异育银鲫(Carassius auratus gibelio, Bloch)具有生长快、食性广等特点，是我国重要的淡水养殖品种^[1]。随着集约化养殖的发展，病害日益成为危害异育银鲫产业可持续发展的瓶颈；其中粘孢子虫病是最为严重的寄生虫病之一，由于缺乏有效的防控措施^[2-3]，每年造成异育银鲫苗种和成鱼大量死亡。目前，异育银鲫可感染粘孢子虫的种类超过62种^[4]，如洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)、武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)、吴李碘泡虫(Myxobolus wulii)、培养碘泡虫(Myxobolus cultus)等，其中以引起“喉孢子虫病”的洪湖碘泡虫危害最为严重。当异育银鲫严重感染时，咽上皮与颅骨间会出现大量发育成熟的孢子和胞囊^[2]。发病鱼呈现上浮，离群独游，头背部发黑，反应迟缓，摄食困难，单侧或双侧眼球突出，鳃盖不能闭合；打开喉部可见口咽腔上壁红肿溃烂，其他器官没有明显症状，最终发病鱼由于严重贫血、炎症反应、压迫感染及继发感染等导致死亡^[5-8]。

目前，有关洪湖碘泡虫的完整生活史和组织感染分布特征等病原生物学的基础信息还缺乏详细研究。杨坤等^[9-10]和Wang等^[11]通过PCR检测发现，池塘养殖的异育银鲫在没有“喉孢子虫病”的临床症状下，从健康鱼样本中检测出很高的洪湖碘泡虫DNA阳性；表明养殖异育银鲫中普遍存在隐性感染现象。在一些隐性感染个体的伪鳃及其周边组织显微镜镜检可以明显看到成熟的孢子和胞囊^[10]。刘晓聪等^[12]在异育银鲫的鳃中也曾检查到游离分散的成熟孢子。为了进一步阐明洪湖碘泡虫寄生异育银鲫不同组织器官差异，本研究通过荧光定量PCR检测分析了洪湖碘泡虫在异育银鲫伪鳃、鳃、头肾、卵巢等组织器官中的感染率和相对感染强度，为异育银鲫喉孢子虫病的早期检测和防治提供依据。

异育银鲫幼鱼购自江苏省常州市金坛某繁育场，养殖在中国水产科学院淡水渔业研究中心南泉试验基地的室外水泥池；在当年6—7月，发现有部分苗种死亡，经诊断为洪湖碘泡虫病。第2年养殖过程中没有再出现洪湖碘泡虫病死亡情况。随机采集该水泥池中2龄异育银鲫30尾，记录体重和体长，采集尾静脉血，解剖和显微镜检查鳃(丝)、伪鳃、中肾、头肾、肌肉、脾脏、肝脏、卵巢(采集完每个组织后使用的剪刀和镊子用酒精棉擦洗干净，防止交叉污染)是否有洪湖碘泡虫的胞囊或孢子；同时，采集保存各组织样品于1.5 mL灭菌EP管中，记录编号，置于−20 ℃，用于分子检测。

将冻存组织解冻，使用电动研磨器匀浆，按照磁珠法微量基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)说明书步骤提取组织DNA，保存−20 ℃备用。样品DNA使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA)测定质量和浓度，并调整至200 ng/µL, −20 ℃保存备用。

研究所用的内参基因异育银鲫β-actin和靶基因洪湖碘泡虫18S rDNA引物由上海生工合成(表1)。荧光定量PCR反应体系设置参照Ultra SYBR Mixture使用说明，包括SYBR^® Green Supermix 10 μL，正反向引物各0.8 μL (10 μmol/L), DNA模板2.0 μL, RNase Free Water补充至20 µL。反应程序在BIO-RAD CFX96 touch q-PCR system仪器上设置如下：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性3 s, 60 ℃退火34 s, 40次循环；采集熔解曲线。将阳性样品的PCR产物送上海生工测序并通过序列比对分析，确保检测的有效性。

