2022, Vol. 29 
2. 浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州 313001
3. 通威股份动物保健研究所，四川 成都 610041
2. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China
3. Animal Health Research Institute, Tongwei Co., Ltd., Chengdu 610041, China
大口黑鲈(Micropterus salmoides)又称加州鲈，隶属于鲈形目(Perciformes)，太阳鱼科(Cehtrachidae)，黑鲈属。其适温范围广、生长迅速、耐低氧、抗病能力强，且肉质鲜美，是一种名贵的肉食性鱼类。大口黑鲈原产于美国加利福尼亚州的密西西比河流域，于1983年引进我国广东佛山，在1985年人工繁殖成功后被广泛养殖，取得较好的经济效益。2019年全国大口黑鲈养殖总产量高达47.8万t[1-2]。但随着我国大口黑鲈养殖越来越普遍，产量越来越高，其病害也越来越严重，造成了重大的经济损失。目前报道的导致大口黑鲈病害的主要病原包括：诺卡氏菌(Nocardia)、柱状黄杆菌 (Flavobacterium columnare) 等细菌病原，虹彩病毒(Iridoviridae)和弹状病毒(Rhabdoviridae)等病毒病原，车轮虫(Trichodina)、杯体虫(Apiosoma blanchard)和小瓜虫(Ichthyophthirius)等寄生虫病原[3]。
大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)。虹彩病毒科包括5个属：蛙病毒属、淋巴囊肿 病毒属(Lymphocystivirus)、细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)、虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)。蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属和细胞肿大病毒属病毒感染脊椎动物，虹彩病毒属和绿虹彩病毒属感染无脊椎动物[4]。1991年首次在美国佛罗里达州Lake Weir患病大口黑鲈体内发现LMBV病毒，随后几年在美国20多个州相继发现，并传播到欧洲[4]。大口黑鲈蛙病毒2008年首次在我国广东发现，命名为大口黑鲈溃疡综合征病毒(largemouth bass ulcerative syndrome virus, LBUSV); 2018年浙江省也发生严重流行，许峰等分离鉴定到LMBV病毒宁波株。患病大口黑鲈表现出体表溃烂、肝脏肿大发白等临床症状[5-6]。目前对蛙病毒属病毒已建立多种检测方法。马冬梅等[7-8]建立了病毒PCR快速检测方法和TaqMan荧光定量PCR检测方法，同时对病毒主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因重组蛋白的免疫效果进行初步分析。王庆等[9]建立了大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法，可同时检测两种感染大口黑鲈的虹彩病毒科病毒：蛙病毒属虹彩病毒和肿大细胞病毒属虹彩病毒。
本研究从湖北黄陂某鲈鱼养殖场采集患病的大口黑鲈样本，采用细胞培养、透射电子显微镜观察、分子生物学检测及生物信息学分析等方法，分离得到一株新的大口黑鲈蛙病毒，经鉴定其为虹彩病毒科蛙病毒属成员，命名为大口黑鲈蛙病毒湖北分离株(LMBRaV-HB001)，为进一步研究加州鲈疾病的防控技术奠定了前期基础。
1 材料与方法 1.1 病毒、细胞和实验鱼患病加州鲈采集自湖北黄陂某养殖场。鳜脑组织细胞系(mandarin fish brain, MFB)和异育银鲫脑组织细胞系(gibel carp brain, GiCB)由本实验室建立；鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼卵巢组织细胞系(grass carp ovary, GCO)细胞由本实验室保存；大鲵肌肉细胞系(giant salamander muscle, GSM)由中国科学院水生生物研究所张奇亚教授惠赠。感染试验用健康大口黑鲈购自湖北省洪湖市某鲈鱼养殖场，体长约10 cm，感染试验用鱼在实验室暂养14 d，按参考文献[7]中的PCR检测方法进行检测，结果为LMBV阴性。
1.2 试剂细胞培养基L-15、M199购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司；0.25%胰酶溶液购自杭州吉诺生物医药技术公司；磷酸缓冲液(PBS)购自Hyclone公司；病毒DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；DNA标准DL 2000 Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa，中国)。
