2022, Vol. 29 
许多鱼类具有性别二态性以及生长速度和体型的性别二态性[1]。由于单性养殖可提高效益，因此性别控制育种技术在水产养殖中应用潜力巨大，如日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)[2]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[3]、南方大口鲇(Silurus meridionalis)[4]和鳜(Siniperca chuatsi)[5]等鱼类雌性比雄性生长快，全雌化养殖有助于提高其养殖产量；相反，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[6]、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[7]、斑鳢(Channa argus)[8]和兰州鲇(Silurus lanzhouensis)[9]等，雄鱼比雌鱼生长快，全雄化养殖可提高效益。目前已在部分养殖鱼类实现了单性苗种培育，并显著提高了养殖效益，性别控制育种能促进水产养殖的发展。
金钱鱼(Scatophagus argus)俗名金鼓，隶属鲈形目(Perciformes)、刺尾鱼亚目(Acanthuroidei)、金钱鱼科(Scatophagidae)、金钱鱼属。金钱鱼是一种中小型鱼类，最大个体体重可达1 kg。金钱鱼广泛分布在印度-太平洋水域，在我国主要分布于东南沿海，市场价格高，属于名贵鱼类[10-11]。金钱鱼具有较强的环境适应能力和抗逆性，养殖成本低，可单养也可混养，具有广阔的市场需求[12-14]。据不完全统计，目前金钱鱼在我国广东、广西和台湾等地的养殖总产值每年可达1.5亿元(人民币)[15]
金钱鱼性成熟周期较短，具有明显雌雄生长差异，野生条件下雄鱼最快1龄性成熟，雌鱼一般2龄性成熟。鉴于金钱鱼的经济价值，国内外围绕其繁殖生物学开展了大量研究，其人工繁殖技术已成功[11,15-23]。但目前金钱鱼遗传育种进展相对缓慢，鲜有报道。金钱鱼人工养殖条件下，1龄雌鱼体重比雄鱼高30%左右，2龄雌鱼体重则高于雄鱼100%以上[16]，全雌化养殖可明显提高养殖效率，但尚未见金钱鱼全雌苗种培育报道。鱼类性别具有可塑性，以XY性别决定系统鱼类为例，可诱导XX个体逆转为伪雄鱼，将XX伪雄鱼与正常XX雌鱼交配可获得全雌后代；另一方面，可诱导XY个体逆转为伪雌鱼，将XY伪雌鱼与XY正常雄鱼交配，获得YY超雄鱼，YY超雄鱼与正常XX雌鱼交配可获得全雄后代[1]。遗传性别快速鉴定是鱼类性别控制育种关键技术之一。传统鱼类性别控制育种通过测交等手段来判断亲本基因型，耗时耗力，而基于性别特异或连锁的分子标记，可快速准确地鉴定遗传性别，省时省力[1]。2018年Mustapha等[24]报道了两对金钱鱼性别特异的分子标记，证明金钱鱼具有XX-XY性别决定系统。其中一对标记是位于Dmrt3基因SNP标记，需通过Sanger测序基因分型，测序成本高且耗时；另一对标记仅能扩增Y染色体Dmrt1基因特异序列，Dmrt1在雌鱼不存在，所以该标记为非共显性标记，不能有效区分XY和YY个体(Dmrt1- Marker-1)(图1)[24]。本研究基于金钱鱼雌雄基因组数据，比较性别决定候选基因Dmrt1与其等位基因Dmrt1b序列，根据以往的研究结果[25-27]，通过进行二者的序列差异设计、筛选性别特异引物，以建立1种快速鉴定金钱鱼遗传性别的方法，旨在为金钱鱼性别控制育种提供可靠的性别标记。
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图1 金钱鱼Y染色体和X染色体上Dmrt1/Dmrt1b基因结构示意图及4对性别特异标记的位置[25] Fig. 1 Schematic representation of the Dmrt1/Dmrt1b gene structures on the Y and X chromosomes of spotted scat (Scatophagus argus), showing the location of 4 pairs of sex-specific markers[25] |
