棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)体表淡黄褐色，俗称“老虎斑”，主要在我国南部沿海地区养殖。其肉质鲜美、有很强的抗病能力、繁殖期可产生大量优质卵子，但是生长速度慢^[1]。自然海域的棕点石斑鱼初次性成熟为4~5龄，繁殖期大多为每年的11月至次年2月，每月高峰期为新月的前几天^[2]。蓝身大斑石斑鱼(Epinephelus tukula)因为体表呈灰色，且有较大的褐色斑点，故俗称金钱斑。金钱斑成年体重可达100 kg，属于大型石斑鱼，主要分布在我国南海海域。蓝身大斑石斑鱼生长速度较快，但雄鱼产精量很少，且雌鱼在人工养殖环境下难于产卵，因此蓝身大斑石斑鱼无法大规模推广养殖^[3]。

杂交育种是通过不同物种、品种或品系之间杂交获得新的养殖品种，在鱼类育种中应用广泛，经济效果显著。与亲本相比，杂交子代可能会在某些性状上会超过亲本^[4]，例如杂交子代生长更快^[5]、抗病力更强^[6]、更耐低氧^[7]等。田永胜等^[3]首次利用蓝身大斑石斑鱼冷冻精子与棕点石斑鱼进行杂交育种实践，突破两个物种之间地理分布不同、繁殖习性不同造成的生殖隔离，获得了具有高受精率、高孵化率、低畸形率、生长速度快等优势的杂交子代“金虎石斑鱼”(Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂)。本团队对金虎石斑鱼与亲本的形态差异^[8]、后代生长发育^[3]、子代的染色体核型^[9]、遗传多样性^[10]、低温耐受能力^[11]和低氧耐受能力^[12]等进行了研究。对于鱼类杂交种可育性一直是本领域关注的焦点，鱼类远缘杂交种实际应用的关键一环是它的可育性。杂交种可育必然要突破生殖隔离的限制，可育杂交种可以为研究克服生殖隔离提供良好的材料和模型。杂交种金虎石斑鱼的性腺发育特征及可育性还未有相关研究报道。

杂交种可育性往往通过染色体数目是否成对、性腺发育是否正常以及回交、自交试验能否产生后代来判定^[13]。金虎石斑鱼的染色体核型与母本棕点石斑鱼一致，都为2n=2sm+46t^[9]，表明金虎石斑鱼育性具有良好的遗传学基础。鱼类的生殖研究，如性腺分化时间、性别变化、产卵季节和持续时间、繁殖力等等，都需要了解鱼体性腺的发育阶段。了解鱼类性腺结构是研究鱼类性腺发育的基础，组织学是研究鱼类性腺结构最常用的方法之一。组织学方法耗时长、费用高，但可以准确直观地观察生殖细胞的发育情况，判断鱼类的性腺发育阶段^[14]。性类固醇激素主要在性腺中产生，血清性类固醇激素水平在雌雄性腺成熟期间经历了重要的变化。血清性类固醇激素浓度变化诱导下丘脑、垂体和性腺内的正反馈和负反馈控制，这些过程直接负责控制配子发育和生殖活动^[15]。性腺发育和性类固醇激素的相应变化对于了解鱼类性成熟和产卵模式至关重要^[16-17]，血清类固醇激素也有助于了解鱼类内分泌对生殖的控制^[18]。淡水和海洋鱼类中血清类固醇激素在年度生殖周期中的季节性变化及其在性腺发育过程中的作用已被广泛研究^[16,19-20]，通常研究的鱼类性类固醇激素包括雌二醇(E2)、11-酮基睾酮(11-KT)、睾酮(T)和孕酮(P)。

本研究拟以杂交种“金虎石斑鱼”和其母本棕点石斑鱼为研究对象，对两种鱼的卵巢组织形态结构、性类固醇激素水平进行研究。从杂交子代自身角度出发，了解其卵母细胞的发育过程、性类固醇激素变化规律，探究杂交种金虎石斑鱼性腺发育特征及生育能力，为石斑鱼杂交育种及杂交种的养殖提供理论和技术资料。

本研究团队在2019年4月、2020年3月、2021年6月分别利用蓝身大斑石斑鱼冷冻精子、棕点石斑鱼鲜精与棕点石斑鱼卵进行人工授精，构建并养成了1、3、13个金虎石斑鱼家系和1、1、3棕点石斑鱼家系。每年家系留500条进行养殖，这些家系均在山东省莱州明波水产有限公司工厂化循环水车间进行对比养殖。工厂化养殖条件为：水体体积40 m³，水温21~26 ℃，盐度28~ 30，溶解氧6~9 mg/L，投喂人工配合饲料[三通生物工程(潍坊)有限公司]进行养殖，苗种期每天投喂2次，根据鱼的生长状况调整饲料规格和投喂量，以饱食为准；成鱼期每天投喂1次，投饲量为鱼体重的2%~3%。