1.3 寄生虫检查与细菌分离取患病鲈体表黏液和鳃丝在光学显微镜下观察，检查寄生虫。无菌条件下取患病鲈鱼肝脏、肾脏等组织划线接种于BHI固体培养基，28 ℃恒温培养，观察细菌生长情况。
1.4 病毒的分离与培养无菌条件下取患病鲈鱼肝脏、脾脏和肾脏等组织，研磨后，用磷酸缓冲液(PBS)制成1∶10 (V组织∶VPBS)的组织匀浆液，反复冻融3次后，4 ℃ 4000 r/min离心30 min，用孔径0.22 μm的滤膜过滤，上清即为组织毒悬液。取500 μL组织毒悬液接种于MFB细胞，28 ℃培养中孵育1 h后，加入2% FBS的L-15培养基，置于28 ℃培养箱中培养，逐日观察细胞形态，同时设未接组织毒悬液的细胞作为对照组。至发现实验组细胞出现80%细胞病变后，将细胞培养物收于−80 ℃冰箱反复冻融3次，4 ℃ 4000 r/min 离心30 min收集细胞毒悬液。将收集的细胞毒悬液按上述方法接种MFB细胞连续传代培养7代，同时收集第7代(P7)病毒悬液进行PCR检测。同时将P7病毒悬液接种EPC、GCO、GSM和GiCB细胞，观察细胞状态。
1.5 电镜样品制备收集病鱼脾肾组织和上述P7细胞毒悬液感染后病变的MFB细胞，加入2.5%戊二醛固定，4 ℃固定过夜。经1%锇酸固定和50%~100%乙醇梯度脱水后使用环氧树脂包埋样品。使用超薄切片机将样品切成50~80 nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后晾干，将样品置于透射电子显微镜(日立H7650)下观察、拍照。
1.6 病毒分子检测按照Omega病毒DNA提取试剂盒说明书提取患病鱼肝脏、脾脏、肾脏病毒DNA和细胞培养病毒DNA。按照已报道的LMBV检测方法[7]合成PCR检测引物，TF: 5′-TCTGT TACGGGTTCTGG CATC-3′; TR: CCAGCCAAGAGTTGAGCACAT。以提取的患病鱼组织病毒和细胞培养病毒DNA为模板进行PCR扩增，扩增的反应总体系为25 μL: 10×PCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL, rTaq DNA聚合酶0.25 μL, DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL, ddH2O 17.25 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s; 65 ℃退火30 s, 72 ℃延伸20 min，共35个循环；72 ℃再延伸7 min。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因。阴性对照为健康大口黑鲈脾脏DNA。
1.7 MCP基因开放阅读框区全长扩增和氨基酸序列比对参考GenBank中已发表的LMBV病毒MCP基因序列设计特异引物扩增MCP基因ORF区全长[10]，引物序列如下：LMBV-F, 5′-CTGGATCC AGCAACACACTTC-3′; LMBV-R, 5′-CATATCGC AGTTTGCGATATGG-3′。以提取的患病鱼组织病毒和细胞培养病毒DNA为模板，PCR扩增MCP基因的ORF区及上下游部分序列，扩增的反应总体系为25 μL: 10×PCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL, rTaq DNA聚合酶0.25 μL, DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL, ddH2O 17.25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 S; 58 ℃退火30 S, 72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并将PCR产物送至武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序，通过NCBI数据库的BLAST检索系统进行同源性分析，然后选取与获得序列相似的参考毒株的氨基酸序列，使用Clustal Omega在线软件对分离株LMBRaV-HB001的MCP氨基酸序列与其他蛙病毒的MCP氨基酸序列进行多重序列比对，最后使用MEGA7.0采用邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树。
1.8 人工感染试验将在MFB细胞中传代至第9代的细胞毒悬液稀释到106.5 TCID50/mL后进行人工回归感染试验。试验设置试验组和对照组，每组30尾健康大口黑鲈。试验组每尾大口黑鲈腹腔注射200 μL病毒液，对照组大口黑鲈每尾注射200 μL杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)，实验期间水温控制在28 ℃，逐日观察试验鱼的发病情况并统计死亡率。
1.9 病毒滴度测定采用微孔板法测定病毒滴度，使用胰酶将细胞消化后，接种于96孔板中(Corning, USA)，将细胞数调整到约1×105~2×105个/mL，每孔加100 μL。待细胞长至单层后，将病毒液10倍稀释后分别加到96孔板中，每孔加100 μL，每个稀释度接8孔。同时设置正常细胞对照，28 ℃培养，逐日观察细胞病变情况，7 d后记录病变孔数，使用Reed- Muench法计算病毒的半致死感染剂量(TCID50)[11]。
