中国水产科学  2022, Vol. 29 Issue (08): 1179-1188  DOI: 10.12264/JFSC2022-0151
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引用本文 

李明晖, 安长廷, 李昂, 刘凯莹, 柳淑芳, 庄志猛. 黄渤海虾虎鱼DNA条形码分类体系构建[J]. 中国水产科学, 2022, 29(8): 1179-1188. DOI: 10.12264/JFSC2022-0151.
LI Minghui, AN Changting, LI Ang, LIU Kaiying, LIU Shufang, ZHUANG Zhimeng. DNA barcodes enable higher taxonomic assignments in goby in the Bohai Sea and Yellow Sea of China[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2022, 29(8): 1179-1188. DOI: 10.12264/JFSC2022-0151.

基金项目

国家重点研发计划蓝色粮仓项目（2018YFD0900803）；中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目（2021JC01）；国家海洋水产种质资源库项目.

作者简介

李明晖（1996–），男，硕士研究生，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail: 598545891@qq.com

通信作者

通信作者：柳淑芳，研究员，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail：liusf@ysfri.ac.cn

文章历史

收稿日期：2022-04-20
修改日期：2022-04-26
Contents              Abstract              Full text             Figures/Tables             PDF
黄渤海虾虎鱼DNA条形码分类体系构建
李明晖1,2,安长廷1,李昂1,3,刘凯莹1,柳淑芳1,3,庄志猛1,     
1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071
2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071
收稿日期：2022-04-20；修改日期：2022-04-26
基金项目：国家重点研发计划蓝色粮仓项目（2018YFD0900803）；中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目（2021JC01）；国家海洋水产种质资源库项目.
作者简介：李明晖（1996–），男，硕士研究生，研究方向为渔业资源分子生态学. E-mail: 598545891@qq.com.
摘要：虾虎鱼(Gobiidae)是海洋底层食物链中的关键环节，在生态系统的物质循环和能量流动中发挥重要作用。因虾虎鱼种类繁多、分布广泛、体型较小，加之形态上存在不同程度的特化，对形态学分类鉴定带来极大挑战。本研究对采自黄渤海的73尾虾虎鱼成鱼和幼鱼样本分别进行了形态学鉴定和DNA条形码分析，依据形态学分类特征，鉴定出9属12种；而运用DNA条形码技术，共鉴定出13种，隶属于虾虎鱼科10属。可见，在形态学鉴定经验不足或幼鱼形态学特征不明显的情况下，DNA条形码可以有效地实现物种鉴定。同时，系统整理了黄渤海虾虎鱼科记录种名录，共计29属47种。依据物种名录，从BOLD及NCBI数据库中筛选并下载了18属29种虾虎鱼科鱼类的DNA条形码，与本研究鉴定出的10属13种虾虎鱼类合并分析，构建了虾虎鱼科26属42种鱼类的系统关系树，覆盖了黄渤海虾虎鱼科89.36%的记录种，通过对虾虎鱼科鱼类的分子系统发育关系与形态学分类地位进行确认和修订，初步建立了黄渤海虾虎鱼科DNA条形码分类体系。本研究结果证明了DNA条形码技术对虾虎鱼物种具有较高识别效率，有效弥补了传统形态学鉴定方法的缺点和局限，丰富了虾虎鱼DNA条形码数据库，完善了虾虎鱼DNA条形码分类体系，为虾虎鱼的保护生物学、进化生物学及生物地理学等研究提供了科学依据。
关键词：虾虎鱼    DNA条形码    物种鉴定    系统发育关系    DNA条形码分类体系    
DNA barcodes enable higher taxonomic assignments in goby in the Bohai Sea and Yellow Sea of China
LI Minghui1,2,AN Changting1,LI Ang1,3,LIU Kaiying1,LIU Shufang,1,3,ZHUANG Zhimeng1    
1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
3. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China
Abstract:The goby is a key link in the food chain at the bottom of the ocean and plays an important role in the material circulation and energy flow of the ecosystem. Due to the large variety, extensive distribution, and small size of the goby, as well as different degrees of degradation and specialization in morphology, it presents great challenges to morphological classification and identification. In this study, 73 adult and juvenile goby samples from the Yellow Sea and Bohai Sea were identified by morphology and DNA barcoding. According to the morphological classification, 12 species of 9 genera were identified, while 13 species were identified belonging to 10 genera of family Gobiidae. Thus, in the case of insufficient experience in morphological identification or unclear morphological characteristics of juvenile fish, DNA barcoding can effectively identify species. At the same time, the list of recorded species of family Gobiidae in the Bohai Sea and Yellow Sea of China was systematically sorted out, with a total of 47 species of 29 genera. According to the recorded species list, the DNA barcodes of 29 species of 18 genera belonging to the family Gobiidae were screened and downloaded from the BOLD and NCBI databases. Combined with the 13 species of 10 genera of gobies identified in this study, a phylogenetic tree of 42 species of 26 genera was constructed, covering 89.36% of the recorded species of gobies in the Bohai Sea and Yellow Sea of China. The DNA barcode classification system of gobies was established by confirming and revising the molecular phylogenetic relationship and morphological classification status of gobies. The results of this study demonstrate the recognition efficiency of DNA barcoding in the classification of the gobies, make up for the shortcomings and limitations of traditional morphological identification methods, enrich the goby DNA barcode database, improve the goby DNA barcoding classification system, and provide a scientific basis for research on the conservation biology, evolutionary biology, and biogeography of goby fish.
Key words：gobies    DNA barcoding    species identification    molecular phylogenetic relationships    DNA barcode classification system    

