2023, Vol. 30 
2. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江省特殊生境鱼类种质特性与抗逆育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070
3. 深圳华大基因股份有限公司，广东 深圳 518083
4. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306
2. National and Local Joint Engineering Laboratory for Freshwater Fish Breeding; Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Heilongjiang Province’s Key Laboratory of Fish Stress Resistance Breeding and Germplasm Characteristics on Special Habitat; Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China
3. BGI Genomics, BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, China
4. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
据统计，全球目前约有盐碱地970 Mhm2，主要分布在俄罗斯、澳大利亚和南美洲等地，至少覆盖100个国家和地区[1]。我国盐碱地面积约为99130 khm2，其中低洼盐碱水域45870 khm2，约占全国湖泊总面积的55%，大部分盐碱水域由于高碱度、高pH、离子组成复杂而处于荒置状态，利用率极低[2-3]。研究发现，${\rm{HCO\bar 3}}$和${\rm{CO}}_3^{2 - }$是影响水体碱度的主要离子，直接或间接作用于鱼类的组织器官，造成器质性损伤和结构变化[4-5]，进而引发鱼类出现呼吸和代谢碱中毒，严重影响鱼类的生长、繁殖和存活[6-7]。
瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、雅罗鱼属(Leuciscus)，是我国北方知名的土著鱼类，主要分布于黑龙江流域、辽河、内蒙古内陆淡水及盐碱湖泊[8-9]。其中来自内蒙古达里湖的瓦氏雅罗鱼，能够在达里湖碳酸盐碱度53.57 mmol/L, pH9.6的极端恶劣环境中存活，是达里湖渔业经济来源的重要物种之一[8]。解析达里湖瓦氏雅罗鱼的盐碱适应性机制，对培育耐盐碱新品种及提高盐碱水域的利用率具有重要的理论和实践意义。
近年来，我国学者基于高通量测序技术，从转录组[10-12]、基因组[13]和表观组[14]等尺度揭示了达里湖瓦氏雅罗鱼的盐碱适应性进化机制，提出拥有高效的离子和渗透压调节、氨氮代谢及酸碱调节机制，是其能够在极端盐碱环境生存的关键。课题组前期深度挖掘这些遗传数据发现，调控Cl–和${\rm{HCO\bar 3}}$等阴离子转运的蛋白家族主要为溶质载体(solute carrier) SLC4和SLC26家族，它们在达里湖瓦氏雅罗鱼的鳃、肾、肠等渗透压调节器官显著高表达[12]。目前国外学者已在斑马鱼(Danio rerio)[15]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[16]、青鳉(Oryzias latipes)[17]等相关研究中证实，这些蛋白家族参与${\rm{HCO\bar 3}}$的转运，在维持体内酸碱平衡方面发挥重要作用。我国学者在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[18]、青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)[19]等研究中同样发现它们参与${\rm{HCO\bar 3}}$的跨膜转运。课题组近期通过比较生理学的方法，发现在实验室内NaHCO3碱度胁迫下，达里湖瓦氏雅罗鱼能够快速启动slc4a4、slc26a5和slc26a6基因的高表达，并推测SLC26A5和SLC26A6可能位于鳃离子细胞顶端，是体内${\rm{HCO\bar 3}}$外排的关键蛋白[20]。