2 结果与分析 2.1 临床症状自然发病水温为26~29 ℃，患病大口黑鲈临床症状主要表现为腹部和下颌点状出血，肛门红肿，肝脏发白，脾脏肿大(图1)，部分病鱼有体表溃烂和螺旋游动症状。取病鱼肝脏、肾脏等组织，在BHI固体培养基上进行细菌培养，未培养出细菌。黏液和鳃丝中也未检出寄生虫。
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图1 自然发病大口黑鲈症状a. 发病鲈体表外观；b. 发病鲈解剖图. Fig. 1 Clinic symptom of naturally infected Micropterus salmoidesa. Surface appearance of diseased M. salmoides; b. Anatomy of diseased M. salmoides. |
超微过滤后的病鱼组织匀浆液接种MFB细胞24 h后，细胞开始变圆、脱落，出现典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，继续培养12 h后可观察到因细胞死亡脱落形成的空洞(图2)。被感染的MFB细胞在48 h内全部收缩呈球状，脱离细胞培瓶壁。病毒在MFB细胞中连续传代10次，滴度达到108.36±0.15 TCID50/mL。
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图2 病鱼组织匀浆液接种鳜脑细胞系(MFB)细胞引起的细胞病变效应(CPE)a. 正常细胞；b. 接毒12 h的细胞. Fig. 2 Cytopathic effect (CPE) of mandarin fish brain (MFB) cells infected with tissue homogenate filtrate of diseased Micropterus salmoidesa. Normal MFB cells; b. CPE of MFB cells 12 hours post-infection. |
对病毒感染的MFB细胞进行超薄切片和透射电镜观察，发现细胞质中存在大量正六边形，直径150 nm左右的病毒颗粒，病毒颗粒呈晶格状排列，并且可见具有衣壳和核心的成熟病毒颗粒(黑色箭头)和正在装配仅有衣壳的未成熟病毒颗粒(白色箭头)。细胞核出现核物质边缘化(图3)。
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图3 大口黑鲈蛙病毒(LMBRaV)湖北株LMBRaV-HB001病毒感染鳜脑组织细胞的透射电镜观察a. 细胞质中晶格状排列的病毒颗粒；b. a中白色方框区域放大；黑色箭头：成熟病毒颗粒；白色箭头：未成熟病毒颗粒；N：细胞核. Fig. 3 Transmission electron micrographs of Micropterus salmoides brain cells infected with LMBRaV-HB001a. Pseudocrystalline array of virus particles in the cytoplasm; b. Higher magnification of white box in figure a. Black arrow indicates mature virus particle. White arrow indicates immature virus particle. N: nucleus. |
将细胞培养病毒进行人工回归感染健康大口黑鲈，攻毒后的鱼与自然发病鱼表现相似症状，出现下颌点状出血、肛门红肿、肝脏发白等症状，少量出现螺旋游动症状。在攻毒后的第2天开始死亡，第3天开始大量死亡，7 d死亡率达到100% (图4)。对照组鲈表现正常，无死亡。
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图4 人工感染大口黑鲈累计死亡率 Fig. 4 Cumulative mortality of experimentally infected Micropterus salmoides |
按照已报道的LMBV检测方法对自然患病鲈肝脏、脾脏和肾脏以及病毒感染的MFB细胞样品(第7代感染细胞样品)进行PCR检测，结果显示3种组织样品以及细胞感染样品均能扩增出241 bp的单一阳性条带，阴性对照无特异性条带扩增(图5)。
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图5 自然患病鲈组织样品和病毒感染细胞样品的LMBRaV-HB001 PCR检测M: DL2000 DNA marker; 1-3：自然患病鲈肝脏、脾脏和肾脏样品；4：病毒感染细胞样品；5：阴性对照. Fig. 5 PCR detection of LMBRaV-HB001 from naturally infected largemouth bass tissues and virus infected cellM: DL2000 DNA marker; 1-3: liver, spleen and kidney of naturally infected largemouth bass; 4: virus infected cell; 5: negative control. |
