2022, Vol. 29 
2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081
3. 南京市水产科学研究所，江苏 南京 210017
2. Key Laboratory of Freshwater Fishes and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China
3. Nanjing Fishery Science Research Institute, Nanjing 210017, China
大口黑鲈(Micropterus salmoides)又名加州鲈，广泛分布于美国、加拿大等淡水水域，是一种生长快、易捕捞、适温较广和抗病能力较强的肉食性鱼类[1]。1983年，我国内地从台湾地区引进加州鲈，受到广大消费者的欢迎，其养殖规模不断扩大，目前全国淡水鲈年产量已超过4.7×106 t[2]，成为国内重要的淡水养殖品种之一。然而，大口黑鲈作为外来引进的养殖品种，在开展遗传改良和利用的过程中，需要对其群体开展准确的资源调查及种质评价，进而减少后期选育与种内杂交引起的遗传多样性降低及种质衰退等现象。
目前，常用于分析大口黑鲈群体遗传多样性的技术主要有：线粒体DNA标记[3]、随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA, RAPD)[4-5]、扩增片段长度多态性标记(amplified fragment length polymorphism, AFLP)[6]和微卫星(简单重复序列，simple sequence repeat, SSR)标记[7-12]等。其中，基于SSR标记和线粒体D-loop序列对大口黑鲈的遗传变异分析的研究较多。孙成飞等[7]和梁素娴等[12]利用SSR标记对国内的大口黑鲈养殖群体进行了遗传多样性和种质资源现状的研究，均发现国内大口黑鲈养殖群体的遗传多样性已显著下降，种资退化严重。樊佳佳等[9]和苏胜彦等[11]基于SSR标记对大口黑鲈国外引进群体和国内养殖群体的遗传多样性对比分析，均得出国外引进群体遗传多样性水平远远高于国内养殖群体的结论；李胜杰等[3]利用D-loop区序列的研究也发现国外群体遗传多样性水平远高于国内养殖群体。王佩佩等[8]对大口黑鲈北方亚种与佛罗里达亚种及“优鲈3号”的杂交F1进行微卫星的遗传多样性分析得到“优鲈3号♀×佛罗里达亚种♂”的杂交群体组合较优。蔡磊等[13]则是对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种及其作为亲本进行正交反交得到的2种杂交子代共4个群体进行微卫星遗传分析，并发现其反交组合(佛罗里达亚种♀×北方亚种♂)的子代更具有育种潜力；李镕等[10]采用微卫星标记技术分析不同世代大口黑鲈选育群体的遗传结构时发现，群体的遗传基础逐步趋向纯化。这些研究为大口黑鲈种质资源的保护、开发、利用和选育提供了丰富的遗传参考数据和背景知识。考虑到诸多大口黑鲈的遗传变异研究所用分子标记和群体各有不同，尤其是大口黑鲈作为外来引种物种，缺乏自然种质资源，且国内选育群体和养殖群体数量有限，因此，在开展遗传改良和利用过程中，有必要对现有种质材料遗传多样性开展研究。
2021年国家启动了第一次全国水产养殖种质资源调查，针对国内主要养殖与选育的大口黑鲈群体展开系统与深入的种质资源调查具有重要的现实意义。本研究中所选台湾群体作为早期中国台湾地区的选育种群，奠定了中国大口黑鲈养殖业的基础；“优鲈1号”于2010年通过国家水产新品种审定成为国内第一个大口黑鲈选育新品种[14]在全国各地广泛养殖；而“优鲈3号”则是以“优鲈1号”和北方亚种为基础育种，连续4代选育而来，相比于前者其生长优势更为显著[15]；本研究中选用的北方亚种是课题组于2020年从美国引进的原种群体，而北方亚种群体基因的纯合度要高于佛罗里达亚种，作为选育群体其后代基因型检出率会更高[13]；杂交群体为课题组以“优鲈3号”为母本，北方亚种为父本进行群繁得到的杂交选育种。本研究共选用5种大口黑鲈群体作为实验对象，通过线粒体D-loop部分序列和14个SSR标记对其进行遗传变异分析，旨在筛选出优质种质材料，进一步补充和完善我国大口黑鲈群体的种质资源信息，为大口黑鲈养殖群体种质改良和新品种培育提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 实验材料与DNA提取实验所用的5个大口黑鲈群体(表1)收集于广州与江苏等地的大口黑鲈良种繁育场，分别为：从中国台湾地区引进的台湾养殖群体(台湾群体，CTW)、从美国引进的大口黑鲈北方亚种US、由珠江水产研究所选育的养殖品种(“优鲈1号”YL1、“优鲈3号”YL3)和本课题组自行培育的杂交品种(“优鲈3号”♀×北方亚种♂, HBY)。