表1

表1 　荧光定量PCR检测所用引物 Tab. 1 　Primers used in real-time PCR analysis 引物 primer 名称 code 序列(5ʹ-3ʹ) sequence (5ʹ-3ʹ) T m值/℃ Tm value 上游 forward β-actin-F CTCCCCTCAATCCCAAAGCCAA 62.56 下游 reverse β-actin-R ACACCATCACCAGAATCCATCA 59.42 上游 forward Mh-in-F GTCCGGACATCGAAAGGAT 54.50 下游 reverse Mh-in-R AGCGAGCCCAGAATGCTAC 57.97

表1 　荧光定量PCR检测所用引物 Tab. 1 　Primers used in real-time PCR analysis

异育银鲫的洪湖碘泡虫感染率=感染个体/检测个体总数；各组织器官感染率=感染器官样本数/检测器官样本总数。由于洪湖碘泡虫的孢子非常微小且发育为成熟孢子前的细胞很难用显微镜观察计数，各组织器官中洪湖碘泡虫相对感染强度(载虫量)采用洪湖碘泡虫18S rDNA相对异育银鲫宿主β-actin基因的拷贝数进行评价。荧光定量PCR数据采用2^–ΔΔCt法相对定量法分析。利用SPSS25.0统计软件对数据进行统计分析，其中感染率、感染强度差异统计分析采用Kruskal- Wallis检验。

在随机采集的30尾2龄健康异育银鲫(表2)中都未观察到眼睛突出、口咽腔上壁红肿发炎等典型的临床症状。解剖取伪鳃过程中发现少数个体在副蝶骨和咽鳃骨间(图1a)、伪鳃及动脉周边有黄褐色类结节(图1b)；这些类结节与成熟的胞囊结构明显不同，显微镜检后发现黄褐色类结节中充满洪湖碘泡虫“空壳化”的孢子(图1c)，极囊和孢质消失；偶见成熟孢子(图1d)；在其他器官均未检出明显的洪湖碘泡虫成熟胞囊和孢子。

图1

图1 　隐性感染2龄异育银鲫出现的黄褐色类结节和洪湖碘泡虫成熟孢子a 咽上壁组织靠近副蝶骨的黄褐色类结节；b. 伪鳃和出伪鳃动脉周边的黄褐色类结节；c. 黄褐色类结节中的洪湖碘泡虫“空壳化”孢子；d. 黄褐色类结节中的洪湖碘泡虫成熟孢子. Fig. 1 　Yellow-brown nodule-like lesions and spores detected in the covertly infected Carassius auratus gibelio with Myxobolus honghuensisa. Pseudotubercles near the parasphenoid and pharyngobranchial under the upper pharynx wall; b. Pseudotubercles near the pseudobranch and efferent pseudobranch artery; c. The shells of dead M. honghuensis spores; d. Mature spores of M. honghuensis.

除了肌肉样品，在异育银鲫的伪鳃、卵巢、鳃(丝)、脾脏、中肾、头肾、肝脏、血液都检测到洪湖碘泡虫，感染率依次为100.0%、83.3%、73.3%、70.0%、36.7%、23.3%、10.0%、6.7%；其中，伪鳃中的感染率最高，且显著高于其他组织器官(P<0.05)，卵巢、鳃和脾脏感染率较高，显著高于肝脏、中肾和血液中的(P<0.05)(表2)。对各组织器官阳性样品的PCR产物进行挑选，送至上海生工测序，测序得到的18S rDNA序列在NCBI数据库中BLAST比对分析，发现与洪湖碘泡虫(MH329617)一致，确认为洪湖碘泡虫。

洪湖碘泡虫在隐性感染异育银鲫不同组织器官中的相对感染强度(载虫量/基因相对拷贝数)存在明显差异，由高到低分别为伪鳃(14.4349± 70.0529)、卵巢(0.9556±1.5627)、脾(0.3644± 0.7854)、鳃(0.3339±0.2682)、头肾(0.2722±0.3761)、中肾(0.0379±0.1055)、肝脏(0.0019±0.0022)、血液(0.0012±0.0011)。其中，伪鳃中的相对感染强度最高，远高于其他组织；同时，伪鳃中洪湖碘泡虫相对基因拷贝数的波动范围最大，不同异育银鲫个体的伪鳃感染强度存在较大差异。伪鳃中洪湖碘泡虫基因拷贝数在部分样本中出现非常大的异常值(图2)，这些异常值与检查到黄褐色类结节个体的样本相对应。卵巢组织的感染强度仅次于伪鳃，略高于鳃、脾脏和头肾。在卵巢组织部分样本中也出现较大异常值。