虾虎鱼科(Gobiidae)是硬骨鱼类中最为丰富的类群之一，在我国分布广泛[1]。黄渤海地处温带，虾虎鱼种类较东海和南海少，但在不同文献记载中，分布于黄渤海的虾虎鱼科鱼类组成和数目出入较大，如张春霖在20世纪50年代完成的《黄渤海鱼类调查报告》[2]中记载了23种；伍汉霖和钟俊生在本世纪初出版的《中国动物志》(硬骨鱼纲 鲈形目五 虾虎鱼亚目)[3]中记录了34种；同一时期，李晴[4]通过在黄渤海区实地取样和对保存于中国科学院动物研究所的虾虎鱼标本进行重新鉴定和相关资料整理，共得到39种虾虎鱼；刘静[5]则认为有26种虾虎鱼科鱼类分布于黄渤海。在生态系统中，虾虎鱼既是底栖生物的主要捕食者，又是许多高营养级鱼类的饵料生物，是底层食物链中的关键环节，在生态系统物质循环和能量流动中起着重要的作用[6]。近年来，随着近海渔业资源衰退，虾虎鱼的经济价值日渐凸显，如斑尾刺虾虎鱼(Acanthogobius ommaturus)、矛尾虾虎鱼(Chaeturichthys stigmatias)等常以优势种身份出现在渤海渔业资源调查中[7]，在地域性渔业中具有重要意义。其他小型虾虎鱼类虽然经济价值较小，因极高繁殖力和较强适应性，其生态价值也越来越受到人们的关注。

对虾虎鱼进行准确的分类鉴定是其保护生物学、进化生物学和生物地理学等研究的前提，具有重要的生物学和生态学意义。然而，传统形态学方法对虾虎鱼类的分类鉴定尚存在一定局限性：一则虾虎鱼种类众多，有的虾虎鱼较少见，人们对其形态学分类和物种多样性认知有限；二来虾虎鱼形态存在不同程度的特化，给基于形态特征的物种间系统关系确认带来巨大挑战，致使在属级和科级水平的分类存在较大争议；三是虾虎鱼幼鱼形态学特征不明显，物种鉴定难度较大。上述原因给虾虎鱼物种分类鉴定带来了诸多困难。

DNA条形码技术是一种利用较为短小的DNA片段鉴定生物物种身份信息的新分类学方法[8]，是对传统分类学方法的完善、发展和创新，目前已广泛应用于鱼类[9-10]、鸟类[11]、昆虫[12-13]等动物分类鉴定工作中，成为物种鉴定的有力工具之一。本研究拟在形态学鉴定的基础上，运用DNA条形码技术，对黄渤海虾虎鱼科鱼类进行分类鉴定，旨在建立黄渤海虾虎鱼科DNA条形码分类体系，为虾虎鱼资源开发和养护提供科学依据。