因此，为了全面了解slc26家族在瓦氏雅罗鱼基因组中的分布、进化和功能，本研究基于瓦氏雅罗鱼完善的基因组和转录组数据，拟通过筛选鉴定完整的slc26家族，并对其在基因组上的分布、不同组织的表达情况及在不同群体的分化进行深入研究，探讨该家族可能的生物学功能，为瓦氏雅罗鱼酸碱调控机制的解析提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 slc26家族基因序列的调取和鉴定为了避免各物种slc26基因序列的不完全，从Ensembl (http://asia.ensembl.org/index.html)和NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)两个数据库下载包括人(Homo sapiens)、鼠(Mus muscculus)、鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、斑马鱼、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、虹鳟、尼罗罗非鱼、大鳞鲃(Luciobarbus capito)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)及大西洋鲱(Clupea harengus)等共计11个物种的slc26基因序列，序列编号见附表1。
基于本课题组已有的瓦氏雅罗鱼基因组和转录组数据(待发表)，首先采用slc26基因家族硫转运蛋白典型的sulfate-transp结构域(PF00916)检索瓦氏雅罗鱼基因组slc26基因序列，并根据斑马鱼和人类的命名法命名(https//www.genenames. org/)；然后，为了避免查询遗漏，使用斑马鱼的slc26基因，通过TBLASTN和BLASTP[21]对瓦氏雅罗鱼基因组进行查询，e值截断为1e–5，获取slc26候选基因。最后，整合其他物种的slc26基因，再次在瓦氏雅罗鱼基因组中鉴定可能的slc26基因序列。
1.2 slc26基因家族在染色体上的分布和定位根据瓦氏雅罗鱼基因组注释信息文件确定slc26的染色体位置和结构信息，使用TBtools[22]软件进行染色体定位作图。
1.3 系统发育树构建将瓦氏雅罗鱼slc26基因与鲤、草鱼、鲫、斑马鱼、三刺鱼、虹鳟、尼罗罗非鱼、大鳞鲃、欧洲鳗鲡及大西洋鲱的同源基因进行整合，利用MEGA7.0[23]进行多物种序列同源比对，使用最大似然法(maximun likehood, ML)构建系统发育树。使用(Kimura 2-parameter + gamma distributed)模型，迭代次数bootstrap=1000，其余选择默认参数。
1.4 模体分析slc26基因家族成员之间既同源也存在差异，为了进一步确认slc26基因家族的保守结构域组成，开展了slc26基因保守基序分析。将鉴定的瓦氏雅罗鱼slc26基因序列及其在基因组上的位置信息进行整理，通过在线软件MEME (https:// meme-suite.org/meme/tools/meme)[24]识别保守结构域，参数如下：重复次数不限，不适应最多10次。使用TBtools软件重新共建保守的模体信息并使其可视化。
1.5 不同组织差异表达分析实验鱼为达里湖瓦氏雅罗鱼(简称碱水种)人工繁育F39尾，平均体重为(48.72±6.8) g，平均体长为(14.61±1.33) cm, 50 mmol/L NaHCO3胁迫7 d。胁迫实验结束后，分别采取每条实验鱼的鳃、肾、肠、肝、脑、脾、肌肉7个组织，每3条鱼相同组织混合放入液氮快速冷冻后转移至–80 ℃冰箱保存备用。使用TRIzol (Thermo Fisher, America)法提取高质量的RNA，并反转录为cDNA用于后续实时荧光定量(RT-PCR)分析。
根据已调取的slc26基因家族mRNA序列设计并合成引物(表1)。以18S为内参基因，检测瓦氏雅罗鱼slc26基因在不同组织的表达水平。采用两种方法进行检测，一种为实时荧光定量PCR法，根据SYBR Premix Ex TaqTM II (TaKaRa，日本)试剂盒说明书制样，利用ABI 7500 Fast Real- Time PCR (Applied Biosystems7500, America)进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应程序为95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s, 40个循环，采用2–ΔΔCt法处理数据；另外一种为基于已有的7种组织的RNA- seq数据，利用HiSat2软件[25]将过滤后的reads比对至瓦氏雅罗鱼参考基因组，用stringtie软件[26]进行转录本拼接并进行基因表达量fpkm (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)计算，最后通过fpkm值与荧光定量数据绘制双坐标轴的柱状图和折线图。
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表1 瓦氏雅罗鱼slc26基因家族引物信息 Tab. 1 Primer information of slc26 gene family in Leuciscus waleckii |