表2

表2 　隐性感染2龄异育银鲫各组织器官感染洪湖碘泡虫荧光定量PCR检测结果 Tab. 2 　Real-time PCR test of Carassius auratus gibelio covertly infected with Myxobolus honghuensis 样品编号 fish code 体重/g body weight 鳃(丝) gill 伪鳃 pseudobranch 脾脏 spleen 肝脏 liver 头肾 head kidney 中肾 middle kidney 卵巢 ovary 血液 blood 肌肉 muscle 1 41.7 – + – – – – + – – 2 43.9 + + + + – – – – – 3 43.9 – + + – – – – – – 4 39.7 + + + – + + + – – 5 41.7 – + + – – + + – – 6 50.8 – + + – – + + + – 7 68.1 – + + – – + + – – 8 67.0 + + + – – + + – – 9 50.2 + + + – – – + – – 10 57.3 + + + – + + + – – 11 57.3 + + + – – – + – – 12 47.6 + + + – – – – – – 13 53.6 + + – – – – + – – 14 45.0 + + + – – + + – – 15 47.1 + + – – – + + – – 16 38.6 + + – – – – + – – 17 37.9 + +   + – – + – – 18 54.7 – + – – – – – – – 19 51.7 + + + + – + + + – 20 38.1 + + + – – – + + – 21 37.5 + + + – + + + – – 22 48.3 + + + – – – + – – 23 41.5 + + + – + – + – – 24 35.8 – + – – – – + – – 25 32.9 + + + – + – + – – 26 42.5 + + + – + – + – – 27 43.2 + + – – – + + – – 28 27.1 + + + – – – + – – 29 34.7 + + – – + – + – – 30 27.4 – + – – – – – – – 感染率/% infection prevalence   73.3 100. 0 70.0 10.0 23.3 36.7 83.3 6.7 0 注：“+”表示阳性结果；“–”表示阴性结果. Note: “+” represents positive result; “–” represents negative result.

表2 　隐性感染2龄异育银鲫各组织器官感染洪湖碘泡虫荧光定量PCR检测结果 Tab. 2 　Real-time PCR test of Carassius auratus gibelio covertly infected with Myxobolus honghuensis

洪湖碘泡虫是引起异育银鲫苗种和成鱼发生“喉孢子病”的重要寄生虫病原，每年造成大量死亡。在此前的报道中，洪湖碘泡虫在异育银鲫和金鱼^[13]的寄生部位主要为咽部，鲜有寄生在其他组织器官的报道^[12-14]。由于粘孢子虫在鱼类宿主体内通常存在复杂的增殖和迁移过程，使得粘孢子虫可能会随着寄生的发展而感染宿主的其他组织器官。如Nylund等^[15]发现主要寄生于大西洋鲑(Salmo salar)伪鳃的伪鳃小囊虫(Parvicapsula pseudobranchicola)在宿主的头肾、中肾、脾脏等其他组织器官中也存在感染。目前，进一步深入研究发现，洪湖碘泡虫可以感染异育银鲫的多个组织器官^[9-11]，并在这些组织器官中持续存在较长时间^[10]。

图2

图2 　以洪湖碘泡虫18S rDNA相对异育银鲫β-actin基因拷贝数推测不同组织器官的相对感染强度 Fig. 2 　Infection intensity of Myxobolus honghuensis in different organs inferred with the relative copies of 18S rDNA normalized to β-actin gene of gibel carp

