2022, Vol. 29 
2. 中国水产科学研究院南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300
2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Acadamy of Fishery Sciences; Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangzhou 510300, China
蛇鳗科(Ophichthidae)是鳗鲡目(Anguiliformes)中种类分化最多且体形较为特化的一个类群，全球发现并获得命名的约有55属260余种，我国有14属40种。蛇鳗鱼类一般身体细长形似蛇状，头部较小，无尾鳍，尾端尖突，广泛分布于印度洋和太平洋西南部的热带、亚热带海域[1]。艾氏蛇鳗(Ophichthus evermanni Jordan & Richardson, 1909)分布于我国东海、南海以及日本南部近岸海域，为蛇鳗科代表性鱼类，常栖息于沿岸浅水泥底质海区。本种体延长，稍粗；背鳍起始于胸鳍末端上方，背鳍、臀鳍在尾端呈菱形；齿小且锐利；体淡褐色，背侧色较深且无明显条带，体侧有20条左右通达背鳍的不规则的褐色云状斑，颈部也可见褐色斑纹[1-2]。目前，国内外对蛇鳗科鱼类的研究主要集中在形态鉴定和新种的描述[1,3-9]、侧线管结构和嗅觉器官的比较等方面[10-11]，尚未见到关于艾氏蛇鳗遗传学方面的相关研究报道。
线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)是动物细胞核外唯一的遗传物质，能够进行自主复制和转录翻译。与细胞核DNA相比，mtDNA具有母系遗传、分子结构简单、进化速度快、无组织特异性等特点，目前已成为研究物种起源与系统发生、近缘物种和种内群体间遗传分化、物种鉴定、遗传多样性分析等的有力工具[12-13]。鱼类mtDNA在进化遗传学研究中有着十分广泛的应用，尤其是线粒体全基因组序列，信息量相较于单个基因更大，能够更全面地反映出物种的遗传特征和不同分类阶元的系统进化关系[14-15]。在近十余年中，鱼类线粒体基因组研究受到了高度关注，伴随着高通量测序技术的广泛应用，已完成线粒体基因组测序的鱼类种类和数量呈现出快速增长的趋势。
本研究首次采用高通量测序技术，获得了艾氏蛇鳗线粒体基因组全序列，并对其基因组成和结构特征进行分析。结合GenBank数据库下载的近缘种线粒体序列信息，利用蛋白编码基因组序列探讨了蛇鳗科鱼类的系统发育关系。研究结果将有效填补艾氏蛇鳗分子生物学领域的空白，同时对蛇鳗科鱼类稀少的线粒体基因组数据进行补充完善，进而为该类群鱼类的分类鉴定、种质资源评价和开发利用提供分子证据和理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料和DNA提取用于本研究的艾氏蛇鳗(♀，体长771.42 mm，体重571.63 g)于2020年10月采自福建厦门近海。−20 ℃冷冻带回实验室后，置于95%乙醇中固定保存。实验前，取背部肌肉20 mg放入玻璃培养皿中用蒸馏水浸泡3~5 min，取出后充分吸干水分，放入1.5 mL离心管中晾干备用。采用传统氯仿-tris饱和酚方法抽提基因组DNA[16]，分别使用1%琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0荧光计检测基因组DNA完整性和纯度。
1.2 高通量测序和基因注释以1 μg DNA起始量建库，用Covaris M220超声波破碎仪把DNA随机打断成300~500 bp的片段，经末端修复、加Poly A尾和测序接头、回收纯化和PCR扩增等步骤完成整个文库制备，构建好的文库基于边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)技术，通过Illumina HiSeqTM 2500平台进行双末端测序。使用Cutadapt软件[17]对原始数据进行修剪质控后，使用NOVOPlasty软件[18]对线粒体基因组进行组装，借助在线工具MITOS (http://mitos2.bioinf.uni-leipzig.de/index.py)完成基因的定位和注释，通过进一步与GenBank数据库中已公布的蛇鳗属鱼类线粒体基因组全序列人工比对校正以后，最终确定每个基因的位置和长度信息。使用可视化工具Organellar Genome DRAW (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)绘制线粒体基因组圈图[19]。