分别在以上5个群体中随机选取35尾大口黑鲈，共175尾，剪取尾鳍，放置于预先备好的装有90%乙醇的2 mL离心管中，于−20 ℃冰箱保存。样本基因组DNA参照苯酚-氯仿法提取，再通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经由NanoDrop分光光度仪检测其纯度和浓度，最后保存于−20 ℃备用。
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表1 大口黑鲈样本信息 Tab. 1 Sampling information of Micropterus salmoides |
基于GenBank上大口黑鲈的SSR序列信息，通过PrimePremier 6.0软件设计引物(表2)。正向引物的5ʹ端用FAM或HEX荧光基团标记，委托翼和应用生物技术有限公司(江苏无锡)合成。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增体系为10 μL，具体包括10×Buffer 1 μL, DNA模板1.5 μL, dNTP 0.8 μL, ddH2O 5.4 μL，正、反向引物各0.5 μL, Taq酶0.3 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性2 min后进入40个循环，94 ℃, 30 s；退火温度见表2, 90 s; 72 ℃, 1 min，循环结束后72 ℃再延伸10 min。SSR基因分型检测委托翼和应用生物技术有限公司完成。
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表2 大口黑鲈14个微卫星标记的引物信息 Tab. 2 Primer information of 14 microsatellite markers for Micropterus salmoides |
根据GenBank上大口黑鲈线粒体基因组序列(DQ536425.1)设计该实验中的引物，上下游引物序列分别为DF1: 5′-AGGCTGGCTGGAGAACAA-3′, DF2: 5′-ACGGGTGTGCGGATACTT-3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
PCR扩增体系为30 μL，包括15 μL PCR Master MIX [成分：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、20 μmol/L dNTP each、Taq DNA聚合酶0.05 U/μL、ddH2O、其他稳定剂和增强剂]、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板(50 ng/μL) 2 μL, 11 μL ddH2O。所用PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性40 s, 58 ℃复性55 s, 72 ℃延伸1 min，扩增36个循环；72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后送至无锡亦欣生物科技有限公司，通过ABI3730测序仪进行双向测序。
1.3 数据分析 1.3.1 微卫星标记分析使用Popgene1.32软件[16]分析单个SSR位点在样本整体的等位基数(Na)、有效等位基数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon’s多样性指数(I)、群体间遗传距离(Da)、遗传相似度(S)、各位点近交系数(FIS)和遗传分化系数(FST)。应用Powermarker 3.0软件[17]计算各位点的多态性信息含量(PIC)，并基于等位基因频率的Nei’s遗传距离利用MEGA5.0[18]构建群体间的UPGMA聚类树。使用Genalex 6.41软件[19]分析每个群体的群体内近交系数(F)、特有等位基因(private allele)、分子遗传变异方差分析(AMOVA)、遗传分化指数(FST)和主坐标分析(PCoA)。最后再利用STRUCTURE2.0软件[20]进行绘制遗传结构图。
