梭子蟹科是海洋生态系统中的重要生物类群，其物种数较多，具有重要的经济和生态地位^[1-3]。因生命周期较短，其早期生活史过程易受环境变化影响，并进一步影响渔业群体资源量^[4]，研究其早期生活史过程及对环境的响应机制对解析其资源动态机制，加强资源的保护、管理与科学利用具有重要意义。长期以来，国际上对包括梭子蟹科在内的海洋蟹类的早期生活史过程已经做了不少探索。以形态学鉴定为基础^[5-7]，就亲蟹繁殖、幼体发育、生长、死亡、栖息地分布、幼体输运等诸多个方向开展了工作^[8-17]，特别对个别重要经济梭子蟹科种类如蓝蟹(Callinectes sapidus)，对其早期生活史进行了较为系统和深入的研究，为蓝蟹资源的管理与开发奠定了科学基础^[18-20]。而在国内，数十年以来对海洋蟹类早期生活史的基础研究十分薄弱，目前仅有对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、日本蟳(Charybdis japonica)、天津厚蟹(Helice tientsinensis)等少数蟹类幼体发育过程的零星报道^[21-28]，梭子蟹科及其他海洋蟹类幼体发育信息不全，幼体形态鉴定资料匮乏，导致其早期生活史的系统研究无法开展。目前国内学术界仅对长江流域淡水蟹类中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的早期补充有一些报道^[29-32]，不利于对海洋梭子蟹科等生物资源的科学保护、合理开发与可持续利用。

黄海海州湾及邻近水域是梭子蟹科种类的重要产卵场和育幼场，渔业生态地位十分重要。本研究以该水域2018年春夏季鱼类浮游生物与环境大面综合调查获得的梭子蟹类幼体样品为基础，利用线粒体CO I基因测序和形态学方法开展梭子蟹科幼体生物多样性和分类鉴定的研究，探索建立梭子蟹科溞状幼体不同发育阶段的形态学检索表，旨在建立和完善基于形态学方法的梭子蟹类幼体物种鉴定标准，为系统开展三疣梭子蟹、日本蟳等经济梭子蟹类资源的早期生活史研究，科学保护和开发梭子蟹类生物资源提供基础。

大面调查于2018年5月下旬至8月上旬于黄海海州湾及邻近水域进行，共6个航次，每半月进行1次。其中前4个航次设置49个站位，后2个航次设置31个调查站位(详见图1)，在各个站位进行蟹类幼体丰度与环境观测。生物样品采集使用大型浮游生物网(网口直径130 cm，网目孔径0.505 mm，网衣长470 cm)进行，每个站位以3 kn左右船速拖网10 min，网口系流量计以校正滤水量。海洋环境观测利用CTD进行(型号：德国Sea & Sun Technology公司CTD-75M型)，以获取温度、盐度的垂直剖面数据。生物样品采集后现场马上利用95%乙醇进行固定，调查结束后带回实验室，在体视显微镜下挑出蟹类幼体样品，进行后继处理与分析。

图1

图1 　大面调查站位分布 Fig. 1 　The sampling stations of field survey

为精确鉴定蟹类物种，及检验幼体形态学鉴定的准确性，利用分子生物学方法对样品进行检验。

实验使用南京诺唯赞有限公司的细胞、组织DNA纯化试剂盒(Fast Pure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit)进行DNA提取。将幼体样品在1.5 mL灭菌离心管中用研磨棒碾碎，加入20 μL Proteinase K组织酶解液，55 ℃下金属浴消化过夜，使用洗脱剂进行蛋白质和离子洗脱并重复2次纯化DNA。将吸附柱置于灭菌离心管中，使用预热到70 ℃的洗脱缓冲液收集DNA至离心管。成蟹样品剪取螯足肌肉用于DNA收集。使用Nanodrop 2000分光光度计检测DNA的浓度和纯度。CO I基因序列扩增使用无脊椎动物通用引物LCO1490和HCO2198^[33]，由华大基因科技股份有限公司合成：