1.3 序列分析及基因二级结构预测利用DNAStar软件[20]对艾氏蛇鳗线粒体全基因组序列进行比对与校正，使用MEGA-X软件[21]统计分析序列的全长、碱基含量、氨基酸组成、相对同义密码子使用率(relative synonymous codon usage, RSCU)、结构特征及变异特点等信息。分别使用tRNAscan-SE1.21软件[22]和RNAstructure 6.2软件[23]预测tRNA和rRNA的二级结构。通过在线工具Mfold (http://www.unafold.org/)预测轻链复制起始区(OL)的二级结构。
1.4 系统进化分析从GenBank数据库中检索并下载了7种蛇鳗科鱼类的8条线粒体基因组全序列，分别为短尾蛇鳗(O. brevicaudatus-MZ334613、MK189459)、圆身蛇鳗(O. rotundus-KY081397)、食蟹豆齿蛇鳗(Pisodonophis cancrivorus-AP019350)、杂食豆齿蛇鳗(P. boro-AP019349)、黑斑花蛇鳗(Myrichthys maculosus-AP010862)、鳄形短体鳗(Brachysomophis crocodilinus-KY081398)和大吻沙蛇鳗(Ophisurus macrorhynchos-AP002978)。以星康吉鳗(Conger myriaster-MW788427)为外群，基于除ND6基因以外的12个蛋白编码基因串联序列，分别使用最大似然法(maximum likelihood, ML)[24]和邻接法(neighbor-joining, NJ)[25]构建蛇鳗科鱼类的系统进化树以确定艾氏蛇鳗的进化位置，两种方法均使用1000次Bootstrap自举法检验系统发育树的各分支置信度[26]。构建ML系统发育树时，使用Modeltest 3.7软件[27]以似然率检验(LRT)标准来确定最佳拟合进化模型，从1000次重复中选择似然率最大的拓扑结构作为其最终树。
2 结果与分析 2.1 基因组结构和组成本研究采用高通量第二代测序技术获得的艾氏蛇鳗的线粒体基因组，全长为17759 bp (图1)，包含22个tRNA基因、13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因和3个非编码区(2个D-loop区、1个轻链复制起始区)，其中tRNA-Gln (Q)、tRNA-Ala (A)、tRNA-Asn (N)、tRNA-Cys (C)、tRNA-Tyr (Y)、tRNA-SerUCA (S1)、tRNA-Glu (E)和tRNA-Pro (P)和ND6基因位于轻链(L链)，其余28个基因均位于重链(H链)上(表1)。与其他海水硬骨鱼类不同，艾氏蛇鳗的线粒体基因组中存在基因重排现象，ND6基因和tRNA-Glu移到了tRNA-Thr和tRNA-Pro之间，除了tRNA-Phe (F)和tRNA-Pro (P)之间的D-loop区外，ND6基因上游还存在另一个D-loop区。在艾氏蛇鳗的线粒体基因组全序列中共存在5处基因重叠和13处基因间隔(图1，表1)。基因间隔总长度为78 bp，其中最大基因间隔17 bp存在于Cyt b和tRNA-Thr (T)之间，其次为CO I和tRNA-SerUCA(S1)之间的间隔碱基数为16 bp。基因重叠总长度为20 bp, ATP8和ATP6之间具有较大重叠，发生重叠的碱基数为10 bp，而tRNA-Ile (I)、tRNA-Gln (Q)、tRNA-Met (M)两两之间以及CO III和tRNA-Gly (G)之间均存在1 bp的碱基重叠。
序列分析显示，艾氏蛇鳗的线粒体基因组碱基含量由高到低依次为：A (31.3%)>T (26.3%)> C (26.2%)>G (16.2%)，其中A+T含量(57.6%)高于G+C含量(42.4%)，表现为A+T的偏好性和碱基反G偏倚，这与脊椎动物偏好于A+T碱基一致[28]。