根据Xu等[13]和Wang等[27]发表的数据，整合两位作者进行盐碱适应性进化分析所用的碱水种群(23尾)和淡水种群(15尾)共计38尾样本的所有SNPs数据。首先分析了slc26基因在38尾碱水和淡水个体基因组上的SNPs位点，并统计其在外显子区域、内含子区域、3′UTR和5′UTR的位点个数及所占百分比。然后计算每个基因Fst值，选取Fst top 10%与全基因组背景下的Fst值比较，并进行显著性t检验，通过散点图的形式展现slc26家族各成员的Fst值分布。
1.6.2 slc26基因SNPs位点基因型分析使用Vcftools (http://vcftools.sourceforge.net/man_latest.html)软件分离并过滤SNPs位点得到vcf格式文件[28]。通过plink参数[29]将vcf文件转换为ped/map格式文件；其中ped文件是SNP位点的基因型，map文件是SNP位点的位置信息。采用SPSS 19.0的卡方检验进行SNP基因型与性状关联分析，差异显著度为0.05。
2 结果与分析 2.1 slc26基因家族成员的鉴定对瓦氏雅罗鱼slc26基因家族成员与其他物种的slc26基因进行同源比对，结果在瓦氏雅罗鱼基因组中共鉴定到10个slc26基因家族成员(表2)。从表2可以看出，只有鼠中有完整的11个slc26基因成员，除虹鳟和尼罗罗非鱼外，大部分鱼类(包括瓦氏雅罗鱼)没有slc26a7、slc26a8和slc26a9基因。进一步比对发现，瓦氏雅罗鱼slc26基因家族中的slc26a3和slc26a6各存在两种异构体，分别命名为slc26a3.1、slc26a3.2、slc26a6和slc26a6l。对10个slc26基因在瓦氏雅罗鱼基因组上的位置信息进行统计，结果显示，这10个slc26基因的基因大小在5029~15491 bp之间，编码序列长度为193~1506个氨基酸，外显子数目在4~ 21个之间(表3)。
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表2 slc26基因在各物种中的统计 Tab. 2 Statistics of slc26 genes in different species |
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表3 瓦氏雅罗鱼slc26基因家族基本信息 Tab. 3 Basic information of slc26 genes family in Leuciscus waleckii |
基于课题组最新完成的瓦氏雅罗鱼3代基因组数据，提取得到10个slc26基因在基因组上的位置信息，并进行了染色体定位分析。结果显示，10个slc26基因不均匀地分布在瓦氏雅罗鱼的6条染色体上。其中，slc26a3.1、slc26a3.2、slc26a4和slc26a5分布在chr6; slc26a6和slc26a10分布在chr19；其余4个基因分别分布在chr5 (slc26a11)、chr12 (slc26a6l)、chr13 (slc26a2)和chr14 (slc26a1) (图1)。
2.3 slc26基因家族的系统发育和模体分析利用最大似然法对广盐性鱼类、淡水鲤科鱼类、海水洄游性鱼类slc26家族每个成员构建了系统发育树(图2)。根据聚类结果可以看出，slc26家族可以划分成3大分支：第一大分支包含两个小分支，其中slc26a5和slc26a6、slc26a6l同源性较高，聚为一支，slc26a3.1、slc26a3.2和slc26a4同源性较高，聚为另一支；第二大分支同样包含两个小分支，slc26a1和slc26a2同源性较高，聚在一起，slc26a10单独一支；不同种类的slc26a11归类到第三大分支。
结合slc26基因家族在瓦氏雅罗鱼基因组上的位置信息、内含子和外显子数目，使用MEME在线软件对其进行了模体分析(图3)。由图3可知，瓦氏雅罗鱼10个slc26基因成员的亲缘关系与系统发育进化树的结果基本一致，且共享6个模体，分别为Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8和Motif 16。
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图1 瓦氏雅罗鱼10个slc26基因在6个染色体中的位置分布 Fig. 1 Distribution of 10 slc26 genes in six chromosomes of Leuciscus waleckii |
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图2 不同鱼类slc26基因的系统进化树10个瓦氏雅罗鱼slc26基因用黑点表示. Fig. 2 Phylogenetic tree of slc26 genes in different fish speciesTen slc26 genes of Leuciscus waleckii were marked with black dots. |