LCO1490: 5ʹ-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3ʹ

HCO2198: 5ʹ-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3ʹ

PCR反应体系总体积为25 μL，包括2×Easy Taq Mix 12.5 μL, LCO1490和HCO2198引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板2.5 μL，双蒸水8 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性15 s, 49 ℃退火45s, 72 ℃延伸45 s，循环35次；最后72 ℃延伸10 min。

将测序得到的CO I基因序列在DNAstar软件中进行比对分析，查看序列峰图，将不可信区域切除。将处理好的线粒体CO I基因序列在数据库中比对获取物种的鉴定结果。将处理后的蟹类幼体序列与成体蟹类序列进行比对以进一步进行验证。使用DNAsp软件对所有序列进行统计，分析蟹类幼体样品CO I基因序列的单倍型数量以及遗传多样性。基于Kimura 2-parameter算法在MEGA软件中计算蟹类幼体单倍型间的遗传距离，构建NJ系统发育树，采用bootstrap法重复1000次检验各分支的置信度，分析3种蟹类的系统发育与亲缘关系。

对6个航次调查获得的蟹类溞状幼体和大眼幼体样品中，首先选取整体完整、形态清晰的蟹类幼体150余个进行形态学观察和记述，利用尼康SMZ18体视显微镜及CCD图像采集系统进行幼体图像采集，随后进行线粒体CO I基因测序，以确定出现的梭子蟹科物种。

参照孙颖民等^[23]和廖永岩等^[24]对三疣梭子蟹、阎愚等^[28]对日本蟳、及Hwang等^[33]对双斑蟳幼体发育各期的描述，同时参考廖永岩等^[25]对远海梭子蟹(Portunus pelagicus)幼体发育各期的描述(海州湾虽无分布，但与三疣梭子蟹亲缘关系较近，可作为三疣梭子蟹形态学参考)，在Nikon E-200型体视显微镜下，对分子测序确认的3种梭子蟹科幼体种类进行形态观察，筛选典型形态特征建立物种的形态分类检索表。

梭子蟹科不同物种幼体发育过程不同。其中，三疣梭子蟹幼体发育经历4期溞状幼体和1期大眼幼体^[23]，日本蟳经历6期溞状幼体和1期大眼幼体^[28]，双斑蟳有7期溞状幼体和1期大眼幼体^[33]。为检验形态分类检索表的分类效果，考虑不同物种形态识别难度的差异，在8月航次的样品中形态鉴定和挑选三疣梭子蟹溞状幼体80个(每期20个)，日本蟳溞状幼体24个(每期4个)，双斑蟳溞状幼体70个(每期10个)，进行CO I基因序列测定以验证形态学分类准确性。对梭子蟹科大眼幼体14个进行基因测序定种，进行形态学初步观察。后期共对188个梭子蟹科幼体进行了分子生物学测序分析。

结果显示，调查海域5―8月梭子蟹科幼体共出现3种，三疣梭子蟹、日本蟳和双斑蟳。其中双斑蟳的数量占据绝对优势。

海洋蟹类幼体形态包括头胸甲，头部附肢(第1触角、第2触角、大颚、第1小颚、第2小颚)，胸部附肢(第1颚足、第2颚足、第3颚足、步足)，腹节及游泳足(pleopods)，和尾节部分。3种蟹类溞状幼体形态如图2~4所示。

图2

图2 　三疣梭子蟹溞状幼体形态 Fig. 2 　Zoeas of swimming crab, Portunus trituberculatus

图3

图3 　日本蟳溞状幼体形态 Fig. 3 　Zoeas of swimming crab, Charybdis japonica

图4

图4 　双斑蟳溞状幼体形态 Fig. 4 　Zoeas of swimming crab, Charybdis bimaculata

蟹类幼体每发育一个阶段都经历一次蜕皮。梭子蟹类溞状幼体不同发育阶段的形态分类指标主要包括体长、颚足外肢末端羽状刚毛数、尾凹上的刚毛数、步足萌芽时期、腹肢萌芽时期等。