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图1 艾氏蛇鳗的线粒体基因组 Fig. 1 Mitochondrial genome of Ophichthus evermanni |
艾氏蛇鳗的线粒体基因组中13个蛋白质编码基因序列总长度为11490 bp，除了ND6位于L链上，其余12个基因(ATP6, ATP8, CO I, CO II, CO III, Cyt b, ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5)均位于H链上。ATP8与ATP6重叠10个核苷酸，CO III与tRNA-Gly (G)重叠1个核苷酸，ND4L与ND4重叠7个核苷酸，ND6与tRNA-Thr (T)重叠34个核苷酸。13个蛋白质编码基因中，除了CO I基因起始密码子是GTG、终止密码子是TAG, ND6基因起始密码子是CTA、终止密码子是CAT，其余都是ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。终止密码子的缺失通常被认为是由聚腺苷酸化引起的，本研究中艾氏蛇鳗的线粒体ND2、CO II、ATP6、ND3、ND4、Cyt b基因的终止密码子为不完全密码子，分别为T--、T--、TA--、T--、T--和AA-(表1)，这种终止密码子残缺现象在后生动物线粒体基因组中十分常见，与多数硬骨鱼类线粒体蛋白编码基因终止密码子特点相同。
碱基的非均匀分布是编码区最明显的特征之一，不同基因片段碱基含量虽然有所不同，但均呈现出较低的G含量和较高的A+T富集(表2)。位于L链上的ND6基因A碱基含量最高(39.5%)，位于H链的ATP8基因G碱基含量最低(11.31%)。在不同密码子碱基组成上，密码子第1位点上A、T、G、C 4种碱基含量较为接近，不存在碱基使用偏好；密码子第2位点T含量最高而G含量最低，表现出T偏倚和反G偏倚；而密码子第3位点反G偏倚十分明显，平均含量仅为8.0% (表2)。
2.3 密码子使用情况和氨基酸组成使用MEGA软件分析得到艾氏蛇鳗的线粒体基因组的RSCU，用于检测氨基酸使用同义密码子的预期频率与其观测频率之比，以便对密码子使用偏好性进行评估(表3，图2)。结果表明，艾氏蛇鳗的13个蛋白编码基因中存在31个偏好密码子(RSCU≥1)[29]。密码子第3位是C、A碱基的密码子除了UUC (F)、UUA (L)、AUC (I)、GUC (V)、UAC (Y)、CGC (R)以外，密码子RSCU值均大于1，表现出对这两种碱基的使用偏好性。总长度为11490 bp的基因序列共编码氨基酸数量为3779个，从氨基酸组成来看，艾氏蛇鳗的线粒体基因组中最常见的氨基酸为亮氨酸(Leu)，含量为(14.87%)，其次为酪氨酸(Thr)，而使用最少的氨基酸是半胱氨酸(Cys)，含量仅为1.01% (图2)。
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表1 艾氏蛇鳗线粒体基因组结构特征 Tab. 1 Structural characteristics of the mitochondrial genome of Ophichthus evermanni |
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表2 艾氏蛇鳗13个蛋白编码基因碱基组成 Tab. 2 The base compositions of 13 protein-coding genes in Ophichthus evermanni |
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表3 13个蛋白编码基因密码子使用频率 Tab. 3 Frequency of codon usage in 13 protein-coding genes |
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图2 艾氏蛇鳗的总密码子含量 Fig. 2 Total codon content in Ophichthus evermanni |