取10、18、24、36月龄的金虎石斑鱼各10条，10、18、24月龄的棕点石斑鱼各10条，36月龄的棕点石斑鱼3条，各月龄的金虎石斑鱼和棕点石斑鱼为同批卵的半同胞家系。使用MS-222麻醉后测量体重和体长数据，通过尾部静脉采集血液。血液静置过夜，3500 g离心5 min，取上清于液氮中速冻，后保存于‒80 ℃冰箱中待用。每组再随机抽取3条进行解剖，取出卵巢。卵巢取出后先于波恩试液中固定24 h，后转于70%的乙醇中保存。

将卵巢从70%的乙醇中取出，将组织修成3~5 mm³大小，放入塑料盒中做好标记。经过一系列梯度浓度的乙醇脱去组织中的水分，二甲苯透明。将组织从塑料盒中取出放入盛有蜡液的模具中，切面与底部平行。蜡液完全凝固后，将蜡块修整平整后用切片机连续切片，切片厚度5~8 μm。展片、粘片、烘干后，苏木精–伊红(HE)染色，中性树胶封片。用显微镜观察、拍照，观察卵巢发育。

采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)对血清中的雌二醇(estradiol, E2)、11-酮基睾酮(11-keto testosterone, 11-KT)、睾酮(testosterone, T)、孕酮(progesterone, P) 4种与性腺发育相关的激素进行测定。实验操作严格按照Cayman Chemical Company的对应试剂盒说明书进行。

实验数据经Excel处理，用平均值±标准差($\bar x{\rm{ \pm SD}}$)表示。统计分析采用SPSS 26.0软件进行差异显著性分析，利用单因素方差分析法对数据进行方差分析，差异显著时用Duncan’s法多重比较，比较结果用字母标记法，在同一系列中字母相同表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。采用Origin 2021制作图表。

10月龄体长为(18.53±0.55) cm，性腺未分化。性腺原基中可观察到性原细胞，性原细胞呈圆形或椭圆形，细胞界限明显(图1a)。

18月龄体长为(33.50±1.50) cm，卵巢处于I期和II期的过渡期。卵母细胞较小，直径大多不超过20 μm，细胞嗜碱性，被染成蓝紫色(图1b)。

图1

图1 　金虎石斑鱼性腺发育组织学观察a. 10月龄性腺切片；b. 18月龄性腺切片；c. 24月龄性腺切片；d. 36月龄性腺切片. G：性原细胞；GP：性腺原基；BV：血管；OG：卵原细胞；OC：卵巢腔；PO：初级卵母细胞；GR：生长环；N：细胞核；NU：核仁. Fig. 1 　Histological observation of gonad development in Jinhu grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂)a. Gonad sections at 10 months of age; b. Gonad sections at 18 months of age; c. Gonad sections at 24 months of age; d. Gonad sections at 36 months of age. G: gonium; GP: gonadal primordium; BV: blood vessel; OG: oogonium; OC: ovarian cavity; PO: primary oocyte; GR: growth ring; N: nucleus; NU: nucleolus.

24月龄体长为(37.47±0.65) cm，卵巢发育至II期中晚期。卵母细胞处于小生长期，细胞增大，细胞质增加，出现生长环，卵母细胞大小为20- 50 μm。核仁增多，出现在细胞核的外围(图1c)。

36月龄体长为(41.30±1.50) cm，第Ⅲ时相早期。卵母细胞进入大生长期后体积明显增大，大小为60 μm左右，卵母细胞间间隙减小。胞质出现大小不一的油滴，核仁紧贴核膜外侧(图1d)。

10月龄体长为(14.60±0.53) cm，卵巢腔发育完成。卵母细胞形态不规则，细胞较小，直径20 μm左右。细胞质少且均匀，核内有网状的染色质(图2a)。

18月龄体长为(27.17±1.31) cm，卵巢处于II期。卵母细胞，胞质嗜碱性强，处于卵母细胞小生长期。细胞体积增大，直径50 μm。细胞核和细胞质有所增长，多呈圆形或不规则形(图2b)。

24月龄体长为(28.53±1.19) cm，为第III期早期，卵母细胞刚进入大生长期，直径60 μm。细胞基本呈圆形，卵母细胞滤泡膜仍为一层。核周边缘胞质出现油滴，油滴大小不一(图2c)。

