近几十年来，随着海水养殖业的飞速发展，其带来的水环境污染问题同样不容忽视。海水养殖尾水因具有盐度高、污染物成分复杂、可生化性差等特点，导致处理难度较大，技术要求高。因此海水养殖废水如何能更好地实现经深度处理后达标排放，已成为亟待解决的问题。目前海水养殖尾水处理技术主要分为物理、化学和生物3类^[1]。物理处理技术是应用沉降分离、机械过滤等技术去除水体中的悬浮颗粒物(SS)，但该技术对于溶解性污染物(如氮、磷、有机物等)的去除效果不佳^[2]。化学处理技术包括化学氧化、混凝沉淀、电化学以及紫外辐射技术等，化学法的技术处理成本和能耗较高^[3]，臭氧消毒的残余物还具有生物毒性^[4]。生物处理技术主要通过植物、动物和微生物的生长代谢作用吸收降解养殖尾水中的污染物，对养殖过程中产生的悬浮物、氮、磷、有机物等去除效果良好，生物处理技术因其生态、高效、经济等优点而应用广泛^[5]。

人工湿地是一种综合的水处理系统，其利用基质吸附和沉淀、植物吸收、微生物分解等物理、化学及生物手段可综合实现对养殖尾水中氮、磷等污染物的去除及资源化利用。因其具有净化效率高、建造成本低、能耗少、生态效益好等优点，已被广泛应用于生活污水、工业废水及暴雨径流等不同类型水体的处理，并取得较好的去除效果^[6]。近年来，较多研究表明人工湿地对于海水养殖尾水亦有着较好的净化效果^[7-10]。

研究发现，氮是养殖尾水的主要污染物，若不经合理处理，直接排放则会导致局部水体富营养化，因此氮元素已成为尾水处理中需首要去除的基本营养元素^[11-13]。人工湿地中氮的迁移转化是一个涉及多种形态、价态相互转换的复杂过程，在多种有机、无机形式之间转化，主要包括基质吸附、植物吸收、微生物分解、生物同化和腐解等过程^[14-16]。人工湿地的脱氮途径、脱氮效率一直是国内外学者的研究热点，脱氮效果已成为评价人工湿地净化能力强弱的重要指标。众所周知，稳定同位素技术有示踪等功能^[17]，生态系统中各组分的¹⁵N丰度及¹⁵N示踪可精准测定，对于量化氮转化速率、揭示氮的来源和去向及其发生机制具有重要的理论和现实意义^[18]。自20世纪初，国外许多学者已将氮稳定同位素技术应用到水体氮循环^[19-21]、氮污染^[22-23]的研究中，国内学者则将氮稳定同位素技术应用于多类型污染水体的处理中^[24-27]，并取得了初步的研究进展。但目前，将氮稳定稳定同位素技术应用于人工湿地氮的迁移转化研究还较少。

本研究通过构建牙鲆(Paralichthys olivaceous)养殖尾水人工湿地处理系统，采用¹⁵N氮稳定同位素标记技术示踪氮的迁移转化过程，并结合质量平衡法精确量化人工湿地植物、基质及微生物各个处理单元对系统脱氮的贡献，旨在精准揭示人工湿地氮迁移转化过程，阐明人工湿地各单元脱氮机理，并为人工湿地对海水养殖尾水氮去除技术的优化及应用提供理论依据。

实验用鱼来自烟台市海阳水产有限公司，驯养45 d后牙鲆平均体长13.34 cm，用于正式实验。牙鲆养殖池(聚丙烯材质)为0.4 m×0.5 m (直径×高)，有效容积0.06 m³；池内放养牙鲆幼鱼26条，体重(70.12±9.80) g。人工湿地尾水处理系统由沉淀池、复合垂直流人工湿地系统以及储水池3个单元组成(图1)。人工湿地为0.6 m×0.4 m×0.5 m (长×宽×高)，有效容积0.05 m³。人工湿地系统单元通过隔板被均分为底部相通的下行池和上行池两部分，自下至上依次填入珊瑚石15 cm (粒径3~5 cm)、煤渣15 cm (粒径2~4 cm)、细砂10 cm (粒径0.15~0.25 mm)，顶部种植互花米草(Spartina alterniflora Loisel)，密度为30株/m²，实验期间对其根系、花粉及种子进行监管控制，待实验结束后将全部植物晒干粉碎处理，避免进入外界环境。初期试运行系统1周以进行人工湿地系统微生物的培养，定期监测进、出水水质指标；待1个月后微生物群落基本稳定，出水水质指标基本稳定，则正式运行系统并开展基于稳定同位素的氮迁移转化过程分析实验。实验运行期间系统内水质pH为7.53~8.57、溶解氧(DO)为0.93~5.80 mg/L、温度为20.3~24.1 ℃、盐度范围31.54~33.63。