1　材料与方法 1.1　实验材料

本研究73尾虾虎鱼样品，于2020–2021年分别采自黄渤海潮间带(40尾)和黄渤海资源调查(33尾)，其中成鱼50尾，幼鱼23尾。样品冷冻保存，运回实验室后，先依据形态学特征[3,14]对样品进行初步的物种鉴定，随后取肌肉组织保存于95%乙醇溶液，用于DNA条形码鉴定。

1.2　DNA提取

使用天根生物科技有限公司的海洋生物组织基因组DNA提取试剂盒，提取73尾虾虎鱼肌肉组织的DNA。

1.3　PCR扩增及DNA测序

DNA条形码扩增采用Ward等[15]设计的鱼类通用引物，上下游引物序列分别为Fish-F: 5′- TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′, Fish- R: 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。

PCR反应体系：每25 µL反应体系包括2×Rapid Taq Master Mix 12.5 µL，鱼类通用引物F1/R1各1 µL, DNA模板2 µL，灭菌水8.5 µL。

PCR反应条件：变性温度95 ℃，持续3 min; 95 ℃ 15 s, 56 ℃ 10 s, 72 ℃ 40 s，循环35次；75 ℃延伸7 min。

PCR产物长度约为680 bp，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，合格扩增产物送至青岛华大基因完成双向测序。

1.4　虾虎鱼记录种名录整理及DNA条形码序列下载

依据张春霖[2]的《黄渤海鱼类调查报告》、伍汉霖和钟俊生[3]主编的《中国动物志》(硬骨鱼纲 鲈形目五 虾虎鱼亚目)、李晴[4]的《中国黄渤海区虾虎鱼类》和刘静等[5]的《黄渤海鱼类图志》，系统整理出黄渤海虾虎鱼科记录种名录。

为了进一步验证DNA条形码分类结果的准确性、明确虾虎鱼科物种的系统关系、建立黄渤海虾虎鱼类DNA条形码分类体系，根据上述物种名录，另从GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/)和BOLD数据库(https://v3.boldsystems. org/)筛选出分布于黄渤海的18属29种虾虎鱼类的DNA条形码(表1)，其样本采集地多为黄渤海。将下载的DNA条形码与本研究自测获得的73条DNA条形码序列合并分析。同时，下载了方氏云鳚(Pholis fangi) DNA条形码序列(ANGBF2243-12)作为外类群。

1.5　数据分析

使用Lasergene7.0[16]对测序的原始序列进行组装，组装完成的序列利用MEGA7.0[17]中ClustalW程序，对序列进行比对，计算序列的长度、GC含量、简约信息位点等参数。基于Kimura 2-parameter (K-2-P)双参数模型[18]计算种间遗传距离(interspecific genetic distance)和种内遗传距离(intraspecific genetic distance)。利用邻接法(neighbour-joining, NJ)建立分子系统发育树，系统发育树分支的置信度利用Bootstrap检验，重复次数为1000。

通过BOLD数据库(http://www.boldsystems. org/index.php/databases)及NCBI数据库(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)对样品序列进行同步比对分析。

表1 　黄渤海虾虎鱼科记录种及其DNA条形码信息 Tab. 1 　Recorded species and DNA barcoding information of Gobiidae family in the Yellow Sea and Bohai Sea
2　结果与分析 2.1　黄渤海虾虎鱼记录种名录

对《黄渤海鱼类调查报告》[2]记载的黄渤海虾虎鱼科18属23种、《中国动物志》(硬骨鱼纲 鲈形目五 虾虎鱼亚目)[3]记录的虾虎鱼科23属34种、《中国黄渤海区虾虎鱼类》[4]鉴定出的虾虎鱼科27属39种和《黄渤海鱼类图志》[5]收录的虾虎鱼科19属26种进行系统梳理，最终整理出黄渤海虾虎鱼科记录种共计29属47种(表1)，获得完整的黄渤海虾虎鱼科记录种名录。