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图3 瓦氏雅罗鱼slc26基因家族的模体分析结果Motif 1–Motif 6为slc26基因家族共有模体. Fig. 3 Motif analysis of slc26 genes in Leuciscus waleckiiMotif 1–Motif 6 are the common motifs of slc26 genes. |
通过整合RNA-seq和实时荧光定量的结果可以看出，slc26家族各成员在瓦氏雅罗鱼不同组织的表达趋势基本相符。slc26家族各成员在鳃组织均有表达；slc26a3.1、slc26a3.2和slc26a4在两种检测方法中得到的结果的拟合度最高，在肠组织中表达量最高，在肌肉中表达量最低(图4); slc26a5、slc26a6l和slc26a6在两种检测方法中的表达结果稍有不同，RNA-seq显示slc26a5和slc26a6在鳃组织中表达量最高，但实时荧光定量则显示3种基因均在脑组织中高表达(图5); slc26a1、slc26a2、slc26a10和slc26a11在两种检测方法中得到的结果基本相似，其中slc26a1、slc26a10和slc26a11在肾组织表达量最高，slc26a2在肝脏中表达量最高，其次为鳃(图6)。
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图4 slc26a3.1 (a)、slc26a3.2 (b)、slc26a4 (c)在瓦氏雅罗鱼不同组织的表达量G：鳃；K：肾；I：肠；L：肝；B：脑；Sp：脾；M：肌肉. Fig. 4 Expression levels of slc26a3.1 (a), slc26a3.2 (b) and slc26a4 (c) in different tissues of Leuciscus waleckiiG: gill; K: kidney; I: intestine; L: liver; B: brain; Sp: spleen; M: muscle. |
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图5 slc26a5 (a)、slc26a6 (b)、slc26a6l (c)在瓦氏雅罗鱼不同组织的表达量G：鳃；K：肾；I：肠；L：肝；B：脑；Sp：脾；M：肌肉. Fig. 5 Expression levels of slc26a5 (a), slc26a6 (b) and slc26a6l (c) in different tissues of Leuciscus waleckiiG: gill; K: kidney; I: intestine; L: liver; B: brain; Sp: spleen; M: muscle. |
本研究统计了瓦氏雅罗鱼碱水种群(23个)和淡水种群(15个)共38个个体的slc26基因在基因组上的SNPs位点，并将其比对到参考基因组上。在38个个体的slc26基因外显子区域共找到313个SNPs位点，占12%；内含子区域共找到2190个SNPs位点，占82%; 3′UTR区域共找到137个SNPs位点，占5%, 5′UTR区域共找到42个SNPs位点，占1% (图7)。
统计了38个个体slc26基因的SNPs位点的Fst值(图8)。结果发现slc26家族所有基因成员均有一些SNPs位点超过Fst top 10%阈值(Fst> 0.686047)，在碱水和淡水种群呈现出不同程度的遗传分化。
2.6 slc26基因SNPs位点在不同种群的基因型频率将碱水和淡水种群共38个个体的SNPs位点进行基因型检测，共筛选到12个共享且存在潜在遗传分化的SNPs位点，其中slc26a5基因1个(SNPchr6-13028814), slc26a6l基因8个(SNPchr12-10938592、SNPchr12-10938758、SNPchr12-10938788、SNPchr12-10939255、SNPchr12-10939394、SNPchr12-10939886、SNPchr12-10941063和SNPchr12-10941274), slc26a10基因3个(SNPchr19-22935057、SNPchr19-22937713和SNPchr19-22939939)(表4)。
基因型与性状关联分析显示，slc26a6l的4个SNPs位点(SNPchr12-10938592、SNPchr12-10938758、SNPchr12-10938788和SNPchr12-10939394)和slc26a10的1个SNPs位点(SNPchr19-22935057)在碱水和淡水种群存在显著分化(P<0.05)(表4)。slc26a6l基因的4个SNPs位点在碱水种群的优势基因型分别为TT、TG、CT、CA和GA，基因型频率为43.5%~ 63.7%; slc26a10基因的SNPchr19-22935057存在3种基因型，分别为TT、TG和GG，其中TT基因型是碱水种群的优势基因型，基因型频率为43.5% (表4)。