1.3.2 D-loop部分序列分析使用BioEdit7.0软件[21]和Clustal X 1.8软件分别进行序列编辑和比对。通过DnaSP 5.0软件[22]计算多态性位点数(S)、单倍型数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)、平均核苷酸差异数(K)和Tajima’s D等遗传多样性参数。利用Arlequin3.5软件[23]开展核苷酸组成分析、遗传分化指数(FST)计算和分子遗传变异方差分析(AMOVA)等。基于群体间的Kimura双参数模型(Kimura 2 parameter, K2P)遗传距离通过MEGA5.0[18]软件构建邻接(Neighbor-Joining, NJ)进化树。基于单倍型位点变异和在群体间的分布情况，通过Network 4.6软件[24]构建单倍型的简约中介(Reduce-Median MJ)网络图。
2 结果与分析 2.1 遗传变异特征及群体动态分析本实验选用14对SSR引物扩增5个大口黑鲈群体，共得到166个个体的有效扩增和分型。结果表明，14对引物在5个群体中均能扩增到目的条带，并体现出不同程度的多态性(表3)。其中等位基因数(Na)为3~19个；有效等位基因数(Ne)为1.01~4.24; Shannon’s多样性指数(I)为0.041~ 1.892；观测杂合度(Ho)为0.012~0.599；期望杂合度(He)为0.012~0.767；多态信息含量(PIC)为0.012~0.741，其中5个位点(LMB24、LMB28、LMB38、LMB39、LMB42)属于高度多态水平(PIC> 0.5)。参考结合F统计量分析发现：FIS共有2个位点出现负值，LMB24的值最大；FIT只有1个位点出现负值，LMB10和LMB24位点的值超过0.5；群体间的FST均低于0.5，群体间的基因流(Nm)值在1.253~13.854之间。
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表3 基于14个微卫星位点对5个大口黑鲈群体遗传多样性的检测结果 Tab. 3 Genetic diversity of 5 Micropterus salmoides populations detected by 14 microsatellite loci |
5个大口黑鲈群体的遗传多样性参数见表4。群体的平均Na由高到低依次为：北方亚种、“优鲈3号”、杂交群体、台湾群体和“优鲈1号”。北方亚种群体的平均Na、Ne、I、Ho、He和PIC均为最高(Na=6.733, Ne=3.223, I=1.210, Ho=0.439, He=0.568, PIC=0.514)，而“优鲈1号”平均Na、Ne、I、Ho、He和PIC均为最低(Na=2.800, Ne=1.670, I= 0.567, Ho=0.263, He=0.310, PIC=0.278)。综合上述参数，表明北方亚种群体的遗传多样性最高，其他4个群体遗传参数较为接近，遗传多样性较低。
经测序共得到165尾大口黑鲈个体的D-loop序列。其中核苷酸组成显示：A+T的含量(62.3%)明显高于C+G的含量(37.7%)。通过序列分析对比，共检测到23个变异位点，27个单倍型(表5)。在27个单倍型中H01为优势单倍型，占个体总数的65.5%。台湾群体(CTW)、“优鲈3号”(YL3)和“优鲈1号”(YL1)群体都是优势群体，占有率分别为85.7%、83.9%和82.9%。各群体的单倍型多样性(Hd)为0.218~0.882，核苷酸多样性(π)为0.0004~ 0.0034。其中北方亚种群体(US)的遗传多样性水平最高(Hd=0.882, π=0.0034), “优鲈1号”(YL1)单倍型多样性最低(Hd=0.218, π=0.0004)。中性检验显示，5个大口黑鲈群体Tajima’s D值均为负值，其中“优鲈3号”(YL3)、杂交群体(HBY)显著偏离中性检验(P<0.05)(表4)。
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表4 大口黑鲈微卫星标记和D-loop序列的遗传多态性参数 Tab. 4 Genetic diversity parameters of microsatellite markers and D-loop sequences in five Micropterus salmoides populations |