2.2　虾虎鱼样品形态学初步鉴定

依据虾虎鱼的典型形态学特征，首先将73尾虾虎鱼样品中的50尾初步鉴定为12种虾虎鱼，剩余23尾由于处于幼鱼阶段，形态特征不明显，无法鉴定到种。形态学特征分类信息详见表2。

2.3　DNA条形码物种鉴定 2.3.1　BLAST相似性比对与DNA条形码序列特征

首先，通过聚类分析将73条虾虎鱼COI序列聚为13组，分别与GenBank、BOLD数据库进行比对分析，结果显示13组序列均匹配到大于99%的同源DNA条形码序列。与形态学初步鉴定结果进行对照，其中12组成鱼序列的BLAST比对分析结果与形态学鉴定结果一致(GP1-12)；无法根据形态学特征鉴定的23尾幼鱼样品，DNA条形码序列比对结果分别是双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)(GP5)、纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus)(GP6)，拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)(GP13)。

通过比对分析，13种虾虎鱼73条序列保留长度均为609 bp，平均碱基组成为：T: 30.0%, C: 26.6%, A: 24.3%, G: 19.1%，其中A+T的含量(54.3%)明显高于C+G含量(45.7%)。COI基因密码子碱基组成特征表现为，第一密码子的G+C含量最高(56.2%)，第二密码子的A+T含量最高(56.1%)，可见在碱基密码子在使用频率上具有一定的偏向性(表3)。在609 bp的序列中，共有365个保守位点，变异位点244个，其中简约信息位点242个，单一信息位点2个，无插入/缺失位点。

表2 　虾虎鱼类形态学和DNA条形码分类鉴定结果 Tab. 2 　Identification and classification of Gobiidae by morphology and DNA barcoding
2.3.2　种间及种内遗传距离

根据Kimura 2- parameter模型计算得13种虾虎鱼种内及种间遗传距离(表4)。13种虾虎鱼的种内遗传距离为0.001~ 0.009，平均值为0.003，均低于2%的种间遗传分化界限[9]；种间遗传距离为0.149~0.282，平均值为0.216，均高于2%的种间遗传分化界限[9]；种间与种内遗传距离的比值符合Hebert提出的物种鉴定“10×法则”标准[9-10,12]，据此判定为13个有效种。

表3 　13种虾虎鱼COI基因中碱基使用频率 Tab. 3 　Bases usage frequency in COI gene of 13 Gobiidae
表4 　13种虾虎鱼种内遗传距离(对角线)种间遗传距离(对角线下)比较 Tab. 4 　Comparison of intraspecific genetic distance (diagonal) and interspecific genetic distance (below diagonal) of 13 species of Gobiidae
2.4　虾虎鱼系统发育关系分析

为进一步验证鉴定结果的准确性和可靠性，建立虾虎鱼科鱼类的DNA条形码分类体系，将本研究自测的虾虎鱼科10属13种73条虾虎鱼DNA条形码，与BOLD数据库下载的18属29种虾虎鱼DNA条形码合并分析，构建了虾虎鱼科26属42种的邻接法分子系统树(图1)，包括虾虎鱼亚科(Gobiinae) 6属7种，拟虾虎鱼亚科(Gobionellinae) 11属25种，背眼虾虎鱼亚科(Oxudercinae) 5属6种，近盲虾虎鱼亚科(Amblyopinae) 4属4种。

系统发育树中，亚科水平上，虾虎鱼亚科(Gobiinae)、拟虾虎鱼亚科(Gobionellinae)、近盲虾虎鱼亚科(Amblyopinae)、背眼虾虎鱼亚科(Oxudercinae)的聚类并不明显，均未单独聚为一支；属的水平上，除裸身虾虎鱼属(Gymnogobius)外，其他属均能独立聚为一支；在种的水平上，42种虾虎鱼的DNA条形码序列均能单独聚为一支。