图1

图1 　海水人工湿地系统原理图1–7为7个水质采样点. Fig. 1 　Schematic diagram of marine constructed wetland1–7 represent 7 sampling sites.

采用饲料中以添加K¹⁵NO₃的方式实现标记氮在人工湿地系统中的迁移转化过程。正式运行前，系统停止运行1 d用于排空系统内的养殖尾水，以减少多余水体对实验结果的误差影响。添加海水至养殖池，控制试验水体为100.00 L。根据预实验结果选取最佳添加量同位素，将816.80 mg K¹⁵NO₃ (相当于¹⁵N的添加量为120.00 mg)一次性加入饲料(山东升索饲料科技有限公司)中，于牙鲆养殖池中适量投喂，打开水泵开关，系统开始正式运行。采用同位素标记的饲料经牙鲆摄食排泄或在水体中自然溶解后，产生的养殖尾水在人工湿地、储水池和养殖池内循环流动。基于实验室前期基础，设定本次实验周期为21 d，实验期间系统不间断循环运行，不更换进水。每日10:00、17:00定时定量投喂配合饲料，单次投喂量为12.54~19.16 g，投饵率为0.90%。每日9:00采样，体积50 m/L，因水体取样量与水体总量相比影响较少，故实验期间不补充海水，不考虑蒸发因素。

人工湿地系统单元于各基质层设置1^#~7^#共7个水质分析采样点(图1)。系统运行后第0、1、3、7、14、21天采集养殖池、储水池及各系统1^#~7^#的水样；利用对角线五点取样法^[28-29]对系统各基质层进行采样，采样位置为S1~S6 (图2)，第0天采集上行池和下行池中细砂层、煤渣层、珊瑚石层样品，第3、7、14天采集细砂层样品；第0、3、14、21天采集养殖池中鱼体样品并收集残饵粪便；实验结束后将人工湿地系统内植物全部取出，采用双蒸水将植物根系的细砂清理干净，静置烘干后进行称量。

图2

图2 　海水人工湿地取样点示意图 Fig. 2 　Schematic diagram of sampling sites in marine constructed wetland

将植物、基质、鱼体、残饵及粪便样品烘干后研磨成粉末状，同一份样品混合均匀后过筛(80目)。利用DELTA V Advantage同位素比率质谱仪(isotope ratio mass spectrometer)、EA-HT元素分析仪(elemental analyzer, Thermo Fisher Scientific, Inc. Bremen, Germany)收集N₂以测定其中¹⁵N与¹⁴N的比率，计算其中δ¹⁵N值和氮含量(%)^[30-31]。将NO₃-N的¹⁵N/¹⁴N与标准品比较后计算得出样品的δ¹⁵N值，δ¹⁵N值的分析精度±≤0.2‰。

同位素质谱仪中δ¹⁵N的测定方式如公式1所示，AT%计算方法如公式2所示：

式中，δ¹⁵N表示样品中氮同位素比值R_样品与标准物质中氮同位素比值R_标准之间的千分差，AT%是样品中¹⁵N和¹⁴N的原子百分比(相对丰度)。其中，R_样品表示样品中¹⁵N/¹⁴N的比值，R_标准表示标准品中¹⁵N/¹⁴N的比值，即空气中氮同位素的标准比值，数值为1/272。

水样：¹⁵N绝对丰度(mg/L)=AT%×${\rm{C}}_{{\rm{NO3}}}^ - $×0.01× 15/(15+16×3)