根据GenBank中已发表的LMBV病毒MCP基因序列设计特异引物LMBV-F/R，对病毒DNA进行扩增，获得1392 bp的MCP基因ORF区全长序列(图6)。分离株LMBRaV-HB001的MCP氨基酸序列与其他感染鱼类的蛙病毒MCP氨基酸序列比对结果显示，与鳜蛙病毒(mandarin fish ranavirus, MFRV)、Santee-Cooper蛙病毒(santee- cooper ranavirus, SCRV)、孔雀鱼病毒6型(guppy virus, GV-6)及大口黑鲈溃疡综合征病毒(largemouth bass ulcerative syndrome virus, LBUSV)的MCP氨基酸同源性最高，一致性均达100% (表1)。系统进化结果表明，本研究分离得到的病毒与感染鱼类的蛙病毒聚为一支，进一步证明该分离株属于虹彩病毒科，蛙病毒属(图7)。
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图6 LMBRaV-HB001毒株MCP基因ORF序列及预测的氨基酸序列阴影部分为起始密码子；星号(*)标记的为终止密码子；小写部分为非编码区. Fig. 6 DNA sequence and predicted amino acid sequence of LMBRaV-HB001 strain MCP gene ORFShaded region indicates initiation codon. Asterisk indicates termination codon. Lowercase indicates noncoding region. |
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图7 LMBRaV-HB001株与其他鱼类蛙病毒分离株基于MCP氨基酸序列的系统进化树分析 Fig. 7 Phylogenetic relationship of LMBRaV-HB001 strain with other fish ranavirus based on MCP amino acid sequence |
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表1 LMBRaV-HB001毒株MCP氨基酸序列与其他鱼类蛙病毒的同源性比较 Tab. 1 Homology comparison of MCP amino acid sequence between LMBRaV-HB001 strain and other fish ranavirus |
P7代细胞毒接种EPC、GCO、GSM和GiCB细胞，接种后12 h均能产生典型的CPE，细胞变圆，脱落，形成空洞(图8)。接毒后第3天收集上清和细胞进行病毒滴度分析，上述细胞中的病毒滴度分别达到1011.73±0.9、1011.68±0.32、1011.15±1.2、108.27±0.11 TCID50/mL。
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图8 细胞培养病毒接种EPC、GCO、GSM和GiCB细胞引起的细胞病变效应(CPE)a. 正常EPC细胞；b. 接毒12 h的EPC细胞；c. 正常GCO细胞；d. 接毒12 h的GCO细胞；e：正常GSM细胞；f：接毒12 h的GSM细胞；g：正常GiCB细胞；h：接毒12 h的GiCB细胞. Fig. 8 Cytopathic effect (CPE) of EPC, GCO, GSM and GiCB cells infected with cell cultured virusa. Normal EPC cells; b. EPC cells at 12 hours post-infection; c. Normal GCO cells; d. GCO cells at 12 hours post-infection; e. Normal GSM cells; f. GSM cells at 12 hours post-infection; g. Normal GiCB cells; h. GiCB cells at 12 hours post-infection. |