与一般硬骨鱼类相似，艾氏蛇鳗的线粒体基因组中的核糖体RNA基因分别为12S rRNA和16S rRNA两种，二者均位于H链上的tRNA-Phe (F)和tRNA-LeuUUA (L1)之间，彼此间由tRNA-Val (V)隔开。12S rRNA序列长度为959 bp，在线粒体序列中的位置是69~1027 bp, 16S rRNA序列长度为1703 bp，在线粒体序列中的位置是1099~ 2801 bp。采用在线软件RNAfold分别预测了艾氏蛇鳗12S rRNA基因和16S rRNA基因的二级结构，发现2个rRNA基因的二级结构都相对比较保守，形成多个大小不一的茎环结构，其中12S rRNA的最小自由能为−224.40 kcal/mol, 16S rRNA的最小自由能为−366.50 kcal/mol。
艾氏蛇鳗的线粒体基因组共有22个序列长度在65~76 bp的转运RNA基因，且存在2个tRNA-Leu (L)和tRNA-Ser (S)，其反密码分别为tRNA-LeuUUA (L1)=TAA、tRNA-LeuCUA (L2)=TAG、tRNA-SerUCA (S1)=TGA、tRNA-SerAGC (S2)=GCT。tRNA-Phe (F)、tRNA-Val (V)、tRNA-LeuUUA (L1)、tRNA-Ile (I)、tRNA-Met (M)、tRNA-Trp (W)、tRNA-Asp (D)、tRNA-Lys (K)、tRNA-Gly (G)、tRNA-Arg (R)、tRNA-His (H)、tRNA-SerAGC (S2)、tRNA-LeuCUA (L2)和tRNA-Thr (T)位于H链上，其余8个tRNA基因位于L链上。除tRNA-SerAGC (S2)缺失二氢尿嘧啶臂(DHU臂)而不能形成三叶草结构，其他21个tRNA都具有典型的三叶草二级结构。这种三叶草结构包含了由14 bp碱基两两配对形成的氨基酸受体臂，以及8~10 bp碱基两两配对形成的反密码子臂、4~8 bp碱基两两配对形成的DHU臂、8~10 bp碱基两两配对形成的假尿嘧啶臂(TΨC臂)及其所连接的3个环：7 bp的反密码子环(tRNA-Thr和tRNA-Val为9 bp)、2~ 12 bp的DHU环和7 bp的TΨC环(tRNA-Cys为6 bp、tRNA-Phe为8 bp)。
2.5 非编码区艾氏蛇鳗的线粒体的非编码区包括3部分，即2个控制区control region，又称D-loop区，(diplacement-loop region)和1个L-链复制起始区，又称OL区(origin of L-strand replication region)。2个控制区长度分别为966 bp和965 bp，前者位于tRNA-Thr (T)和ND6基因之间，后者位于tRNA-Pro (P)和tRNA-Phe (F)之间，利用DNAStar软件包中的Megalign程序进行序列比对，基于Clustal W算法得到2个控制区的序列相似度为94.5% (图3)。长度为34 bp的OL区则位于5个tRNA基因簇(tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr)即“WANCY”区之间，与其两侧的tRNA-Cys和tRNA-Tyr分别存在4 bp和6 bp的间隔。3段非编码区总长为1965 bp，约占线粒体基因组全序列的11.06%。使用Mfold在线工具预测OL的二级结构如图4所示，这段DNA序列形成了一个茎环结构，茎和环的长度分别为22 bp和12 bp，未在该茎环结构的5ʹ端识别到其他鱼类中常见的保守功能序列Motif (5ʹ-GCCGG-3ʹ)。OL区碱基的使用表现出明显不对称性，环区G含量高达83.3%，茎区呈现出明显的C和G碱基偏倚，二者含量相同，均为45.5%。
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图3 艾氏蛇鳗两个D-loop区的序列比较 Fig. 3 Sequence comparison of two D-loop regions in Ophichthus evermanni |
