2022, Vol. 29 
小RNA(microRNA, miRNA)是真核生物中小分子非编码RNA, 长度为21~25 nt, 主要存在于基因组的非编码区。miRNA能够通过碱基互补配对与靶mRNA的3′UTR特异性结合, 使靶mRNA进行降解或抑制靶mRNA的翻译, 从而调控靶基因的表达, 进而影响生物的生理功能[1-2]。在鱼类的研究中, miRNAs对生长发育和繁殖、糖脂的代谢、组织再生、免疫等都有着重要的作用[3-4]。在牙鲆(Paralichthys olivaceus)的变态阶段, 一些miRNAs呈高度表达, 表明它们可能是该阶段所必须的miRNAs[5]。Hang等[6]在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的研究中发现, miR-1、miR-206、miR-133a可能介导骨骼肌的增殖和分化。miR-21位于染色体17q23.2区域与编码液泡膜蛋白(Transmembrane Protein 19, TMEM19)的基因重叠, 在脊椎动物中高度保守[7]。miR-21在生长发育等多种生物学功能中起到至关重要的作用[8], 目前关于其功能的研究主要聚焦于其对肿瘤细胞的增殖作用。Chu等[9]在鳜(Siniperca chuatsi)肌肉鉴定了33个表达高丰度的miRNA, miR-21就属于其中之一, 但miR-21在鳜的表达特征及其对肌肉的调控功能尚不明确。
生物按照昼夜周期性进行活动现象称为生物节律或生物钟, 生物钟是自然进化过程中自然选择的作用下, 机体为了适应环境而获得的, 它使机体生理、行为呈现24 h的节律, 且受到光照、温度、饮食等外界因子影响。人类和一切生物几乎都受到生物节律的控制与影响。在哺乳动物中, 在动物的肝脏存在一个昼夜代谢组, 它受昼夜节律时钟本身的转录机制控制[10]。自昼夜节律的分子调控机制发现以来, 严格的转录调控和转录后调控被认为是校正昼夜节律的重要组成部分。miRNAs作为一类具有重要调控作用的非编码单链小分子RNA, 其作用类似于分子控制开关, 参与基因转录后的调控, 对生物节律的调控也发挥着重要的作用。Yang等[11]在果蝇(Drosophila)的研究表明, 对于某些蛋白水平的日常变化受到miRNAs介导的转录后调节。miRNAs是昼夜节律计时过程的关键调节因子, 其中miR-219和miR-132还能影响细胞的兴奋性, 从而调节时钟周期性[12]。Nagel等[13]发现miR-192和miR-194能够有效调节节律基因Period, 其外源性过度表达导致昼夜节律周期变化。Kojima等[14]在小鼠(Mus musculus)的研究中发现, miR-122能够调节Nocturnin的表达来参与小鼠肝脏近日节律的调节。Wu等[15]的研究发现, 在金鱼(Carassius auratus)肌肉中检测出miR-16、miR-23a、miR-29等15种miRNA的表达表现出昼夜节律性。目前关于miRNAs在鳜及其他鱼类的节律性调控的研究还较少, 因此, miRNAs在鱼类节律性方面的具体功能还尚未明确。miR-21在鳜中是否存在昼夜节律性表达以及是否参与的节律性调控也尚未知。
鳜又名桂花鱼, 是我国东南部地区的主要淡水鱼之一。鳜肉质丰腴细腻, 味道鲜美可口, 营养丰富, 无小刺, 深受人们的喜爱, 是市场中紧俏的水产品之一[16]。对于鱼类miRNA的研究表明, miRNA对鱼类的发育、生理功能以及疾病防御等方面都发挥着重要的作用。本研究对miR-21在鳜胚胎发育不同阶段和不同组织的表达谱进行了分析, 并对miR-21的节律性表达及饥饿对其表达的影响进行初步探究, 为后续研究其生物学功能以及利用调控生物节律提高养殖鱼类生长奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料繁殖用鳜亲鱼来自湖南省水产科学研究所鳜原种场, 基因组织表达谱及节律性表达研究实验用鱼来自实验室长期合作的鳜养殖基地。
1.2 实验方法 1.2.1 鳜不同发育阶段胚胎的收集鳜的人工繁殖与胚胎孵化技术参照刘希良等[17]的方法。待胚胎发育至2细胞、32细胞、囊胚早期、囊胚晚期、原肠胚早期、原肠胚晚期、神经胚期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心搏期、出膜期, 分别取30~40枚胚胎保存于装有1 mL Trizol的离心管中, 然后用液氮快速冷冻, 最后保存于–80 ℃超低温冰箱内。
1.2.2 鳜短期饥饿处理及组织样品的收集挑选健康无病、体重相近的鳜114尾, 体重(145±12) g。所有鳜采用12 h光照, 12 h黑暗的LD光制进行30 d的驯养实验。随机挑选6尾鳜, 在冰上分别取其心、肝、脾、肠、肾、红肌、白肌, 后保存于–80 ℃超低温冰箱备用。将剩余的108尾鱼随机分为正常投喂组和饥饿组, 每组54尾鱼。正常投喂组的采样时间在一昼夜的9个时间点, 每隔3 h采集一次, 具有的取样时间和对应区时与刘晶洁等[18]实验设计一致。每个时间点随机挑选6尾鱼, 分别取适量背部白肌组织, 用液氮快速冷冻, 随后保存于–80 ℃超低温冰箱内备用。短期饥饿组鳜经饥饿5 d处理, 处理方式参照刘晶洁等[18]实验方法, 采样时间点安排及方法与正常投喂组一致。