基质、植物、鱼体：¹⁵N绝对丰度(mg/g)=N%× AT%×0.1

本实验海水人工湿地处理系统脱氮的质量守恒公式如下：

N_T(100%) = N_m(%) + N_f(%) + N_p(%) +N_s(%) + N_n(%) + N_o(%)

式中，N_T表示氮总量，N_m表示微生物去除的氮量，N_f表示鱼体吸收的氮量，N_p表示植物吸收的氮量，N_s表示基质吸附的氮量，N_n表示残饵粪便吸收的氮量，N_o表示水体中未除去的氮量。

采用Origin2018软件作图进行图像制作，采用SPSS 16.0对数据进行显著性检验和相关性分析。

海水人工湿地系统对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$、${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$、${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$和可溶无机氮(DIN)的去除效果如图3所示，养殖池中${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$初始浓度为(0.26±0.02) mg/L，添加氮同位素后经系统循环运行1 d，检测进水浓度为(0.74± 0.04) mg/L，储水池内${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度下降至(0.44± 0.02) mg/L，去除率达(40.55±1.79)%；循环运行7 d时，储水池内${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度下降至(0.29± 0.02) mg/L，去除率达(60.82±1.90)%；运行14 d时，储水池内${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度下降为(0.26±0.03) mg/L，人工湿地对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除率可达(64.87±1.40)%；循环运行21 d时，储水池中水体${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度为(0.05±0.03) mg/L，去除率达到(92.81±1.21)%，去除效果理想。养殖池中${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$初始浓度为(2.08±0.07) mg/L，经系统循环运行1 d后，进水浓度为(3.83±0.04) mg/L，储水池内${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$浓度下降至(0.39±0.02) mg/L，去除率达(89.87±1.43)%；在循环运行7 d后，储水池内${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$浓度为(1.63±0.07) mg/L，去除率达(57.55±1.22)%；系统运行14 d时，储水池内${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$浓度下降为(1.25±0.03) mg/L，人工湿地对${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$的去除率达到(64.77±1.12)%；循环运行21 d后，储水池中水体${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$浓度为(0.56±0.04) mg/L，去除率达到(85.35±1.33)%，去除效果较好。

养殖池中${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$初始浓度为(0.17±0.01) mg/L，经系统循环运行1 d后，进水浓度为(0.23± 0.02) mg/L，储水池内${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$浓度下降至(0.06± 0.01) mg/L，去除率达(74.86±0.99)%；循环运行7 d后，储水池内${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$浓度下降至(9.30±1.11)× 10^–3 mg/L，去除率达(95.96±1.21)%；系统运行14 d时，储水池内${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$浓度下降为(1.80±0.92)× 10^–3 mg/L，人工湿地对${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$的去除率达到(99.22± 1.23)%；循环运行21 d后，储水池中水体${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$浓度为(0.02±0.01) mg/L，去除率达到(93.27±1.21)%，去除效果较理想。

养殖池中DIN初始浓度为(2.51±0.07) mg/L，经系统循环运行处理1 d后，进水浓度为(4.80± 0.04) mg/L，储水池内DIN浓度下降至(0.89±0.05) mg/L，去除率达(81.54±1.43)%；在循环运行7 d后，储水池内DIN浓度为(1.93±0.05) mg/L，去除率达(59.90± 1.20)%；系统运行14 d时，储水池内DIN浓度下降为(1.51±0.04) mg/L，人工湿地对DIN的去除率达到(68.57±1.21)%；循环运行21 d后，储水池中水体DIN浓度为(0.63±0.04) mg/L，去除率达到(86.88±1.43)%，去除效果较好。

图3

图3 　不同时间段海水人工湿地养殖池中各形态氮的去除效果 Fig. 3 　Removal effect of ${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$, ${\rm{NH}}_4^ + {\rm{ - N}}$, ${\rm{NO}}_2^ - {\rm{ - N}}$ and DIN in culture pond of marine constructed wetland at different periods