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表5 大口黑鲈5个群体D-loop单倍型分布情况 Tab. 5 Distribution of the haplotypes in five Micropterus salmoides populations |
根据微卫星标记的遗传分析(表6)显示，“优鲈3号”群体和杂交群体的遗传距离最近(Da= 0.016)，北方亚种群体与“优鲈3号”群体遗传距离最远(Da=0.300)，其次为杂交群体(Da=0.293)；北方亚种群体与“优鲈3号”群体的遗传一致性最低(S=0.741)，杂交群体与“优鲈3号”群体遗传一致性最高(S=0.985)。依据D-loop部分序列的遗传分析，5个大口黑鲈群体间的K2P遗传距离为0.000~ 0.012 (表7)，其中“优鲈1号”(YL1)、“优鲈3号”(YL3)和台湾群体(CTW)群体K2P遗传距离最近，北方亚种(US)群体与其他4个群体K2P遗传距离最远。
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表6 5个大口黑鲈群体间Nei’s遗传距离(对角线以下)和遗传一致性(对角线以上) Tab. 6 Nei’s genetic distance (below diagonal) and genetic consistency (above diagonal) of the five Micropterus salmoides populations |
基于以上遗传距离构建的UPGMA聚类树(图1)显示，“优鲈1号”、“优鲈3号”、杂交群体和台湾群体最先聚类，最后再与北方亚种聚类。根据168尾大口黑鲈个体间的遗传距离构建的基于Nei’s遗传距离的NJ聚类树(图2)显示北方亚种群体形成一个明显的群体分支；其他4个群体呈现出镶嵌式排列。
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表7 大口黑鲈群体间K2P遗传距离(左下角)和遗传分化指数FST (右上角) Tab. 7 Pairwise K2P genetic distances (below diagonal) and fixation indexes (FST, above diagonal) among Micropterus salmoides populations |
09-1277-13-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 5个大口黑鲈群体基于微卫星标记(a)和D-loop序列(b)遗传分析的UPGMA聚类树 Fig. 1 The UPGMA trees among five Micropterus salmoides populations based on microsatellite markers (a) and D-loop sequences (b) |
对5种大口黑鲈的遗传方差分析(AMOVA)显示(表8)，基于SSP位点变异，群体中有20%的遗传变异来自群体间，80%的遗传变异来自群体内，遗传分化指数为0.200；基于D-loop序列变异，群体间和群体内的方差组分占79.13%和20.87%，群体间遗传分化指数为0.7913。
2.3 遗传结构及单倍型网络图根据大口黑鲈个体间遗传距离的二维主坐标分析(PCoA)结果(图3)显示，北方亚种群体内的个体与其他4个群体内的个体存在显著差异，而“优鲈3号”、“优鲈1号”、杂交群体和台湾群体4个群体内的个体间遗传差异较小。
09-1277-13-F002.jpg "点击查看原图") |
图2 基于Nei’s遗传距离构建的168尾大口黑鲈个体的NJ聚类树 Fig. 2 NJ tree of 168 Micropterus salmoides individuals based on Nei’s genetic distance |
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表8 5个大口黑鲈群体基于微卫星位点和D-loop序列的AMOVA分析 Tab. 8 Analyses of molecular variance (AMOVA) based on microsatellite markers and D-loop sequences in five Micropterus salmoides populations |