本实验所用金钱鱼养殖于广东海洋大学海洋生物研究基地。另从我国南海沿岸(广西北海，广东湛江、珠海)购买213尾野生金钱鱼成鱼(体重150~300 g)，用于检验性别特异性引物的通用性。
1.2 金钱鱼生理性别鉴定采用100 mg/L的MS-222麻醉金钱鱼后立即解剖。剪取部分性腺置于波恩氏液中，室温固定24 h，石蜡包埋，切片厚度5 μm，苏木精-伊红染色，光学显微镜(Nikon，日本)拍照，鉴定金钱鱼表型性别。
1.3 基因组DNA提取剪取金钱鱼部分尾鳍，采用柱式法提取高纯度基因组DNA (N1173，东盛生物科技有限公司，中国)，按照试剂盒说明书操作，将基因组DNA浓度调整至50 ng/μL用于PCR扩增。该试剂盒蛋白酶K消化3 h左右，再加上分离纯化等操作，约需5 h完成。但该试剂盒提取的DNA纯度高，片段长，易于PCR扩增。无特殊说明，本研究使用的DNA样品由此试剂盒提取。此外，还采用斑马鱼(Danio rerio)直接PCR试剂盒(TP-0141T，成都福际生物技术有限公司，中国)快速提取基因组DNA。首先，剪取10 mg左右金钱鱼尾鳍，剪碎后，加入100 μL裂解液和4 μL蛋白酶K, 65 ℃孵育10~30 min，然后95 ℃ 5 min变性蛋白酶K，离心5 min，取上清即可进行PCR扩增。该试剂盒操作简便快捷，30~60 min可完成提取，但提取的DNA片段较短，小于1000 bp。
1.4 性别特异引物设计基于雌雄金钱鱼基因组序列比较分析，表明Dmrt1只存在于雄鱼中，是金钱鱼性别决定候选基因，其等位基因Dmrt1b存在于雌雄鱼，可根据二者的序列差异，开发性别特异分子标记[24-25]。Dmrt1b位于4号染色体(X染色体) 25.3 Mb附近，目前尚未测定Y染色体全序列，Dmrt1在Y染色体位置尚不清楚[26]。Dmrt1外显子1~4与相应的Dmrt1b同源序列相似度分别为79.9%、90.7%、75.8%和84.1%, Dmt1b不存在Dmrt1外显子5的同源序列[25]。通过本地Blast (NCBI-blast-2.2.27)，从金钱鱼基因组中获取Dmrt1和Dmrt1b基因序列，然后利用DNASTAR软件(http://www.dnastar.com) MegAlign程序进行序列多重比对，根据比对结果，利用Premier 6软件设计3对新的标记引物(Dmrt1-Marker-2-F2/R2、Dmrt1-Marker-3-F3/R3和Dmrt1-Marker-4-F4/R4) (表1, 图1)，引物由上海生工生物工程公司合成。
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表1 本研究所用到的引物 Tab. 1 Primers used in the present study |
采用3雌3雄金钱鱼验证新设计的性别特异引物。用 2×PCR MIX (P2011，广州东盛生物科技有限公司，中国)进行 PCR 扩增。PCR反应程序：94 ℃变性 3 min; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 37个循环；最后72 ℃ 扩增10 min。PCR产物经20 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon 2500R凝胶成像系统(天根，上海)拍照。PCR产物纯化后与pEASY-T3载体(CT301-01，北京全式金生物技术有限公司，中国)连接，连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，序列采用Lasergene v 7.1.0软件比对分析。同时，采用以Mustapha等开发的SNP标记(Dmrt3-Marker)和Dmrt1-Marker-1检测实验鱼的遗传性别[24]。Dmrt3-Marker扩增产物送上海生工生物工程公司测序，通过SNP鉴定遗传性别。Dmrt1-Marker-1扩增片段较长，与上述扩增条件略有不同，详见Jiang等[26]。
1.6 不同地理群体金钱鱼遗传性别鉴定为评估新开发的性别特异引物的准确性和通用性，选取3个不同地理群体的213尾金钱鱼进行验证，PCR方法同