人工湿地下行池和上行池中植物和各层基质δ¹⁵N值如图4所示，将基质层整体来看，各层基质中煤渣层的δ¹⁵N值最低，为(203.58±2.87)‰，珊瑚石层的δ¹⁵N值最高，为(303.66±2.22)‰，高于细砂层(3.86±1.19)%，高于煤渣层(49.16± 1.79)%，基质中δ¹⁵N值平均值为(133.27±1.57)‰。学者在研究不同基质在人工湿地脱氮中的应用中发现，湿地各层基质对氮的去除主要依靠吸附作用^[32]，细砂层对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的吸附主要是物理吸附，细砂层间隙较小，表面积较大，导致水流速率较慢，流经细砂层的时间长，因此细砂与尾水充分接触，有利于吸附尾水中的氮污染物。

从每层基质来看(图4)，细砂层在人工湿地下行池和上行池的δ¹⁵N值相近，下行池细砂层δ¹⁵N值为(145.36±3.23)‰，上行池细砂层δ¹⁵N值为(147.01±2.47)‰，下行池与上行池δ¹⁵N的差值为(1.12±0.25)%，细砂对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的吸附作用同样良好。下行池煤渣层δ¹⁵N值为(115.86±2.23)‰，上行池煤渣层δ¹⁵N值为(87.73±2.33)‰，下行池的煤渣层高于上行池(32.06±0.75)%，吸附效果强于上行池。下行池珊瑚石层δ¹⁵N值为(167.09±2.34)‰，上行池珊瑚石层δ¹⁵N值为(136.58±2.09)‰，下行池珊瑚石层高于上行池(22.34±0.34)%。下行池植物中δ¹⁵N值为(79.17±1.34)‰，上行池植物中δ¹⁵N值为(72.85±1.21)‰，平均值为(76.01±1.17)‰，低于基质中δ¹⁵N值的(42.97±2.79)%。两个流池植物中δ¹⁵N值差别较小，上行池植物中δ¹⁵N值仅比下行池植物低(7.98±1.09)%。

图4

图4 　海水人工湿地各层基质样品中δ15N值变化 Fig. 4 　Variation of δ15N value in substrates samples in each substrate layer of marine constructed wetland

植物和各基质层中氮含量及¹⁵N的绝对丰度如表1所示。实验结果表明，各基质层氮含量比较接近，煤渣层的氮含量最高，为(0.12±0.02)%，基质平均氮含量为(0.05±0.02)%。下行池基质平均氮含量高于上行池基质的(63.64±2.13)%；植物中平均氮含量为(2.68±0.38)%，下行池植物氮含量低于上行池植物氮含量(18.31±1.43)%。植物和基质层中¹⁵N原子百分比均高于标准值，下层基质原子百分比为(0.43±0.01)%，上层基质细砂层S1和S6处原子百分比为0.42%，中层基质煤渣层S2和S5处为(0.41±0.01)%。与各基质层δ¹⁵N值变化趋势一致，珊瑚石层对¹⁵N的富集作用最强，基质中¹⁵N平均AT%值为(0.42±0.01)%，植物中¹⁵N平均AT%值为(0.40±0.01)%。

表1

表1 　基质和植物中氮含量和15N绝对丰度 Tab. 1 　The amount of nitrogen and absolute abundance of 15N in substrates and plants 样品 sample 氮含量/% nitrogen content 原子 百分比/% atomic percentage 15N绝对丰度/ (mg/g) 15N absolute abundance 基质S1 substrate S1 0.07 0.42 2.98×10-3 基质S2 substrate S2 0.07 0.41 3.03×10-3 基质S3 substrate S3 0.04 0.43 1.50×10-3 基质S4 substrate S4 0.03 0.42 1.44×10-3 基质S5 substrate S5 0.05 0.40 2.09×10-3 基质S6 substrate S6 0.03 0.42 1.22×10-3 下行池植物downlink plants 2.41 0.40 95.25×10-3 上行池植物upstream plants 2.95 0.39 115.97×10-3

表1 　基质和植物中氮含量和15N绝对丰度 Tab. 1 　The amount of nitrogen and absolute abundance of 15N in substrates and plants

