细胞损伤和死亡^[20-23]。本研究中，Dnmll仅在副肝中表达，表明黑斑原鮡副肝细胞的线粒体分裂动态调控较为活跃^[24-25]。