2019年7月人工繁殖一批金钱鱼鱼苗，经水泥池培育过冬养至全长5~7 cm, 2020年3月转移至广东省湛江市东南码头网箱养殖，半年后随机选择400~500尾，记录体长和体重，并剪取部分尾鳍，取样之后正常养殖，不再切片鉴定表型性别。采用斑马鱼直接PCR试剂盒提取鳍条基因组DNA，利用新的性别特异分子标记鉴定其遗传性别。生长数据采用平均值±标准差 (means±SD)表示，并采用SPSS 18.0进行独立样本T检验，显著性水平为P=0.05。
2 结果与分析 2.1 新性别特异标记筛选用于筛选新性别特异标记的3雌3雄金钱鱼表型性别由性腺组织学切片鉴定，遗传性别由Mustapha等[24]开发的SNP标记和Dmrt1-Marker-1鉴定，结果表明6尾鱼表型性别与遗传性别吻合(图2, 图3)。对新设计的3对位于Dmrt1/Dmr1b的性别特异标记引物进行验证，结果显示，Dmrt1- Marker-2仅在XY个体扩增出单一条带，通过亚克隆测序显示长度为1064 bp，为Y染色体特异片段。Dmrt1-Marker-3在XX个体扩增出单一条带，为1117 bp X染色体片段，在XY个体扩增出两条带，分别为1117 bp X和1003 bp Y染色体片段(图3)。Dmrt1-Marker-4在XX个体扩增出一条带，长度为593 bp，为X染色体特异片段，在XY个体扩增出两条带，分别为693 bp X染色体和593 bp Y染色体片段(图3)。Dmrt1-Marker-4扩增的X染色体特异序列相对于Y染色体序列有较多缺失(图4)。
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图2 性腺组织学鉴定金钱鱼表型性别 Fig. 2 Phenotype sex identification of spotted scat (Scatophagus argus) by histological observation |
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图3 性别特异分子标记鉴定金钱鱼遗传性别M: DNA Marker; ♀：雌性；♂：雄性；-：阴性对照. Fig. 3 Genetic sex identification of the of the spotted scat (Scatophagus argus) by sex-specific markersM: DNA Marker; ♀: Female; ♂: Male; -: negative control. |
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图4 性别特异标记Dmrt1-Marker-4-F/R扩增的金钱鱼基因组DNA片段序列比对图黑色和灰色背景分别表示保守和变异碱基. Fig. 4 Sequence alignments of spotted scat (Scatophagus argus) genomic DNA, amplified with specific primers for Dmrt1-Marker-4-F/RBlack ang gray background indicate conserved and different nucleotide, respectively. |
Dmrt1-Marker-3和-4可同时区分XX、XY和YY个体，均为共显性标记，但Dmrt1-Marker-3扩增的X和Y染色片段较长，大于1000 bp，对基因组DNA模板质量要求较高。Dmrt1-Marker-4扩增的X和Y染色片段较短，无需片段较长的基因组模板，且较短时间电泳可鉴定遗传性别，更符合快速鉴定金钱鱼遗传性别的要求。Dmrt1-Marker-4标记鉴定3个不同地理群体金钱鱼的遗传性别，结果显示，所有雌鱼中只扩增出593 bp的单一条带，所有雄鱼扩增出593/693 bp的双条带(图5)。同时，Dmrt3-Marker和Dmrt1-Marker-4鉴定结果一致(表2)，两对标记鉴定的遗传性别与表型性别100%吻合，表明Dmrt1-Marker-4在不同群体中也具有稳定性和通用性，可广泛用于金钱鱼遗传性别鉴定。