根据对3种梭子蟹科溞状幼体形态观察结果，建立该科溞状幼体分类检索表如下：

1 (2) 尾叉外缘小刺极小或不可见....日本蟳；

2 (1) 尾叉外缘小刺明显可见；

3 (4) 背棘与额棘长而细，背棘末端显著弯成钩状................................................三疣梭子蟹；

4 (3) 背棘与额棘短而粗，背棘末端不呈钩状................................................................双斑蟳。

188个开展分子和形态鉴定的幼体样品中，有179个样品两种鉴定结果相一致。该179个CO I基因序列共有67个单倍型，单倍型的多样性(Hd)为0.904，多样性方差为0.00014，共176个变异位点。所有序列在数据库中比对结果相似度均高于99%。

基于179条蟹类幼体基因序列和6条预实验的蟹类成体基因序列，利用185条CO I序列进行聚类分析显示，75个三疣梭子蟹幼体、27个日本蟳幼体、77个双斑蟳幼体序列都与各自成体聚为独立的分支，置信度为99%。

对鉴定到种的67个CO I基因单倍型进行分析显示，三疣梭子蟹的种内遗传距离0.000~0.034，平均为0.004；双斑蟳的种内遗传距离0.000~ 0.139，平均为0.067；日本蟳的种内遗传距离0.000~0.015，平均为0.000。种间遗传距离中，三疣梭子蟹与双斑蟳间为0.189~0.204，平均0.195；三疣梭子蟹与日本蟳间为0.179~0.205，平均0.182；双斑蟳与日本蟳间为0.133~0.141，平均0.138。总体种间遗传距离约为种内遗传距离的51倍。

80个形态鉴定为三疣梭子蟹溞状幼体的样品中，75个个体分子鉴定验证为正确，有I期溞状幼体4个被错认为日本蟳、1个被错认为双斑蟳，准确率93.75%; 24个形态鉴定为日本蟳的溞状幼体样品分子验证结果正确，准确率100%; 70个形态鉴定为双斑蟳溞状幼体的样品有68个分子验证结果正确，有2个I期溞状幼体分别被错判为三疣梭子蟹和日本蟳，准确率97.14%。

14个梭子蟹科大眼幼体中，三疣梭子蟹仅1个，其余为日本蟳和双斑蟳大眼幼体。

本研究结果显示，调查海域5―8月梭子蟹科幼体仅出现三疣梭子蟹、日本蟳和双斑蟳3种。虽然体长、颚足外肢末端羽状刚毛数、尾凹上的刚毛数、步足萌芽时期、腹肢萌芽时期等特征是各物种溞状幼体不同发育阶段记述的主要形态特征(表1)，但本研究结果显示尾叉外缘小刺、背棘与额棘形状是鉴别黄海中部梭子蟹科这3种溞状幼体的有效形态特征，据此对其进行形态分类具有很高的实用性和准确度。3种梭子蟹类溞状幼体形态分类皆达到较高的精度，个别误判发生于三疣梭子蟹和双斑蟳的I期溞状幼体阶段，这可能与该发育期幼体个体较小，及观察角度不同、个别个体形态完整性受损等因素有关。