1.2.3 RNA提取及cDNA合成胚胎样品和组织样品的总RNA使用Trizol法提取(RNAiso Plus, 宝日医生物, 中国), 再用超微量分光光度计(NanoPhotometer-NP80, implen, 德国)结合琼脂糖凝胶电泳测定提取RNA的浓度和纯度。cDNA合成使用One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit (Perfect Real Time)试剂盒。反应总体系为20 μL。Poly(A)加尾反应与cDNA合成反应同步进行, 1 h内即可完成miRNA 1 st Strand cDNA合成。反应条件：37 ℃, 60 min (Poly(A)加尾和反转录反应); 85 ℃, 5 s (酶的失活反应)。
1.2.4 引物设计与合成根据本实验室已有鳜miRNA数据库[9]序列设计miR-21荧光定量PCR的引物, 以RPL13基因作为荧光定量的内参基因[9,19]。引物利用Primer 5.0 软件进行设计(表1), 设计好的引物序列由铂尚生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.5 荧光定量PCR在荧光定量PCR仪上进行反应, 反应总体系为12.5 μL, 包括SYBR Premix Ex TaqTM II 6 μL, 反转录合成的cDNA模板 1 μL, 无酶水4.5 μL, 上游引物和下游引物各 0.5 μL。反应按94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性5 s, 60 ℃退火, 20 s延伸, 反应39个循环。每组反应3个技术重复。
1.2.6 数据处理荧光定量PCR结果利用2–ΔΔCt法计算目的基因在不同样本之间的相对表达量[20]。相对表达量数值经SPSS 19.0软件进行单因素方差分析与显著性检验, 基因相对表达量表示为平均值±标准误(mean ± SE), 当显著性P<0.05认为两组数据之间差异显著[21]。
miR-21在鳜肌肉的一昼夜的表达数值在进行显著性分析后, 采用MATLAB软件对定量数据进行拟合方程式为f(t)=M+A cos (t/pi/12–φ)的余弦函数。方程字母分别代表：给定时间内基因表达水平f(t); 平均值M; 时间t; 振荡振幅A; 峰值相位φ, φ是最高振幅所在的时间点所换算出的角度。当每个时间点数值显著性差异P<0.05, MATLAB输出P<0.3时, 则表示该基因具有昼夜节律性[18,22]。
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表1 荧光定量引物 Tab. 1 The Primers for RT-qPCR |
miR-21在鳜胚胎不同发育阶段的表达见图1。miR-21的表达在胚胎发育早期处于较高水平, 随着胚胎不断发育, 在2细胞期至原肠胚期的表达逐渐降低, 在原肠胚早期仅能检测到少量的miR- 21表达。miR-21的表达在原肠胚期后开始上升, 并在神经胚期达到较高水平, 但除尾芽期和心搏期外, 神经胚后其余各阶段表达量无显著性差异。
2.2 miR-21在鳜不同组织中的表达分析miR-21在鳜不同组织中的表达见图2。miR-21在检测的所有组织中都有表达, 表明miR-21在鳜中无组织特异性表达。在鳜的心脏、肠、红肌组织中具有较高水平的表达, 在肝脏、肾脏、白肌中的表达水平相对较低且无显著性差异。
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图1 鳜胚胎不同发育阶段miR-21相对表达丰度不同字母表示不同发育阶段之间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 1 Relative expression of miR-21 in different embryonic stages of Siniperca chuatsiValues with the same letters indicated there was no significant difference at different developmental stages (P<0.05). |
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图2 miR-21在鳜不同组织中的相对表达丰度不同字母表示不同组织之间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 2 Relative expression of miR-21 in different tissues of Siniperca chuatsiValues with the same letters indicated there was no significant difference in different tissues (P<0.05). |