3　讨论

虾虎鱼因种类繁多、形态特征特化及多样化的生活史和生态特征，给传统形态学分类鉴定带来巨大挑战。DNA条形码作为一种高效、简易的鉴定方法，为物种分类鉴定提供了新的强有力证据。本研究采集的73条虾虎鱼经形态鉴定和DNA条形码序列比对分析，最终鉴定为13个有效种，其中12种成鱼的DNA条形码与形态鉴定结果一致，另外23尾幼鱼仅能利用DNA条形码确定其种类，鉴定结果为纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus)、双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)和拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)。虾虎鱼幼鱼阶段的样本，其典型形态学鉴定特征不甚明显，难以运用形态学方法实现物种鉴定，而通过DNA条形码则可以对其准确鉴定，这充分体现了DNA条形码在幼鱼鉴定过程中的优势，因此这项技术在虾虎鱼类仔稚鱼的分类中具有较好的应用前景。

DNA条形码为虾虎鱼有效种名的确认提供了有力的分子证据。比如，纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus)与双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)形态学特征较为相似，甚至早期曾有学者把双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)作为纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus)的同物异名[2]。本研究运用DNA条形码分析发现，双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)、纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus)的种内遗传距离分别为0.005和0.002，种间遗传距离为0.177，种间与种内遗传距离比值符合Hebert提出的物种鉴定“10×法则”标准，表明纹缟虾虎鱼(T. trigonocephalus) 与双带缟虾虎鱼(T. bifasciatus)为两个有效种。同时，本研究还确认了拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)为黄渤海有效记录种。在早期的分类资料中，分类学家朱元鼎[19]曾将分布于中国的该物种鉴定为红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)。但伍汉霖[3]在《中国动物志》(硬骨鱼纲 鲈形目五 虾虎鱼亚目)中明确指出，“红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)的模式产地为印度恒河，仅存在于印度东部沿海，与采自中国的样本在背鳍、臀鳍、尾椎等主要鉴别特征上存在明显的差异，产自中国的“红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)”实为拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)”。拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)模式种采自日本，仅分布于朝鲜半岛、日本以及中国沿海[3]。本研究在黄海中部采到6尾狼牙虾虎鱼(Odontamblyopus sp.)幼鱼，经DNA条形码比对分析，发现其与BOLD数据库中收录的分别标注为红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)和拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)的序列相似度均较高(均>99%)。为了进一步明确该物种的鉴定结果，本研究从BOLD数据库筛选出采自中国和印度的红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)及采自中国的拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)DNA条形码序列，通过聚类分析和遗传距离计算，发现本研究自测序列与数据库中采自我国的红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)和拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)在系统树中聚为一支(A分支)，且遗传距离仅为0.009；而印度的红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus)序列单独一个支(B分支)，遗传距离为0.007; A与B两个分支的遗传距离为0.146(图2)。综合DNA条形码分析结果与伍汉霖的观点[3]，判断图2中B分支的印度样品为的红狼牙虾虎鱼(O. rubicundus), A分支的中国样品则为拉氏狼牙虾虎鱼(O. lacepedii)。另外，裸身虾虎鱼属中的黄带裸身虾虎鱼(G. laevis)与条尾裸身虾虎鱼(G. urotaenia)两个物种的有效性尚存在一定争议，国外学者[20]和WoRMS (https://www. marinespecies.org/)认为黄带裸身虾虎鱼(G. laevis)是条尾裸身虾虎鱼(G. urotaenia)的同种异名；但伍汉霖等[3]认为根据背鳍、头部感觉管孔、吻部及体侧有无黑斑，二者存在明显差异，认为两者均为有效种。本研究通过DNA条形码分析，二者遗传距离大于0.02，且系统发育树二者也未聚为一支，因此，支持黄带裸身虾虎鱼(G. laevis)与条尾裸身虾虎鱼(G. urotaenia)均为有效种的观点。

图1 　42种虾虎鱼DNA条形码邻接关系法分子系统树下划线标注为自测样本，*标注为近盲虾虎鱼亚科鱼类，**标注为背眼虾虎鱼亚科鱼类，***标注为拟虾虎鱼亚科鱼类，****标注为虾虎鱼亚科鱼类，Pholis fangi为外类群. Fig. 1 　Neighbor-joining phylogenetic tree of DNA barcodes for 42 species of GobiidaeMarked with underline are the samples determined in this study; Marked with * are the samples of Amblyopinae; Marked with ** are the samples of Oxudercinae; Marked with *** are the samples of Gobionellinae; Marked with **** are the samples of Gobiinae; Pholis fangi is the outgroup.