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图5 Dmrt1-Marker-4检测3个不同群体金钱鱼遗传性别M: DNA Marker; -：阴性对照. Fig. 5 Genetic sex identification of spotted scat (Scatophagus argus) from three populations using specific primers for Dmrt1-Marker-4M: DNA Marker; -: negative control. |
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表2 3个不同群体金钱鱼成鱼的遗传性别鉴定 Tab. 2 Genetic sex identification of spotted scat (Scatophagus argus) from 3 populations |
经典的柱式法提取DNA速度较快、质量好，但提取相对费时费力。由于Dmrt1-Marker-4标记扩增的片段小于1000 bp，如仅鉴定金钱鱼遗传性别，无需大量纯度高、片段长的基因组DNA模板，可采用快速DNA提取试剂盒提取少量非纯化的DNA模板，从而节约时间和成本。Dmrt1-Marker-4引物分别扩增柱式法和斑马鱼直接PCR试剂盒法提取基因组DNA，二者扩增效果相似，均可很好地鉴定遗传性别(图6)。结果表明片段较短的基因组DNA模板也可用于Dmrt1-Marker-4鉴定金钱鱼的遗传性别。
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图6 柱式法和斑马鱼直接PCR试剂盒法提取DNA用于金钱鱼遗传性别鉴定效果比较 Fig. 6 Comparison of sex genotyping effects of the DNA extracted from spotted scat (Scatophagus argus) by column method and zebra fish (Danio rerio) direct PCR kit. |
采用斑马鱼直接PCR试剂盒提取基因组DNA，并应用性别特异标记Dmrt1-Marker-4筛选到了网箱养殖1龄的XX雌鱼202尾，XY雄鱼255尾，雌雄比例为0.79∶1。XX雌鱼体长9.2~15.1 cm，平均12.2 cm，体重51.8~180.5 g，平均107.8 g。XY雄鱼体长8.7~13.1 cm，平均11.3 cm，体重30.8~156.6 g，平均84.7 g。XX体长和体重都显著高于XY个体(P<0.05)，其中XX平均体重比XY高27.3%(图7)。
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图7 网箱养殖1龄金钱鱼雌雄生长比较不同小写字母表示雌雄鱼之间存在显著差异(P<0.05). 雌鱼202尾，雄鱼255尾，$\bar{x}\pm \text{SD}$. Fig. 7 Comparing of the growth performance of one year old spotted scat (Scatophagus argus) cultured in net cageDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) among female and male fish. Female 202 inds, and male 255 inds,$\bar{x}\pm \text{SD}$. |
鱼类生长是水产养殖关注的重要经济性状之一。许多经济鱼类存在生长性别二态性现象，雌雄间的生长速率和个体大小差异很大，因此生产全雄或全雌苗种可显著提高养殖效益。遗传性别控制育种技术是一种高效的性别控制手段。准确鉴定遗传性别是遗传性别控制技术的重要基础之一，性别特异或连锁的分子标记是遗传性别鉴定的重要手段。本研究开发了金钱鱼性别特异的共显性标记，且建立了通过PCR快速鉴定遗传性别的方法，可为金钱鱼性别控制育种提供重要基础。