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图3 大口黑鲈个体基于遗传距离的主坐标分析 Fig. 3 Principal coordinate analysis based on genetic distance among Micropterus salmoides individuals |
利用Structure2.0软件进行大口黑鲈群体遗传结构分析，K设定为1~20，每个K重复运行3次得到ΔK随K变化曲线，发现当K=2时，此时ΔK=1500，出现峰值，推断该研究所有参试个体最佳分组为2个理论群。优鲈3号群体、优鲈1号群体、杂交群体和台湾群体聚为一组，北方亚种群体聚为另一组(图4)。
图5 为基于单倍型构建的大口黑鲈网络图。群体间分享单倍型现象明显，且在27个单倍型中优势单倍型明显，其中“优鲈1号”(YL1)、“优鲈3号”(YL3)、台湾群体(CTW)和杂交群体(HYB)均有1个共享单倍型(H01)，北方亚种(US)与其他群体共享单倍型较少，只与杂交群体(HYB)共享一个单倍型(H09)，遗传分化距离也较远。
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图4 大口黑鲈5个群体的遗传结构图(K=2) Fig. 4 Genetic structure map of 5 populations of Micropterus salmoides (K=2) |
09-1277-13-F005.jpg "点击查看原图") |
图5 大口黑鲈D-loop区27个单倍型网络结构图 Fig. 5 The haplotypes network of D-loop region of Micropterus salmoides |
实验中所用的14对微卫星引物的PIC介于0.012~0.741，根据Botstein等[25]的划分标准，其中3个位点(LMB10、LMB15、LMB16)属于低度多态位点(PIC<0.25), 6个位点(LMB03、LMB07、LMB22、LMB30、LMB37、LMB40)属于中度多态位点(0.25<PIC<0.5), 5个位点(LMB24、LMB28、LMB38、LMB39、LMB42)属于高度多态位点(PIC> 0.5)。群体中北方亚种平均等位基因数和平均杂合度均高于其他4个群体，且PIC为0.514，与樊佳佳等[9]检测的北方亚种的PIC相似(PIC= 0.5546)，这表明新引进的北方亚种群体保留了较高的遗传多样性水平，具有较高的选育空间和潜力。其他4个群体的PIC处于中度多态性(0.278< PIC<0.359)，与孙成飞等[7]和樊佳佳等[9]所测得的国内养殖群体的多态信息含量相近(PIC=0.321、PIC=0.379)，表明国内养殖群体在经历过多代选育后种质退化较为严重。
在本研究的5个群体中，测得的观测杂合度(Ho)均低于期望杂合度(He)，这表明存在杂合子缺失现象，在鲤(Cyprinus carpio)[26]、白甲鱼(Onychostoma sima)[27]、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)[28]等物种中也存在类似现象，而这一现象可能与无效等位基因、群体中性别比例不均衡、近交以及选育过程中人为干扰过多有关。遗传距离和一致性的分析结果均显示北方亚种群体与“优鲈3号”群体的遗传距离最远(Da=0.3003)，遗传一致性最低(S=0.741)，表明这两个群体间亲缘关系最远，遗传分化水平较高，两个群体间开展杂交育种可能具有较强的潜力。其中台湾群体与“优鲈1号”群体遗传距离最近(Da=0.02)，这与苏胜彦等[11]研究结果相一致，说明“优鲈1号”群体可能是台湾群体引进后本地化选育的结果，或是2个养殖群体具有相似的育种或遗传改良路径。因此，对于人工累代繁育引起的遗传多样性降低的群体，应进行科学的引种，并建立有效的良种保护，可在一定程度减少国内群体的种质匮乏与混杂。