本研究构建了黄渤海虾虎鱼科4亚科26属42种鱼类的NJ系统发育树。从拓扑结构可见，4个亚科并未各自聚成独立的分支。究其原因，其一，DNA条形码适合于鱼类的物种鉴定，但在较高级分类阶元的系统发育关系方面缺少明显优势；其二，传统的虾虎鱼系统关系判别依据主要是典型的形态特征，而DNA条形码分子标记尚不能反映出这种表型差异，二者在系统发育关系的构建中均表现出不同程度的局限性，甚至两种方法构建系统发育树会出现较大偏差；加之，虾虎鱼形态特征的特化，致使其科级、亚科级的分类尚未达成共识[21]。因此，本研究暂不考虑虾虎鱼亚科级的系统关系。属的水平上，黄渤海虾虎鱼科的26属中，除了裸身虾虎鱼属(Gymnogobius)，具有多个种类的属大多能独立聚为一支。在种的水平上，42种虾虎鱼的DNA条形码序列均能单独聚为一支。由此可见，42种虾虎鱼分子系统树再次验证了DNA条形码对虾虎鱼物种鉴定和有效种确认的准确性。本研究构建的虾虎鱼科DNA条形码分类体系包括26属42种，覆盖了89.36%黄渤海虾虎鱼科记录种(47种)，为黄渤海虾虎鱼多样性研究和保护、资源开发和利用提供基础数据，同时也为虾虎鱼的适应性进化和生物地理学研究提供了科学依据。

图2 　拉氏狼牙虾虎鱼与红狼牙虾虎鱼聚类分析*表示本研究自测序列；GBMIN130107-17 (采自中国山东青岛)及ANGBF15191-19 (采自中国广东广州)为BOLD数据库下载拉氏狼牙虾虎鱼DNA条形码序列；ANGBF51370-19 (采自中国福建厦门)、ANGBF15195-19(采自中国福建厦门)和GBGCA5332-13(采自印度)、GBGCA5333-13(采自印度)、GBGCA5334-13(采自印度)为BOLD数据库下载的红狼牙虾虎鱼DNA条形码序列；斑尾刺虾虎鱼为外类群. Fig. 2 　Clustal analysis of Odontamblyopus lacemedii and Odontamblyopus rubicundusMarked with * are the samples determined in this study; GBMIN130107-17 (from Qingdao, China) and ANGBF15191-19 (from Guangzhou, China) are the DNA barcodes of Odontamblyopus lacepedii download by BOLD database; ANGBF51370-19 (from Xiamen, China), ANGBF15195-19 (from Xiamen, China), GBGCA5332-13 (from India), GBGCA5333-133 (from India), GBGCA5334-133 (from India) are the DNA barcodes of Odontamblyopus rubicundus download by BOLD database; Acanthogobius ommaturus is the outgroup.

本研究尚存在一定的不足，在对黄渤海虾虎鱼科记录种名录的整理过程中发现，李晴的《中国黄渤海区虾虎鱼类》[4]中记录的黄渤海虾虎鱼种类最多，其样品获取途径有两种：一是在黄渤海区实地取样；二是对保存于中国科学院动物研究所的虾虎鱼标本进行重新鉴定和相关资料整理，因大量标本固定时间多在1930年至1980年之间，标本较陈旧且标本采集地等记录可能模糊，导致其信息准确性存疑。例如：在《中国动物志》(硬骨鱼纲 鲈形目五 虾虎鱼亚目)[3]中，舌虾虎鱼属舌虾虎鱼(G. giuris)、斑纹舌虾虎鱼(G. olivaceus)被认为仅分布在东海及南海；裸身虾虎鱼属黄带裸身虾虎鱼(G. laevis)、条尾裸身虾虎鱼(G. urotaenia)等物种只出现在淡水水域，但这些种类却被李晴[4]记录为分布于黄渤海，且这些种类在近年的黄渤海调查中均未出现。然而基于目前所掌握的资料，本研究尚无法判断这些种类在早期黄渤海海域调查中是否存在。本研究本着不遗漏物种的原则将这几种虾虎鱼暂纳入黄渤海记录种名录，但其客观性尚有待后续研究逐一进行判别与探讨。

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