本研究通过荧光定量PCR检测方法发现洪湖碘泡虫在异育银鲫除肌肉以外的其他组织器官均有不同程度的感染，其中伪鳃的感染率最高，其次为卵巢、鳃、脾脏、肾脏等组织器官。研究结果与杨坤等^[10]和Wang等^[11]的结果基本一致；但在本研究中所检测的异育银鲫样本中洪湖碘泡虫的感染率数值要更高。杨坤等^[16]对来自江苏地区隐性感染异育银鲫亲本检测后发现感染率为50%; Wang等^[11]对来自湖北地区隐性感染异育银鲫亲鱼检测后发现感染率为84%；而本研究所检测2龄异育银鲫隐性感染率高达100%。不同报道中的差异可能与实验所采用的检测方法的灵敏度，或不同批次样本感染率有关。罗丹等^[17]在对比洪湖碘泡虫不同PCR检测方法的灵敏性时发现SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法比常规PCR检测方法的灵敏度高出约1000倍，荧光定量PCR检测方法具有更高的灵敏性。

在发生洪湖碘泡虫病的异育银鲫中主要出现咽部发炎红肿，咽上壁后有大量细小的白色胞囊和成熟的孢子，在其他器官中却很少能发现明显的病变和成熟孢子^[5-8]。杨坤等^[16]通过荧光原位杂交检测发现在隐性感染的异育银鲫伪鳃、卵巢、肾脏和脾脏等组织中均有洪湖碘泡虫的前孢子生成细胞(营养体)。本研究通过荧光定量PCR检测进一步确认了洪湖碘泡虫在隐性感染异育银鲫多个组织器官中的系统性感染，并且伪鳃的感染强度(载虫量)远高于其他组织器官。研究结果表明伪鳃是洪湖碘泡虫在异育银鲫体内主要的寄生位点和孢子发育成熟位点^[10]，可以作为“喉孢子虫病”早期检测和监测采样时的首选组织器官。目前，研究发现硬骨鱼类伪鳃与第1鳃弓出鳃动脉相连，能够接受富含氧的血液；伪鳃上的嗜酸性细胞含有许多线粒体和丰富的碳酸酐酶，具有调节内分泌、血氧监测等一系列功能^[18-22]。洪湖碘泡虫对伪鳃的组织偏好性，以及在伪鳃中快速增殖并形成大量成熟孢子，是由于营养需求还是免疫逃避在发挥作用，需要进一步探讨。此外，本研究在部分隐性感染异育银鲫的伪鳃周边发现一些黄褐色类结节，这些伪鳃处存在黄褐色类结节的样本在荧光定量PCR检测时出现非常大的异常值，表明洪湖碘泡虫在这些个体中出现了大量的增殖。这些类结节与正常胞囊结构明显不同，在类结节内包裹着洪湖碘泡虫“空壳化”的和成熟的孢子。这一现象可能是由于鱼体黑色素巨噬细胞对洪湖碘泡虫孢子的免疫反应造成的。

根据已有研究，目前国内养殖异育银鲫可能普遍具有较高的洪湖碘泡虫隐性感染率^[11,17]。本研究对卵巢组织进行洪湖碘泡虫基因拷贝数检测时也发现部分样本出现较大异常值，表明洪湖碘泡虫在卵巢中存在很高的丰度。由于洪湖碘泡虫已被发现存在随鱼卵传播的途径^[16]，国内异育银鲫苗种繁育场又缺乏对亲本的病原检疫，因此，苗种携带病因和疾病随苗种扩散风险非常高。鉴于当前针对异育银鲫养殖中洪湖碘泡虫病依然缺乏确切有效的治疗药物^[2-3]，或许可以从亲本和苗种环节通过检测和筛选，生产无特定病原(specific pathogen free, SPF)苗种，从而解决异育银鲫产业的洪湖碘泡虫病的问题。此外，目前对洪湖碘泡虫病的关注主要局限于养殖的异育银鲫，该寄生虫病原在自然条件下的地理分布以及其在银鲫和鲫属亲缘关系较近种类中的感染情况等仍需进一步研究。

本研究通过荧光定量检测详细分析了洪湖碘泡虫在隐性感染异育银鲫组织器官中的感染率和感染强度，掌握了洪湖碘泡虫在鱼体组织器官的分布规律和偏好性，为洪湖碘泡虫病的检验检疫、生态防控和进一步的致病机制研究奠定了基础。