初始进水¹⁵N的绝对丰度为1.20 mg/L，经系统循环处理7 d后，水体中¹⁵N的绝对丰度下降至(3.23±0.65)×10⁻² mg/L (如图5所示), ¹⁵N同位素去除率达(97.31± 0.36)%; 14 d后，水体中¹⁵N的绝对丰度下降至(2.89±0.66)×10⁻² mg/L, ¹⁵N同位素去除率为(97.59± 0.76)%; 21 d后，¹⁵N绝对丰度降至(1.31±0.50)× 10⁻² mg/L，最终¹⁵N同位素的去除率为(98.91± 1.06)%，与${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除率基本保持一致。

图5

图5 　水样中15N绝对丰度 Fig. 5 　Absolute abundance of 15N in water sample

各层基质中¹⁵N绝对丰度如图6所示，下行池中煤渣层¹⁵N含量最高，绝对丰度达到(3.03± 0.06)×10⁻³ mg/g，单位质量吸附¹⁵N能力最强；上行池表层细砂层¹⁵N含量最低，绝对丰度为(1.22±0.02)×10⁻³ mg/g，单位质量吸附¹⁵N能力最弱。基质绝对丰度平均值为(2.04±0.80)×10⁻³ mg/g，煤渣层的绝对丰度为(5.12±0.06)×10⁻³ mg/g，高于细砂层(21.90±0.09)%，高于珊瑚石层(74.15± 0.08)%；植物绝对丰度平均值为(105.61±14.65)× 10⁻³ mg/g，远高于各基质的绝对丰度。综上所述，植物单位质量吸收氮素的能力最强。

图6

图6 　海水人工湿地各基质层15N绝对丰度S1−S3依次分别是下行池的细砂层，煤渣层和珊瑚石层；S4−S6依次分别是上行池的珊瑚石层，煤渣层和细砂层. Fig. 6 　Absolute abundance of 15N in each substrates layer of marine constructed wetlandS1−S3 indicate fine sand, coal cinder and breakstone in the down-flow chamber, respectively. S4−S6 indicate breakstone, coal cinder and fine sand in the up-flow chamber, respectively.

构建人工湿地系统初期，采用控制变量的方法研究了基质、植物和微生物3种不同组分对人工湿地脱氮的贡献：(1) 未种植互花米草条件下向人工湿地系统中填充基质，且将基质中所有微生物灭活；(2) 未种植互花米草条件下向人工湿地系统中填充基质，允许微生物正常生长；(3) 种植互花米草的条件下填充基质，对微生物不做任何处理，允许微生物的生长。实验结果表明，仅填充基质且灭活微生物时人工湿地系统脱氮效率为44.70%，种植互花米草后，脱氮效率提高了21.90%，允许微生物生长后脱氮效率又显著提高了18.11%。如图7所示，在系统运行前投入的120 mg同位素，经过21 d不间断循环运行后，植物对¹⁵N的吸附量为10.44 mg，基质对¹⁵N的吸附量为7.75 mg，鱼体中¹⁵N同位素含量为18.22 mg，微生物反应去除的¹⁵N同位素总量为72.92 mg，粪便中¹⁵N同位素含量为9.36 mg，水体内未被去除的同位素含量为1.31 mg。微生物去除的同位素含量高于植物吸收的375.77%，高于基质吸附的60.23%，因此，微生物对尾水的脱氮对人工湿地脱氮的贡献大于植物和基质。

图7

图7 　海水人工湿地系统各组分15N的去除量 Fig. 7 　15N removal quality of each component in marine constructed wetland

由实验结果可知，在0~7 d运行期间，储水池内${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度呈明显的下降趋势，阶段去除率有较大的提升，完成了大部分${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除，可能是因为海水人工湿地系统0~7 d运行期间以植物吸收和基质吸附作用为主，而养殖池产出${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的速率小于人工湿地系统的去除效率，${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除效果明显，在7 d内完成了系统中50%以上${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除；相比之下0~7 d的去除速率明显高于7~14 d的运行阶段，7~14 d运行期间${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度呈缓慢的下降趋势，去除率变化不大。这可能是因为系统循环7 d后，由于植物吸收和基质吸附作用逐渐趋于饱和，牙鲆养殖池产出${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的速率与人工湿地去除的速率近乎平衡，导致去除效果不明显，需要通过人工湿地系统多次循环来增强效果；14~21 d运行期间，储水池中水体${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度为(0.05±0.03) mg/L，去除率达到(92.81± 1.21)%，此阶段人工湿地对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除则以微生物的脱氮反应为主，植物吸收和基质吸附作用有限，达到饱和量后表现为作用减弱，微生物的作用占比较高，反应速率较快，变化显著。因此，本系统中的植物、基质、微生物的多重作用取得了较好的氮去除效果。