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图4 艾氏蛇鳗轻链复制起始区的二级结构预测 Fig. 4 The predicted second structure of the origin of L-strand replication region |
将艾氏蛇鳗的线粒体基因组数据与GenBank中已公布的鳗鲡目鱼类mtDNA全序列进行比较，发现这些鱼类的线粒体基因组中都存在一个共同特征，即发生了基因重排(gene arrangement)现象[30-32]。由大多数鱼类线粒体基因的原始排列顺序ND5— ND6—tRNA-Glu—Cyt b—tRNA-Thr—tRNA-Pro— D-loop变为ND5—Cyt b—tRNA-Thr—D-loop1— ND6—tRNA-Glu—tRNA-Pro—D-loop2，即ND6基因和tRNA-Glu共同移到了tRNA-Thr和tRNA-Pro之间，且ND6基因上游还存在另一个具有较高同源性的D-loop区。
基于线粒体基因组的12个蛋白质编码基因(L链编码的ND6基因除外)，以星康吉鳗(Conger myriaster-MW788427)为外群，利用MEGA软件基于1000次自检重复构建了ML和NJ系统发育树，分析艾氏蛇鳗的系统进化关系如图5a和图5b所示。构建ML树之前，使用Modeltest软件挑选最佳核苷酸替代模型为TrN+I+G。两种分析结果均显示蛇鳗属与豆齿鳗属聚为一支，其中艾氏蛇鳗与短尾蛇鳗(O. brevicaudatus)和食蟹豆齿蛇鳗(P. cancrivorus)亲缘关系较近。鳄形短体鳗(B. crocodilinus)和大吻沙蛇鳗(O. macrorhynchos)单独聚为一支。黑斑花蛇鳗(M. maculosus)的聚类关系在两种进化树中略有不同，在ML树中，该鱼类聚在所有蛇鳗科鱼类的最外侧，而NJ树中则与鳄形短体鳗和大吻沙蛇鳗聚到一起，随后再与蛇鳗属和豆齿鳗属的鱼类相聚。
3 讨论 3.1 线粒体基因组序列分析本研究首次采用高通量测序技术，获得了长度为17759 bp的艾氏蛇鳗的线粒体基因组全序列，与已报道的其他脊椎动物相似，艾氏蛇鳗的线粒体基因组及其各组分的碱基含量均表现出高A+T和低G的偏向性，这可能与线粒体具有较高的非随机性碱基突变(主要为碱基替换)和选择压力有关[33]。有学者统计了20个门的609种动物的线粒体基因组GC含量在13%~49%[28]，本研究结果显示，艾氏蛇鳗G+C含量高于脊椎动物平均水平(33.7%)，推测该鱼类线粒体基因组中存在总长度为1931 bp的2个控制区片段，可能的原因为变异率高的非编码区所占比率较大[34]。密码子使用频率的不平衡现象也广泛存在于鱼类线粒体编码基因中，本研究发现，艾氏蛇鳗蛋白编码基因的密码子第3位点存在明显反G偏倚，但由于密码子第3位点所受的选择压力最小，密码子第1和第2位点对氨基酸构成起着决定性作用，氨基酸对碱基分布的限制性及相应密码子使用频率差异，成为了蛋白编码基因碱基分布不均衡的一个重要原因[35]。
RNA在生命活动中具有重要作用，如tRNA的运转功能、rRNA的组装功能及参与基因表达调控功能等，而RNA的功能又与其二级结构密切相关，通常来说，自由能越低代表其分子结构越稳定[36]。本研究中预测到艾氏蛇鳗的线粒体12S rRNA二级结构的最小自由能低于16S rRNA，表明艾氏蛇鳗12S rRNA基因比16S rRNA基因更加保守，与沙塘鳢(Odontobutis obscurus)[37]、兰州鲇(Silurus lanzhouensis)[38]、三角鲂(Megalobrama terminalis)[39]的相似。因此，12S rRNA也被用作DNA宏条形码(DNA metabarcoding)来进行鱼类鉴定和系统发育研究[40]。艾氏蛇鳗线的mtDNA中部分tRNA基因发生了碱基错配现象，且以G-U错配居多，这种碱基的错配在脊椎动物基因组中较为常见，可以借助后期的RNA编辑通过核苷酸取代转化为更稳定的碱基对进行纠正[41]。
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图5 基于线粒体基因组12个蛋白质基因序列构建的蛇鳗科鱼类ML (a)和NJ (b)系统发育树 Fig. 5 ML (a) and NJ (b) phylogenetic tree of the Ophichthidae fishes based on nucleotide sequences of 12 protein genes in mitochondrial genome |