miR-21在鳜白肌组织一昼夜的表达见图3。在正常投喂下, miR-21的表达具有昼夜节律性(P=0.12, 表2), 其表达趋势为光周期降低, 暗周期升高, 呈现出昼低夜高的节律性振荡, 其中miR-21的表达到达峰值相位的时间为ZT 1.55 (图3A)。
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图3 正常投喂（A）和饥饿5 d后（B）鳜白肌中miR-21的表达不同字母表示两组数据之间存在显著差异性; X轴中0~12为光照阶段, 12~24为黑暗阶段. Fig. 3 Expression of miR-21 in Siniperca chuatsi muscle with normal feeding (A) and fasting for 5 d (B)Different letters indicate significant differences between each time point (P<0.05); in the X axis, 0–12 is the illumination stage, and 12–24 is the dark stage. |
饥饿5 d后, miR-21的表达仍具有节律性(P= 0.04), 但其表达趋势为光周期升高, 暗周期降低。峰值相位时间为ZT 7.43, 相比于正常情况下右移(延缓) 5.88 h, 且振幅和中值均减小(图3B)。这一结果说明在饥饿胁迫下miR-21在鳜白肌组织中的表达呈现适应性节律表达。
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表2 鳜miR-21表达的节律性参数 Tab. 2 Rhythmic parameters of miR-21 expression in Siniperca chuatsi |
通过鳜的基因组和转录组数据库获得核心生物钟基因Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator Like 2 (Arntl2)、Arntl1、Circadian Locomoter Output Cycles Protein Kaput a (Clocka)、Clockb、Cryptochrome Circadian Regulator 1Ab (Cry1Ab)、Cry2、Neuronal PAS Domain Protein 2 (Npas2)、Nuclear Receptor Subfamily 1 Group D Member 1 (Nr1d1)、Nr1d2b、Period Circadian Regulator 2 (Per2)、Per3、RAR Related Orphan Receptor A (Rora)、Timeless Circadian Regulator (Timeless)和cryptochrome DASH (Cry-dash) mRNA的3′UTR序列, 然后根据miRNA种子序列的靶向互补原则进行配对比较。结果发现在鳜Arntl2 mRNA的3′UTR序列有miR-21结合的靶位点(图4)。进一步利用荧光定量PCR检测Arntl2在正常投喂以及饥饿5 d鳜白肌的表达, 结果发现Arntl2表达模式呈现光周期降低, 暗周期升高, 其表达在正常投喂时的表达不具有昼夜节律性(表3, 图5A)。而饥饿5 d后Arntl2的表达具有昼夜节律性, 趋势与饥饿5 d后miR-21的表达相反(表3, 图5B)。因此, 推测在鳜中miR-21可能通过靶向调控Arntl2基因的表达, 从而影响鳜饥饿状态下白肌生长或生理功能的节律性。
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图4 miR-21靶向Arntl2 mRNA 3‰′ UTR位点预测 Fig. 4 Prediction of 3′UTR site of Arntl2 mRNA targeted by miR-21 |
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表3 鳜Arntl2表达的节律性参数 Tab. 3 Rhythmic parameters of Arntl2 expression in Siniperca chuatsi |
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图5 正常投喂（A）和饥饿5 d后（B）鳜白肌中Arntl2的表达不同字母表示两组数据之间存在显著差异性; X轴中0~12为光照阶段, 12~24为黑暗阶段. Fig. 5 Expression of Arntl2 in Siniperca chuatsi muscle with normal feeding (A) and fasting for 5 days (B)Different letters indicate significant differences between each time point (P<0.05); in the X axis, 0–12 is the illumination stage, and 12–24 is the dark stage. |