虹彩病毒科蛙病毒属病毒主要感染两栖类和爬行类动物，近年来发现也感染鱼类，如流行性造血器官坏死病毒(epizootic hematopoietic necrosis virus, EHNV)、石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus, SGIV)和Santee-Cooper蛙病毒(SCRV)[12]。SCRV病毒包括3种：大口黑鲈病毒(LMBV)、医生鱼病毒(DFV)和孔雀鱼病毒6型(GV-6)[13]。LMBV是引起大口黑鲈大规模死亡的重要病原。LMBV病毒于1991年首次在美国佛罗里达州Lake Weir患病野生大口黑鲈体内发现，随后几年在美国20多个州相继发现并传播到欧洲[5]。2008年我国广东佛山首次发现大口黑鲈溃疡病暴发，病鱼体内发现大量病毒颗粒，经鉴定为蛙病毒，命名为大口黑鲈溃疡综合征病毒(LBUSV)，其MCP氨基酸序列与国外报道的DFV和LMBV病毒MCP氨基酸序列同源性分别为100%和98%[14]。2020年许峰等[5]从江苏患病大口黑鲈中分离一株LMBV病毒宁波株，与国外报道的LMBV病毒以及LBUSV病毒MCP氨基酸序列同源性均为99.13%。2020年Zhao等[12]从我国南方发病的大口黑鲈中发现了一株LMBV病毒新分离株，该毒株的MCP氨基酸序列出现3个突变。虽然我国发现LMBV感染大口黑鲈较晚，然而近几年该病发病严重，且缺乏有效防治方法，已成为我国养殖大口黑鲈的主要制约因素。
本研究中患病鲈的临床症状和先前报道的LMBV病毒感染大口黑鲈的症状非常相似，呈现体表出血、溃疡，肝脾肿大等特征[4,12]，而且电镜观察到的病毒粒子大小、形态等特征也和蛙病毒类似，病毒粒子直径150 nm左右，形状为正六边形，在细胞质中呈现晶格排列[15]。为确定病毒的分类地位，作者进一步进行了病毒保守基因的序列分析。MCP基因既具有病毒分类所需要的保守区域，又具有区分不同种病毒的可变区，仅用MCP基因的序列来区分虹彩病毒不同分离株之间的亲缘关系，虽然依据还不够充分，但其仍适合作为研究病毒进化的靶基因[16]。通过氨基酸序列比对发现LMBRaV-HB001的MCP氨基酸序列与SCRV、GV-6及LBUSV病毒MCP氨基酸序列的同源性达到100%，并且进化树分析结果显示本LMBRaV-HB001毒株与感染鱼类的蛙病毒聚为一支，证明造成湖北省大口黑鲈大规模死亡的毒株为虹彩病毒科蛙病毒属成员。由于病毒的全基因组序列尚不清楚，无法确定此次发现的大口黑鲈蛙病毒和之前广东发现的LBUSV是否为同一个病毒，因此暂命名为大口黑鲈蛙病毒湖北分离株LMBRaV-HB001以示区别。此前，LMBV病毒引起的大口黑鲈死亡主要在南方地区(如广东省)暴发，近年来陆续发现在中部省份(江苏省和湖北省)暴发，说明该病毒在我国的传播越来越广，应当尽快进行大规模流行病学调查，开展有关病毒致病机理和防控措施的研究。
虽然LMBV病毒已发现20年，但目前大口黑鲈的细胞系还较少。2014年Getchell等[17]建立了大口黑鲈性腺细胞系(largemouth bass gonad, LMBG)，接种LMBV后病毒滴度能达到108.45 TCID50/mL，比Deng等[6]接种EPC细胞的滴度(1010.82 TCID50/ mL)低很多。因此，建立及筛选LMBV敏感的细胞系是一个亟待解决的问题。本研究中LMBRaV-HB001接种EPC、GCO、GSM和GiCB细胞系均能产生典型CPE，病毒滴度能达到1011.73±0.9、1011.68±0.32、1011.15±1.2、108.27±0.11 TCID50/mL。说明4种细胞均对LMBRaV病毒高度敏感。
本研究首次从湖北省患病大口黑鲈体内分离到一株病毒，病毒形态为直径150 nm左右的正六边形，分类地位属于虹彩病毒科蛙病毒属，命名为大口黑鲈蛙病毒湖北分离株(LMBRaV-HB001)。并且查明EPC、GCO和GSM等多种细胞对该病毒敏感。
| [1] |
Fisheries Bureau of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs PRC, National Fisheries Technology Extension Center, China Society of Fisheries. China Fishery Statistical Yearbook[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 2020. [农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会. 中国渔业统计年鉴2020[M]. 北京：中国农业出版社，2020.]
|
| [2] |
Deng G C, Bai J J, Li C J, et al. Common diseases in pond culture of largemouth bass and their control[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2011, 38(18): 102-103. [邓国成，白俊杰，李胜杰，等. 大口黑鲈池塘养殖常见病害及其防治[J]. 广东农业科学，2011, 38(18): 102-103.]
|
| [3] |
Xia Y C, Cao Z, Lin L Y, et al. Research progress on main diseases of largemouth bass (Micropterus salmoides)[J]. China Animal Health Inspection, 2018, 35(9): 72-76. [夏焱春，曹铮，蔺凌云，等. 大口黑鲈主要病害研究进展[J]. 中国动物检疫，2018, 35(9): 72-76.]