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图6 slc26a1 (a)、slc26a10 (b)、slc26a11 (c)、slc26a2 (d)在瓦氏雅罗鱼不同组织的表达量G：鳃；K：肾；I：肠；L：肝；B：脑；Sp：脾；M：肌肉. Fig. 6 Expression levels of slc26a1 (a), slc26a10 (b), slc26a11 (c) and slc26a2 (d) in different tissues of Leuciscus waleckiiG: gill; K: kidney; I: intestine; L: liver; B: brain; Sp: spleen; M: muscle. |
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图7 38个瓦氏雅罗个体的slc26基因的SNPs占比 Fig. 7 Proportion of SNPs of slc26 genes in 38 leudscus waleckii individuals |
目前slc26基因家族已在人类、小鼠、畜禽、鱼类等物种中进行了鉴定和功能研究。在人和鼠中，共鉴定了10~11个slc26基因，分别命名为slc26a1~slc26a11，其中slc26a3和slc26a6在人和鼠中不存在异构体，只在鱼类中存在异构体，其属于硬骨鱼类特有的基因[30-31]。另外，除虹鳟、尼罗罗非鱼等少数广盐性鱼类外，绝大部分淡水和海水鱼类不具有slc26a7、slc26a8和slc26a9这3个基因(表2)。本研究在瓦氏雅罗鱼基因组中共鉴定出10个slc26基因家族成员，具备上述两个特征，即slc26a3和slc26a6存在异构体，无slc26a7、slc26a8和slc26a9基因，表明本研究鉴定的瓦氏雅罗鱼slc26基因家族是完整的，为后续功能和进化分析奠定了基础。
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图8 瓦氏雅罗鱼38个个体的slc26基因所有SNPs位点的Fst值不同颜色的圆点代表不同的slc26基因. Fig. 8 Fst values of all SNPs loci of slc26 genes in 38 individuals of Leuciscus waleckiiDifferent color dots represent different slc26 genes. |
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表4 slc26基因在瓦氏雅罗鱼碱水和淡水种群存在潜在遗传分化的SNPs及其基因型 Tab. 4 Potentially differentiated SNPs and their genotypes of slc26 genes in alkali-adapted and freshwater Leuciscus waleckii populations |
前期研究发现，达里湖瓦氏雅罗鱼在遭受碱刺激时，多个组织参与了机体渗透压和酸碱平衡的调节过程，而且与氨氮、Na+、${\rm{HCO\bar 3}}$等离子转运相关蛋白的表达和分布也呈现出一定的组织特异性[10-12]。如Rh蛋白被认为主要在瓦氏雅罗鱼鳃组织行使转氨功能[12,32]; “鸟氨酸-尿素循环” (ornithine-urea cycle, OUC)通路中的精氨基琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase, ASS)和精氨酸酶1 (arginase 1, ARG1)主要在肝脏显著高表达，将体内的余氨转化为毒性较弱的尿素[11,13]；碳酸酐酶(CA)在各组织均有分布和表达，有利于维持体内离子平衡和内环境稳定[33]。本研究发现，无论从纵向的系统进化关系还是横向的模体分析结果来看，瓦氏雅罗鱼的10个slc26家族成员既有同源性亦有分化，而且表达也呈现出明显的组织特异性，这可能与其盐碱适应过程中的功能分化有关。
肠道是海水鱼类渗透压调节的重要器官，鱼类通过饮水补偿水分的被动损失，并将盐主动分泌出去[34]。青海湖裸鲤已被证实饮水，其肠道参与调节渗透压[19,35]，另外，在小鼠的最新研究发现，SLC26A3 (DRA)作为肠上皮腔膜中的关键Cl–/ ${\rm{HCO\bar 3}}$交换蛋白，与Na+/H+交换蛋白共同参与NaCl的电中性吸收，在维持肠上皮屏障功能中发挥重要作用[36]。本研究发现，slc26a3.1、slc26a3.2和slc26a4同时定位在了瓦氏雅罗鱼的Chr6，而且在基因组上近乎重合(遗传距离0 Mb)，表明这3个基因发生基因重组的概率较小，同步遗传的概率极大；此外，基因表达分析显示它们均在肠组织高表达(图4)，这与青海湖裸鲤被证实肠道参与渗透压调节这一观点一致。根据slc26a3.1、slc26a3.2和slc26a4的遗传同源性和组织表达特异性来看，推测slc26a3和slc26a4可能分布在瓦氏雅罗鱼肠黏膜上皮，通过调控Cl–/${\rm{HCO\bar 3}}$的吸收和排泄，维持体内酸碱平衡。