miRNAs在哺乳动物生殖细胞、胚胎发育及早期胚胎发育均起到一定的调节作用[23]。多项研究表明, miRNAs对动物胚胎发育过程中有着不可忽视的作用。在小鼠(Mus musculus)胚胎发育过程中, miRNAs的转录与降解处于动态平衡, 并且调控胚胎发育阶段的miRNAs的表达大量增加, 而不参与调控胚胎发育阶段的miRNAs表达则减少[24,25]。有研究发现, miR-430在斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、鳕(Eleginus gracilis)胚胎发育的囊胚期呈高表达水平, 能够促进母源mRNA脱腺苷化和母源mRNA的清除[26-29]。Liu等[29]在斑马鱼中发现, miR-206在其母源基因与合子基因均有表达, 并在原肠胚形成过程中对控制细胞运动起至关重要的作用。本研究检测分析miR-21在鳜胚胎的2细胞期、32细胞期、囊胚早期、囊胚晚期、原肠胚早期、原肠胚晚期、神经胚期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、血液循环期、出膜期等12个发育阶段的表达情况。结果表明, miR-21的表达在胚胎不同发育阶段具有显著差异性, 在2细胞时期的表达水平在胚胎发育过程中最高, 说明miR-21具有母源性, 并在胚胎早期发挥抑制靶基因的功能。随着胚胎的发育进程, 母源性产物逐渐消耗, miR-21在原肠胚期降至最低水平, 而神经胚期后miR-21的表达水平有一个显著上升的过程, 表明miR-21可能对鳜神经胚期的器官形成等过程有一定的调节功能。
有研究表明, miR-21普遍表达于哺乳动物的心、脾、小肠、结肠等组织器官中[30]。本研究检测分析了鳜心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、红肌、白肌等组织器官中miR-21的表达水平。结果显示, miR-21在鳜不同组织中均有表达, 其中在心脏组织呈高水平表达。Tu等[31]和Cheng等[32]研究表明, miR-21表达上调能够介导靶基因PTEN和PDCD4从而对心肌细胞发挥保护作用。本研究中, 鳜心脏内miR-21表达水平较高, 所以我们推测miR-21对鳜的心肌细胞的生长发育也有着类似的作用。此外miR-21在肠和红肌组织中也有较高水平表达, 表明miR-21在该类组织中也存在着重要调控作用, 但其具体参与的调控功能需要进一步研究。
刘佩[33]在鳜(Siniperca chuatsi)红肌和白肌组织中发现miR-21具有高水平表达, 但其在鳜中具体的功能暂不明确。本研究采用荧光定量PCR检测正常投喂组24 h内鳜白肌中miR-21的表达, 发现miR-21在鳜白肌的表达具有昼夜节律性, 表达趋势为光周期降低、暗周期升高, 可能参与鳜的生物节律。为进一步了解miR-21在鳜中的生理功能, 我们对miR-21的靶基因进行预测分析, 结果发现在鳜Arntl2 mRNA的3′UTR序列有miR-21结合的靶位点。Anrtl2是一种转录因子, 能够参与生物体的昼夜节律。Arntl2蛋白包括bHLH、PAS1、PAS2和PAC四个保守结构域[34]。bHLH家族蛋白在神经系统和肌肉的发育过程中起到重要的作用[35]。以此预测miR-21可能通过调控昼夜节律基因Arntl2的表达, 从而调控鳜肌肉的发育过程, 进而影响鳜的生长和发育。饥饿是鱼类在自然水域生态系统中经常面临的一种生理胁迫现象, 是影响鱼类生长发育和生存的重要环境因素[36]。鱼受饥饿胁迫时, 会引发一系列的生理反应用于应对饥饿, 体内基因的表达也必然受到影响。饥饿还可以影响鱼的代谢、行为、组织结构、繁殖、酶活性等生理行为活动[37]。本研究通过检测饥饿5 d后的鳜体内miR-21的表达量, 发现饥饿后, 鳜白肌中miR-21仍具有节律性, 但其表达量下降, 表达周期后移, 说明在饥饿后, 鳜体内原有的节律性已经受到影响而发生变化。汪建华等[38]在锦鲫(Carassius auratus)的研究也发现饥饿能够影响基因表达的节律性。结合miR-21的靶基因预测以及荧光定量PCR结果, 表明miR-21可能通过介导Arntl2的表达来应对饥饿胁迫下的生理节律, 进而对肌肉的生理功能或生长发育起到调控作用。
本研究对鳜不同发育阶段的胚胎、不同的组织器官中miR-21的表达以及正常投喂与饥饿5 d的鳜白肌中的miR-21的节律性表达进行了初步研究, 结果表明, miR-21可能对神经胚期之后的器官形成以及心脏、红肌和肠等组织器官有重要调节功能。鳜miR-21在白肌中的表达具有明显的昼夜节律性, 且参与饥饿胁迫下的动态调节过程。通过靶基因的预测以及荧光定量PCR结果, 我们推测miR-21可能通过调控Arntl2的表达来调节鳜白肌的生长发育或生理功能。本研究对miR-21在鱼类中的时空表达及短期饥饿胁迫下的节律性表达特征进行分析, 为后续研究其在鱼类中的生物学功能奠定基础。
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