36月龄体长为(36.93±2.38) cm，为第III期晚期。相较第III时相早期，卵母细胞明显增大直径达到80 μm。卵膜外又形成了一层滤泡膜，形成双层滤泡膜结构(图2d)。

从图3中可以看出，金虎石斑鱼与棕点石斑鱼血清中雌二醇(E2)水平都呈现一个先上升再下降的趋势，并在24月龄时达到最大，显著高于10、18、36月龄(P<0.05)，分别为(71.17±8.69) pg/mL、(293.57±115.31) pg/mL。棕点石斑鱼血清中E2水平在各个时期都显著高于金虎石斑鱼(P<0.05)。

如图4所示，金虎石斑鱼和棕点石斑鱼血清中孕酮(P)激素的变化趋势与雌二醇一致。金虎石斑鱼血清中P的水平在各个时期都有显著差异(P<0.05)，棕点石斑鱼在10月和18月龄时血清中P的水平无显著差异(P>0.05)，但与24月龄和36月龄有显著差异(P<0.05)。金虎石斑鱼和棕点石斑鱼血清中P的水平均在24月龄时达到最大，分别为(2236.85±316.62) pg/mL、(3250.45±153.31) pg/mL。棕点石斑鱼血清中P的水平在10、24月龄时显著高于金虎石斑鱼(P<0.05)。

图2

图2 　棕点石斑鱼性腺发育组织学观察a. 10月龄性腺切片；b. 18月龄性腺切片；c. 24月龄性腺切片；d. 36月龄性腺切片. OG：卵原细胞；OC：卵巢腔；PO：初级卵母细胞；FM：滤泡膜；N：细胞核；NU：核仁. Fig. 2 　Histological observation of gonad development in Epinephelus fuscoguttatusa. Gonad sections at 10 months of age; b. Gonad sections at 18 months of age; c. Gonad sections at 24 months of age; d. Gonad sections at 36 months of age. OC: ovarian cavity; OG: oogonium; PO: primary oocyte; FM: follicular membrane; N: nucleus; NU: nucleolus.

图3

图3 　不同月龄时期金虎石斑鱼与棕点石斑鱼血清中雌二醇(E2)激素水平同一种鱼上标不同字母表示不同月龄间差异显著(P<0.05)；*表示同一月龄的两种鱼差异显著(P<0.05). Fig. 3 　Serum estradiol (E2) levels of Jinhu grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂) and Epinephelus fuscoguttatus at different agesDifferent letters in the same fish indicate significant difference among different ages (P<0.05); * means significant difference between the two fish at the same age (P<0.05).

图4

图4 　不同月龄时期金虎石斑鱼与棕点石斑鱼血清中孕酮(P)激素水平同一种鱼上标不同字母表示不同月龄间差异显著(P<0.05)；*表示同一月龄两种鱼差异显著(P<0.05). Fig. 4 　Serum progesterone hormone levels of Jinhu grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂) and Epinephelus fuscoguttatus at different agesDifferent letters in the same fish indicate significant difference among different groups (P<0.05); * means significant difference between the two fish at the same age (P<0.05).

从图5可以看出，金虎石斑鱼与棕点石斑鱼相比，血清中11-酮基睾酮(11-KT)激素水平在各个时期都没有显著差异(P>0.05)。在金虎石斑鱼卵巢发育过程中，24月龄时血清中11-KT水平最高[(40.28 ± 23.29) pg/mL]，显著高于10和18月龄(P< 0.05)，但与36月龄无显著差异(P>0.05)。棕点石斑鱼血清中11-KT水平也在24月龄时达到顶峰[(53.06± 15.74) pg/mL]，显著高于其他各时期(P<0.05)。

图5

图5 　不同月龄时期金虎石斑鱼与棕点石斑鱼血清中11-酮基睾酮(11-KT)激素水平同一种鱼上标不同字母表示不同月龄间差异显著(P<0.05)；*表示同一月龄两种鱼差异显著(P<0.05). Fig. 5 　Serum 11-keto testosterone (11-KT) levels of Jinhu grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂) and Epinephelus fuscoguttatus at different agesDifferent letters in the same fish indicate significant difference among different ages (P<0.05); * means significant difference between the two fish at the same age (P<0.05).