鱼类鳃组织与水体直接接触，对水体变化敏感，是鱼类渗透压调节和离子运输的主要器官[37-38]。前期很多研究主要围绕鱼类鳃组织，从生理、生化和分子水平证实了slc26a5和slc26a6参与鳃离子细胞Cl–/${\rm{HCO\bar 3}}$的转运[15-16,20]。本研究首次发现，slc26a6存在两种异构体，且与slc26a5具有较高的同源性(图2)；高碱胁迫下slc26a5和slc26a6在鳃和脑组织均显著高表达。这与slc26a5 (prestin)在人和鼠方面的研究结果一致，证实其表达水平与听力发展同步[39]。靶向敲除prestin后，实验动物的听敏度下降达100~1000倍，导致约40~ 60 dB的听力损失[40-42]。Chang等[20]通过50 mmol/L NaHCO3碱度胁迫实验发现，瓦氏雅罗鱼碱水种的slc26a5和slc26a6基因似乎对碱胁迫比较敏感，胁迫第7天迅速高表达，加快${\rm{HCO\bar 3}}$的转运，保持血液pH稳定。上述研究表明，瓦氏雅罗鱼大脑皮层感受环境刺激信号后，可能通过下丘脑-垂体-肾间细胞(hypothalamus-pituitary-interrenal, HPI)轴释放皮质醇和催乳素等应激激素，促进鳃离子细胞的增殖和分化，细胞膜上的SLC26A5和SLC26A6与NBC、NCC、NKA等蛋白协同作用参与渗透压和酸碱平衡的调节过程[20,43]。
肾是鱼类重要的排泄器官，也是鱼体进行酸碱平衡和渗透调节的主要器官[3]。本研究发现，尽管slc26a11单独聚类，但相较于其他成员，slc26a11与slc26a1、slc26a2、slc26a10亲缘关系较近(图2)；除slc26a2在肝组织表达量相对较高外，slc26a1、slc26a10和slc26a11均在肾组织显著高表达，其中slc26a10的表达倍数是其对照组的400倍以上(图6)。这与前期在瓦氏雅罗鱼[5]和青海湖裸鲤[44]研究中发现鱼类肾脏的萎缩程度与水体环境的渗透压成正相关的结果相类似[3,45]，肾脏同样在鱼体的渗透压和酸碱调节过程中发挥重要作用。
3.2 slc26基因家族的盐碱适应性进化分析根据地质学和遗传学的研究结果，达里湖瓦氏雅罗鱼在不足1万年的时间从开放型淡水种演变为陆封型碱水种，是进行盐碱适应性进化研究的理想物种[46-47,13,27]。Xu等[13]通过分析达里湖碱水种群和黑龙江淡水种群，鉴定了614个受选择基因；随后Wang等[27]通过消除背景空间差异，分析了达里湖碱水种群及其姊妹岗更湖淡水种群和松花江淡水种群，鉴定了51个受选择区域包含21个基因。本研究为了全面了解slc26基因家族是否受到正向选择作用，下载整合了Xu等[13]和Wang等[27]的重测序样本数据。结果发现slc26家族所有基因成员在碱水种和淡水种均出现了不同程度的遗传分化(图8)；但由于二者采集样本的时间、地点、数量不同，本研究只在slc26a5、slc26a6l和slc26a10中筛选出12个共享候选SNPs位点，几乎都位于内含子区(表4)。基因型性状关联分析显示，只有slc26a6l和slc26a10基因的5个SNPs位点在碱、淡水种群存在较为明显的遗传分化。研究发现SNPs发生在基因非编码区可能会影响基因的转录水平、剪接(内含子剪接增强子或沉默子)等机制进而影响基因的功能[48]。目前关于slc26a6l的相关研究几乎没有，而slc26a10被认为是一种表达的假基因，其具体功能也不明确[49]。所以，这两个基因将是后续研究的重点。从系统进化关系来看，瓦氏雅罗鱼的这两个基因与海水洄游性鱼类亲缘关系较近，推测这两个基因可能属于海水型或碱水型基因；另外，从基因表达来看，slc26a6l和slc26a10在碱胁迫下不同组织均有表达，而且slc26a10在肾、肠、脑等渗透调节组织显著高表达(图5)，推测该基因可能具有离子和渗透压调节功能，参与瓦氏雅罗鱼盐碱适应过程。
综上，本研究为进一步探究瓦氏雅罗鱼slc26基因家族功能奠定基础，也为其他鱼类slc26基因的研究提供了参考数据，以期可以在不同鱼类之间进行slc26的比较分析，解析slc26在鱼类酸碱调控过程中的作用机制。
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03-0309-15-F009.jpg "点击查看原图") |
附表1 各物种slc26基因序列编号 Appendix 1 Gene ID of slc26 genes in different species |