3.2 基于线粒体D-loop序列的大口黑鲈群体遗传多样性结合对大口黑鲈5个群体的D-loop区序列(811 bp)分析表明，A+T含量为62.3%, C+G的含量为37.7%，结果与李胜杰等[3]对3个大口黑鲈群体的线粒体D-loop基因序列分析结果相似，与其他鲈形目鱼类如宝石鲈(Scortum barcoo)[29]、松江鲈(Trachidermus fasciatus)[30]的研究结果一致，也符合脊椎动物mtDNA碱基的含量分布[31]。
物种的遗传多样性越高，其适应能力和生存能力就越强，育种和遗传改良的潜力就越大，贫乏的遗传多样性则会影响物种的进化和生存及种质资源的利用和保护[3]。就单倍型多样性和核苷酸多样性而言，北方亚种的单倍型多样性和核苷酸多样性水平相对较高(Hd=0.882, π=0.0034)，杂交群体次之(Hd=0.414, π=0.0008)；台湾群体、“优鲈1号”和“优鲈3号”群体最低(0.218<Hd<0.299, 0.0004<π<0.0005)，而这3个养殖群体在我国广泛分布，具有一定代表性，所测得的核苷酸多样性与李胜杰等[3]分析得到国内养殖群体的核苷酸多样性(Hd=0.400, π=0.0005)相似，可见国内养殖群体遗传多样性已显著下降(P<0.05)，这与引种时奠基种群较少或基础种群没有得到及时补充与更新，以及选育和引种群体时间较长有关。同时，5个群体中的核苷酸多样性水平较低，单倍型多样性水平较高，这与鲤[26]、宝石鲈[29]、松江鲈[30]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)[32]、刀鲚(Coilia nasus)和湖鲚(Coilia nasus taihuensis)[33]等其他鱼类的研究结果相似，表明在短时间内群体的单倍型多样性比核苷酸多样性更容易积累。
遗传距离和种群分化指数是衡量群体间分化程度的重要指标，两者数值越大，群体多态性越高。本研究实验结果表明，5个群体间的遗传距离为0.000~0.012，这与青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii Kessler)[34]和斑鳜(Siniperca scherzeri)[35]的遗传距离(0.011~0.019, 0.007~0.010)相似，表明该群体间的遗传分化程度不大，遗传变异水平较低。北方亚种和其他4个群体遗传分化指数(FST)在0.8179~0.8359之间，其他4个群体间遗传分化指数(FST)在−0.0143~0.0115之间。根据Ballouxd[36]估计种群遗传分化的标准，北方亚种群体与其他4个群体遗传分化程度极大，表明在长期的人工养殖下大口黑鲈种质退化严重，有必要从国外引种以丰富国内养殖群体，而通过引进与补充国内养殖群体的种群数量是缓解种质退化的有效方法。此外，该研究群体间的K2P遗传距离也与NJ聚类的结果相符合，表明北方亚种群体遗传多样性高，遗传距离相对较远，利用北方亚种与其他群体开展杂交显得更具有潜力，其他4个群体间存在着广泛的基因交流，没有形成较为明显的遗传分化，维持了较近的亲缘关系。
3.3 综合两种分析方法分析5个大口黑鲈群体的遗传多样性根据对5个大口黑鲈群体的SSR标记和线粒体D-loop序列的分析，均显示5个群体中北方亚种群体的遗传多样性水平较高，其他4个群体(台湾群体、“优鲈1号”、“优鲈3号”和杂交群体)的遗传多样性水平较低。群体遗传分化指数和AMOVA分析结果表明北方亚种群体与其他4个群体间(台湾群体、“优鲈1号”、“优鲈3号”和杂交群体)均存在极显著的遗传分化。SSR标记和线粒体D-loop部分序列变异在遗传距离以及AMOVA方差组分估算上所表现的不同，与两者所遵循不同的遗传模式有关[37]。基于线粒体D-loop序列单倍型网络图分析表明，单倍型明显分为2个分支，具有明显的群体特异性(北方亚种所特有的单倍型为一支，“优鲈1号”、“优鲈3号”、台湾群体和杂交群体为另一支)，与遗传结构图(K=2)、PCoA和基于Nei’s遗传距离构建的大口黑鲈个体UPGMA聚类树分析结果相符合，表明北方亚种与其他4个群体遗传差异较大，遗传结构相对独立，也进一步说明了“优鲈1号”、“优鲈3号”、台湾群体和杂交群体间存在一定程度上的遗传混杂现象。
4 结论本研究采用SSR标记和线粒体D-loop序列对5个大口黑鲈群体的遗传多样性进行分析，结果表明，引进的北方亚种群体保持了较高的遗传多样性水平，并与国内养殖群体间存在极显著遗传分化，基于北方亚种群体开展群体选育或与其他群体开展杂交育种具有较好的应用前景。
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