性别控制是水产养殖的重要技术，与之相关的性别决定与分化分子机制研究也是一个被普遍关注的基础生物学问题[28-29]。鱼类性别决定与分化研究是鱼类遗传学和育种学研究的热点。近年来，鱼类性别特异分子标记的开发报道迅猛增加。早期鱼类性别特异分子标记的开发以传统的RFLP、RAPD和AFLP和SSR等手段为主[1]。近年来，基因组测序技术广泛应用在水产动物性别连锁分子标记开发中。如利用简化基因组测序，在尼罗罗非鱼[30]、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)[31]、白鲢(H. molitrix)[31]和斑鳢[32]等鱼类中筛选到性别连锁分子标记。简化基因组测序法无需参考基因组，单样测序成本低，但一般需要样本数较多，且最好能培育家系材料并构建连锁图谱定位性别决定区间。利用全基因组重测序，在大黄鱼(Larimichthys crocea)[33]、南方大口鲇[4]、鳜[5]和奥利亚罗非鱼(O. aureus)[34]中找到了性别连锁分子标记。全基因组重测序法最好具有染色体水平的基因组作为基础，测序成本与测序深度和样品数相关，重测序深度和样品数要根据分析策略调整，重测序不仅可开发性别特异标记，还可研究性染色体序列分化。基于高通量测序寻找性别分子标记的方法在普适性和重复性方面有优势。性别连锁的分子标记可为定位和鉴定性别决定基因提供重要基础，同时性别决定基因也是最好的性别特异分子标记。与哺乳类和鸟类不同，鱼类的性别决定基因多种多样[35]。在部分鱼类，性别决定基因还具一定保守性，例如，5种青鳉属鱼类(Oryzias)的性别决定基因都为Dmy[36]。最近，发现金鲳(Trachinotus ovatus)具有与同科的高体鰤(Seriola dumerili)相同的性别决定区域，它们的性别决定区域都包含Hsd17b1基因[37-38]。因此，利用近缘种已知的性别决定基因或性别决定候选基因开发性别特异分子标记是一种高效方法。此外，直接验证性别决定与分化通路中关键基因是否与性别连锁，也是一种快速开发性别特异分子标记高效策略。例如，在黄姑鱼(Nibea albiflora)中，研究人员证实Dmrt1与雄性性别紧密连锁[39]。性腺转录组数据也可提供性别决定与分化相关基因信息，金钱鱼性别特异的分子标记就是基于性腺转录组获得的Dmrt3和Dmrt1的异常转录本信息，从而开发的性别特异分子标记[24, 40]。随着测序技术和生物信息学分析方法的发展，鱼类性别特异分子标记的开发将更加便捷。
雄性特异Dmrt1是金钱鱼性别决定候选基因，预期可在该基因区域开发性别特异分子标记。本研究证实在Dmrt1基因区域可开发性别特异分子标记，这些标记再次证实金钱鱼具有XX/XY性别决定系统，与Mustapha等[24]结果一致。与Mustapha等[24]报道的SNP标记相比，本研究开发的性别特异标记不用PCR产物测序，最快可在3 h内完成金钱鱼遗传性别鉴定，可节约时间和成本(图8)，该标记可为金钱鱼分子标记辅助育种提供技术支撑，也为金钱鱼性别决定基因功能、性染色体进化等研究奠定基础。
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图8 金钱鱼遗传性别快速鉴定流程 Fig. 8 Flow chat of rapid identification of genetic sex of spotted scat (Scatophagus argus) |
最新研究表明雌激素处理能够诱导金钱鱼XY个体性别逆转为雌鱼，但雄激素和芳香化酶抑制却不能诱导XX个体逆转为雄鱼[41]。XX个体不能逆转，可能是由于XX个体缺乏Dmrt1导致。在日本青鳉(O. Latipes)[42]、斑马鱼[43]和尼罗罗非鱼[44]突变Dmrt1都会导致由雄向雌的性别逆转，表明Dmrt1是鱼类雄性性别分化通路必需基因。金钱鱼XX雌鱼缺乏雄性必需的Dmrt1，所以不能诱导培育XX伪雄鱼，这是金钱鱼全雌化苗种培育的新瓶颈，亟待突破。本研究中1龄金钱鱼雌鱼比雄鱼生长快27.3%，这与蔡泽平等[16]报道的人工养殖条件下1龄金钱鱼雌鱼生长速度比雄鱼快30%左右的结果基本一致，细微差异可能是由于饲养条件不同造成。同一批次的金钱鱼中，也有部分雄鱼生长较快，表明存在通过选择育种提升雄鱼生长速率的空间。此外，雄鱼具有性腺指数较小的优势，如XY雌鱼可育，将来或可开展金钱鱼全雄苗种培育。培育快速生长全雄苗种可能是未来金钱鱼育种的方向。
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