图6 显示出金虎石斑鱼和棕点石斑鱼血清中睾酮(T)激素水平的变化趋势并不一致，棕点石斑鱼血清中T的水平在10、24、36月龄时显著高于金虎石斑鱼(P<0.05)。金虎石斑鱼在10月龄和18月龄时，血清中T的水平处于较低的水平，在24月龄时最大[(53.22±18.96) pg/mL]，但在36月龄时下降至和18月龄相似的水平。棕点石斑鱼血清中T的水平在10到24月龄时的变化趋势与金虎石斑鱼一致，但在36月龄时血清中T的水平并未下降而是维持在和24月龄相似的较高水平。

图6

图6 　不同月龄时期金虎石斑鱼与棕点石斑鱼血清中睾酮(T)激素水平同一种鱼上标不同字母表示不同月龄间差异显著(P<0.05)；*表示同一月龄两种鱼差异显著(P<0.05). Fig. 6 　Serum testosterone (T) levels of Jinhu grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus tukula ♂) and Epinephelus fuscoguttatus at different agesDifferent letters in the same fish indicate significant difference among different groups (P<0.05); * means significant difference between the two fish at the same age (P<0.05).

棕点石斑鱼与蓝身大斑石斑鱼属于同属不同种，该两个物种之间的杂交属于远缘杂交。杂交种的可育性研究是杂交育种过程中重要的研究方向，国内外研究发现鱼类杂交种的可育性大致可以分为4种类型^[21]：一是完全可育型，杂种F₁雌雄个体都可发育并达到性成熟。如棕点石斑鱼×鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)杂交获得了F₁“虎龙杂交斑”, F₁自交又获得了F₂^[22]。二是障碍性两性能育，即杂种F₁中只有一部分可以达到性成熟。如刘筠^[23]对红鲫(Carassius auratus)和湘江野鲫(Cyprinus carpio)杂交子代的生殖腺组织学研究发现，可育雌性占F₁总数的44.3%，可育雄性仅占4.67%。三是单性可育，杂种F₁中只有雌性或者雄性能够达到性成熟。如对褐鳟(Salmo trutta)和大西洋鲑(Salmo salar)的杂交子代的性腺发育研究发现，雄性F₁的精巢发育正常，但雌性F₁的卵巢发育受到干扰^[24]。还有一些杂交子代是完全不育的，如箕作氏黄姑鱼(Nibea mitsukurii ♀)×白姑鱼(Pennahia Argentata ♂)杂交种的性腺都很小，杂交鱼的生殖腺中没有观察到vasa阳性细胞^[25]；黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco ♀)×瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli ♂)杂交子代“黄优1号”雄鱼精巢中虽然有精子产生，但活力低没有授精能力，雌鱼卵巢退化，为白色细线状，故判断杂交黄颡鱼不可育^[26]。在其他杂交石斑鱼中，Muzaki等^[27]对棕点石斑鱼与清水石斑鱼(Epinephelus polyphekadion)的杂交子代进行组织学观察，发现性腺发育良好，其中一尾雌性繁殖力很强，判定杂交石斑鱼可育。Li等^[28]对10~43月龄的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)与鞍带石斑鱼的二倍体杂交子代性腺发育进行研究，发现二倍体杂交石斑鱼在43月龄时发育正常，卵黄发生。棕点石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交子代“虎龙杂交斑”可以达到性成熟，并性逆转为雄性^[29]。“虎龙杂交斑”目前已有回交、自交成功的报道^[30,22]，可以判定“虎龙杂交斑”可育。

本研究中，通过对36月龄前金虎石斑鱼性腺发育的组织学观察，未发现卵母细胞萎缩、退化的现象，说明金虎石斑鱼36月龄前卵巢发育正常，有较好细胞学育性基础。但是相较于同时期的棕点石斑鱼的卵巢发育，金虎石斑鱼的卵巢发育较为迟缓，这与云纹石斑鱼(Epinephelus moara)与鞍带石斑鱼的杂交子代“云龙石斑鱼”^[31]、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)与大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)的杂交子代^[32]、黄金鲈(Perca flavescens)与伊犁鲈(Perca schrenki)的杂交子代^[33]卵巢发育慢于母本的报道相一致。在生物生长过程中涉及到生长能量和生殖能量的分配，性成熟较早的个体，在性成熟之前主要将能量分配在配子生长发育方面，身体生长就会减慢。例如半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和金钱鱼(Scatophagus argus)，它们的雄性个体性成熟时间早于雌性，这可能是雄性个体显著小于同期雌性个体的原因之一^[34-35]；相反，如果雄性个体性成熟晚，同时期的雄性个体大小就会超过雌性个体，例如尼罗罗非鱼和南方蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)^[36-37]。黄金鲈与伊犁鲈杂交子代的繁殖期比黄金鲈推迟1年，杂交鲈性成熟推迟使其保持较高的生长速度^[33]。金虎石斑鱼的卵巢发育慢于母本棕点石斑鱼，这一点也可能是杂交种金虎石斑鱼生长优势形成的因素之一。