|
| [4] |
Wang Q, Li K B, Zeng W W, et al. Progress on viral disease caused by largemouth bass ranavirus[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2011, 32(2): 73-76. [王庆，李凯彬，曾伟伟，等. 大口黑鲈虹彩病毒病研究进展[J]. 动物医学进展，2011, 32(2): 73-76.]
|
| [5] |
Xu F, Lu J F, Wei Y W, et al. Characterization of an iridovirus isolate from largemouth bass Micropterus salmoides[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2020, 51(1): 156-162. [许峰，鲁建飞，魏永伟，等. 一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定[J]. 海洋与湖沼，2020, 51(1): 156-162.]
|
| [6] |
Deng G C, Li S J, Xie J, et al. Characterization of a ranavirus isolated from cultured largemouth bass (Micropterus salmoides) in China[J]. Aquaculture, 2011, 312(1-4): 198-204.
|
| [7] |
Ma D M, Bai J J, Deng G C, et al. Sequence analysis of MCP gene from largemouth bass ulcerative syndrome virus and rapid detection by PCR assay[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2010, 17(6): 1149-1156. [马冬梅，白俊杰，邓国成，等. 大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立[J]. 中国水产科学，2010, 17(6): 1149-1156.]
|
| [8] |
Ma D M, Deng G C, Bai J J, et al. Prokaryotic expression of MCP gene from largemouth bass ulcerative syndrome virus and the immune effect analysis of recombinant protein[J]. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(8): 139-144. [马冬梅，邓国成，白俊杰，等. 大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因的原核表达及重组蛋白的免疫效果初步分析[J]. 生物技术通报，2016, 32(8): 139-144.]
|
| [9] |
Wang Q, Zeng W W, Liu C, et al. A duplex PCR for detection of iridescent virus from largemouth bass, Micropterus salmoides[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2013, 32(4): 106-110. [王庆，曾伟伟，刘春，等. 大口黑鲈虹彩病毒双重PCR检测方法的建立[J]. 华中农业大学学报，2013, 32(4): 106-110.]
|
| [10] |
Ohlemeyer S, Holopainen R, Tapiovaara H, et al. Major capsid protein gene sequence analysis of the Santee-Cooper ranaviruses DFV, GV6, and LMBV[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2011, 96(3): 195-207.
|
| [11] |
Ma J, Zhou Y, Fan Y D, et al. The physical-chemical and biological characteristics of Cyprinid herpesvirus 2 and its ultrastructural morphogenesis in vitro[J]. Journal of Fisheries of China, 2016, 40(3): 475-483. [马杰，周勇，范玉顶，等. 鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生[J]. 水产学报，2016, 40(3): 475-483.]
|
| [12] |
Zhao R X, Geng Y, Qin Z Y, et al. A new Ranavirus of the Santee-Cooper group invades largemouth bass (Micropterus salmoides) culture in southwest China[J]. Aquaculture, 2020, 526: 735363.
|
| [13] |
Jancovich J K, Steckler N K, Waltzek T B. Ranaviruses: Lethal Pathogens of Ectothermic Vertebrates[M]. New York: Springer, 2015: 59-70.
|
| [14] |
Deng G C, Xie J, Li S J, et al. Isolation and preliminary identification of the pathogen from largemouth bass ulcerative syndrome[J]. Journal of Fisheries of China, 2009, 33(5): 871- 877. [邓国成，谢骏，李胜杰，等. 大口黑鲈病毒性溃疡病病原的分离和鉴定[J]. 水产学报，2009, 33(5): 871-877.]
|
| [15] |
Williams T. The iridoviruses[J]. Advances in Virus Research, 1996, 46: 345-412.
|
| [16] |
Tidona C A, Schnitzler P, Kehm R, et al. Is the major capsid protein of iridoviruses a suitable target for the study of viral evolution?[J]. Virus Genes, 1998, 16(1): 59-66.
|
| [17] |
Getchell R G, Groocock G H, Cornwell E R, et al. Development and characterization of a largemouth bass cell line[J]. Journal of Aquatic Animal Health, 2014, 26(3): 194-201.
|