表1

表1 　4种梭子蟹及2种方蟹溞状幼体主要形态特征 Tab. 1 　Morphological characteristics of zoeas of four Portunidae crabs and two Grapsidae crabs 种类species 期别stage 第1颚足外肢末端羽状刚毛数terminal plumose setae of exopod of the first maxilliped 第2颚足外肢末端羽状刚毛数terminal plumose setae of exopod of the second maxilliped 尾凹刚毛数setae of telson forks 步足萌芽时期 periopods development stage 腹肢萌芽时期 pleopods development stage 数据来源reference 梭子蟹科 Portunidae 三疣梭子蟹 Portunustrituberculatus Ⅰ 4 4 6 Ⅱ Ⅲ [23] Ⅱ 6 6 6+2* Ⅲ 10 10-11 6+2 Ⅳ 13-14 14-16 6+3 远海梭子蟹 Portunuspelagicus Ⅰ   4 6 Ⅱ Ⅲ [25] Ⅱ 8 8 6+2 Ⅲ 10 10 6+2 Ⅳ 12 13-14 6+3 Ⅴ 12 14 6+3 日本蟳 Charybdisjaponica Ⅰ 4 4 6 Ⅳ Ⅴ [28] Ⅱ 6 6 6+2 Ⅲ 8 8 6+3 Ⅳ 9-1011-12 10-1113-14 6+36+3 Ⅴ 13-14 15-16 6+4 Ⅵ       双斑蟳 Charybdisbimaculata Ⅰ 4 4 6 Ⅴ Ⅵ [33] Ⅱ 6 6 6+2 Ⅲ 8 8 6+2 Ⅳ 10 10 6+2 Ⅴ 12-13 12-13 6+2 Ⅵ 14-15 14-15 6+2 Ⅶ 16-18 16-18 6+3 方蟹科 Grapsidae 狭额绒螯蟹 Eriocheirleptognathus Ⅰ 4 4 6 Ⅲ Ⅲ [22] Ⅱ 6 6 6 Ⅲ 8 8 8 Ⅳ 10 10 8 Ⅴ 12 12 8 天津厚蟹 Helicetientsinensis Ⅰ 4 4 6 Ⅳ Ⅳ [21] Ⅱ 6 6 6 Ⅲ 8 8 8 Ⅳ 10 10 8 Ⅴ 12 12 10 注：6+2*表示尾叉内缘刚毛数为6，尾凹中部刚毛数为2. Note: 6+2* means that 6 setae on the inner edge of the tail fork, and 2 setae in the middle of the caudal concave.

表1 　4种梭子蟹及2种方蟹溞状幼体主要形态特征 Tab. 1 　Morphological characteristics of zoeas of four Portunidae crabs and two Grapsidae crabs

本研究仅针对黄海中部局部海域春夏季节，样品生物多样性存在调查时空范围较小的局限性。2018年度相关海域的调查涉及5月下旬至8月上旬共6个航次，经初步分子生物学鉴定，梭子蟹科幼体仅出现上述3个物种，因此本研究结果可初步作为本区域蟹类幼体形态鉴定的标准应用于后续研究。

有报道认为，三疣梭子蟹幼体发育过程中有可能存在第Ⅴ期个体^[23]。本研究样品处理过程中，亦发现有疑似个别三疣梭子蟹溞状幼体，体长明显大于Ⅳ期个体。限于样品数量不足，未对此进行深入分析，并在本研究中继续使用了三疣梭子蟹溞状幼体4期划分标准^[23-24]。后续工作将开展专项调查补充研究样品，借助形态学观测、分子测序等手段，进一步确认三疣梭子蟹幼体发育的基本过程。

国际上对海洋蟹类幼体形态分类已有一些研究报道。幼体头胸甲形态，额棘、背棘及侧棘的有无、朝向、长度和粗细程度，头部附肢、胸部附肢的结构和形态，各部位刚毛模式，尾节形状及侧棘情况等一系列复杂的形态学特征已被用于一些海域蟹类溞状幼体分类鉴定^[34-36]。由于海洋蟹类区系、种类繁多，幼体变态复杂，且大部分物种没有早期发育的形态记述，目前在天然海域直接通过形态观察手段建立各个物种幼体的形态鉴定标准极为困难。线粒体CO I基因测序作为成熟的生物分子分类手段已广泛地应用于生物类群的辅助鉴定^[32]。本研究中，笔者借助此方法准确地获得了研究海域梭子蟹科溞状幼体的种类多样性特征，经过比对分析，建立了3种梭子蟹科溞状幼体形态分类检索表。在研究早期阶段，线粒体CO I基因测序可作为海洋蟹类等无脊椎动物幼体形态鉴定标准构建的有力辅助工具。通过分子生物学分类和形态学观察相结合，逐步构建系统的中国海洋蟹类幼体形态分类记述及检索系统，是未来蟹类早期生活史基础研究的重要方向。同时，本研究采集3种梭子蟹类大眼幼体数量较少，未能就大眼幼体阶段建立形态检索系统，这可能与海洋蟹类幼体一般具有昼夜垂直迁移习性，常常在夜间上浮到近表层，白天则栖息于水体底部^[37]，常规的白天水平拖网调查难以采到样品有关。