从线粒体DNA的基因组成来看，艾氏蛇鳗与其他硬骨鱼类有较大不同，主要表现在非编码区包含了2个控制区(D-loop)和1个轻链复制起始区(OL)。2001年，Lee等[42]首次在花斑溪鳉(Rivulus marmoratus)的mtDNA中发现2个控制区，之后有研究报道，蛇鳗科其他鱼类如短尾蛇鳗[31]、圆身蛇鳗和大吻沙蛇鳗[43]、食蟹豆齿鳗和杂食豆齿鳗[44]中亦有该现象。作为线粒体基因组中最大的非编码区，控制区与线粒体DNA的转录与复制调控有着密切联系[45]。因此，控制区的倍增(duplication)或退化(degeneration)在进化上都具有非常重要的意义[46]。本研究中艾氏蛇鳗的2个控制区序列相似度很高，二者具有共同的起源。根据Boore对mtDNA重复控制区产生机制的3种解释，即串联重复(tandem duplication)、二聚化作用(dimerization)和异常重组(illegitimate recombination)[47]，推测蛇鳗科鱼类的共同祖先可能经历了一次DNA复制错误，通过滑动链错配或不精确终止的方式随机重复产生了含有双控制区的线粒体DNA。相较于1个控制区的线粒体基因组，蛇鳗科鱼类mtDNA的双控制区可以同步启动复制，能够在一次复制周期中获得更多的复制产物，具有更多的选择优势被自然选择保留了下来。目前在爬行动物、蛛形动物以及鸟类的研究中，发现线粒体双控制区既有协同进化(concerted evolution)模式[46,48-49]，即来自同一个体的并系同源拷贝具有更近亲缘关系；也有独立进化(independent evolution)模式[34]，即来自不同个体的直系同源拷贝亲缘关系更近；抑或是两种模式并存[50-51]。究竟艾氏蛇鳗选择哪种进化模式，需要在今后的研究中选择更多的样本个体进行比较分析。
除了基因组成发生变化，艾氏蛇鳗线粒体的基因排列顺序也发生了重排现象，即ND6基因和tRNA-Glu (E)转移到了tRNA-Pro (P)和D-loop2之间，D-loop1转移到ND6基因的上游。龚理等[52]对NCBI数据库中的一千余种鱼类线粒体基因组全序列进行分析发现，共有52种鱼线粒体基因组发生了重排，并将这些重排归纳为3种类型：滑移(shuffling)、移位(translocation)和倒置(inversion)。参考Lü等[31]和Zhang等[32]分别对短尾蛇鳗和海鳗线粒体基因重排现象的解释，推测造成艾氏蛇鳗基因重排的原因同样也是基因的随机重复和随机丢失(tandem duplication and random loss, TDRL)。
3.3 系统进化分析蛇鳗科(Ophichthyidae)广泛分布于热带和亚热带大陆架水域，依靠尖突的头部和尖秃骨化的尾端在砂土或珊瑚礁中潜穴。由于该类群数量众多且外形差异相对较小，给有效的物种鉴定和类群间的系统发育关系探讨带来了很大困难。由于单基因所包含的系统发育信息过少，且在不同生物群体中的系统重建能力不同，难以全面反映整个生物的分子进化水平，因此目前多采用联合基因分析的方法来进行系统进化分析[53]。本研究基于12个H链编码的蛋白质基因串联序列数据集，分别以ML法和NJ法构建艾氏蛇鳗系统发育树，结果表明两种方法建的分子进化树结构大致相同。蛇鳗属与豆齿鳗属亲缘关系较近，但同属鱼类并未聚到一起而是存在交叉，这与张稚兰等[54]采用线粒体CO I基因得出的结论相似。Filleul等[55]在研究海鲢总目(Elopomorpha)的单系性时，依据12S rRNA、16SrRNA和18S rRNA基因分析得出蛇鳗属是较为进化的类群，而Obermiller等[56]则认为该类群位于较原始的位置。本研究采用线粒体联合基因分析发现蛇鳗属鱼类在聚类树中较晚分化，支持前者的研究结论。然而，由于线粒体基因组不同区域的进化速率存在差异，所包含的系统发育信息也不尽相同，因此，对于蛇鳗科鱼类的系统进化关系和物种分类鉴定，还有待于采集更多鱼类样本并结合基因组学数据深入探索研究。
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