性类固醇激素可调控鱼类的性别分化过程，并影响生殖细胞的发育，对于促进性腺发育和维持性别特征具有重要作用^[38]，通过测定鱼类血液中性类固醇激素含量可以直接推断出其机体的性腺发育状况^[39]。在本研究中，棕点石斑鱼血清中E2的水平在各个时期都显著高于金虎石斑鱼。在10和18月龄的金虎石斑鱼和棕点石斑鱼中检测到较低水平的E2，表明它们在卵巢第一个发育阶段已开始发挥调节作用，即使与24个月龄的鱼相比水平很低。低水平的E2足以刺激卵原细胞的有丝分裂增殖，卵原细胞进入减数分裂，产生初级卵母细胞^[40]。本研究结果表明，棕点石斑鱼血清中的E2浓度在卵巢Ⅲ期早期时维持较高水平，末期呈下降趋势。与雌性俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)和闪光鲟(Acipenser stellatus)相似，雌性俄罗斯鲟和闪光鲟的血清E2水平在II期都很低，在卵黄发生期间(III期)显著升高。当卵黄发生完成时(III~IV和IV阶段)，雌性俄罗斯鲟和闪光鲟的E2水平显著下降^[41]。这一下降可能是由于有效的E2浓度没有更新，这些E2被用来激活内源生长。这一发现也与Heidari等^[42]获得的结果相似，卵母细胞初级生长阶段的高水平血浆E2可能与卵巢生殖细胞的增殖有关。因为P是E2的前体，所以金虎石斑鱼和棕点石斑鱼血清中P的水平变化与E2相似。

尽管11-KT在硬骨鱼中被认为是雄性雄激素，但在金虎石斑鱼和母本棕点石斑鱼血清中也被检出，在雌性赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)^[43]、澳洲无须鳕(Merluccius australis)^[44]、蜂巢石斑鱼(Epinephelus merra)^[45]中也检测出了11-KT。尽管对于11-KT在雌性生殖生理中的作用还没有确切的了解，但对刺激卵泡破裂、卵母细胞释放以及产卵时行为变化是必要的^[46]。Matsubara等^[47]认为雌鳗(Anguilla japonica)鱼体内的11-KT在控制卵巢发育前期卵母细胞的生长中起重要作用，并且参与了卵子发生的后期阶段。在大西洋鲑中11-KT与卵黄蛋白原的直接关系表明，11-KT可能在卵母细胞发育过程中起作用^[48]。T可以被cyp19转化为E2, E2通过激活卵黄蛋白原(VTG)形成而参与雌性鱼类的卵黄发生。除了E2合成的前体外，T还可以在体外增强促性腺激素(GTHs)的刺激作用，还可能通过在最终卵母细胞成熟过程中启动生发泡破裂(GVBD)来促进卵母细胞的生长^[49]。T作为E2和11-KT的前体，其变化趋势与E2和11-KT相同，但在36月龄棕点石斑鱼血清中仍有较高水平的T。Kobayashi等^[50]认为T水平的升高是卵巢与完全成熟的卵母细胞紧密结合并准备排卵的标志，T水平的增加可能是由于通过芳香化过程停止了T向其他类固醇的转化。值得强调的是，T在卵母细胞形成和维持的最终过程中是至关重要的，需要保持T水平高于一定的阈值^[51]。Poortenaar等^[52]也在黄尾鰤(Seriola lalandi lalandi)中确定，在卵母细胞的卵黄形成和最终成熟期间T浓度较高。

本研究通过对金虎石斑鱼和棕点石斑鱼卵巢的组织学观察和血清中性类固醇激素的测定，发现杂交种金虎石斑鱼的卵巢可正常发育，没有出现卵母细胞萎缩、退化的现象，但比没有母本棕点石斑鱼卵巢发育慢。36月龄时金虎石斑鱼卵巢发育至III期早期，棕点石斑鱼卵巢发育至III期末期。金虎石斑鱼各发育时期血清中E2、11-KT、P、T水平低于或显著低于母本棕点石斑鱼。以上结果表明杂交种金虎石斑鱼性成熟水平显著低于母本，但杂交种金虎石斑鱼是否具有繁育能力，还需长时间和深入的跟踪研究。