随着时间的推移，人工湿地各部分δ¹⁵N值的含量趋于稳定，两个流池中相同组分的δ¹⁵N值趋于接近，最终¹⁵N同位素的去除率为(98.91±1.06)%，与${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除率基本保持一致。因为¹⁵N和¹⁴N间存在同位素的分馏效应，随着反应的进行最终二者去除率相当，同位素的分馏效应逐渐弱化，¹⁵N的去除也在系统脱氮中与¹⁴N达到一致的反应程度，保证同位素定量分析结果的准确性。

黄娟等^[33]发现潜流人工湿地系统表层基质对氮的去除主要是通过吸附作用。本系统中，下行池基质层的δ¹⁵N值高于上行池基质层，这可能与人工湿地内部水流走向有关，养殖尾水经潜水泵的运送，先流入下行池，再进入上行池，尾水流经下行池时，基质吸附和微生物的共同作用首先使氮污染物浓度有所下降，致使上行池中下层基质¹⁵N的富集程度低于下行池中下层基质。此外，${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除是中上层植物、基质、微生物共同作用的结果，植物根系发达，最远可深扎于煤渣层，是${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$去除的关键组成部分，，主要归于微生物转化和基质吸附作用，且底层填料珊瑚石为镂空结构，孔隙率和表面粗糙度较大，与尾水的接触面积进一步增大，可充分吸附系统中氮污染物，最终获得δ¹⁵N值较高。

此外，本系统中基质和植物中¹⁵N同位素AT%均高于环境大气中标准值，表明二者对¹⁵N同位素具有富集效应，但植物氮含量显著高于基质，这可能因为基质主要利用其表面的吸附作用除氮，氮元素无法被吸收进基质内部，但植物可以直接利用氮素组成自身物质，其会通过持续地转化吸收氮营养盐作为自身能量供给^[34]，下行池和上行池植物中¹⁵N含量均呈现整体上升的趋势，由此可见植物在本实验前期总体处于持续吸收氮营养盐状态。然而，在添加同位素前下行池植物中¹⁵N值高于上行池植物，添加同位素后，则表现为相反的趋势，经长期运行后尚达到稳态，且运行前期下行池和上行池植物¹⁵N值差别较小，表明前期下行池和上行池植物吸收利用氮营养盐的能力均较强，而运行后期两个流池中植物¹⁵N含量相同，表明植物后期对氮的吸收能力减弱，趋于饱和状态，这与侯洁^[35]在构建生物炭微型人工湿地系统中植物发挥的作用一致。

随着时间的推移，两个流池表层基质¹⁵N含量的差距越来越小至达到平衡状态，最终达到平衡点所用时间比植物吸附所需时间更短，这表明表层基质对添加同位素这个变量的适应性和稳定性强于植物。本实验还表现出在人工湿地运行前期基质的物理吸附作用便可迅速达到一定的脱氮效果，后期因达到吸附饱和量导致吸附能力下降，吸附作用有限。这是由于在人工湿地长期运行的情况下，基质仅为植物和微生物提供生长环境和附着位点，基质一旦吸附位点饱和，基质吸附表现为惰性，无法持久有效吸收氮素^[36]，另有研究表明，组合基质的人工湿地吸附能力明显强于单一基质^[33]，在选择基质材料时可考虑吸附能力强、穿透周期长的基质。因此在以后的研究中可开发搭配不同的基质以提高湿地系统吸附氮素能力。

本实验同位素的添加方式使得牙鲆在系统运行初期摄入大量同位素，前期表现为鱼体内¹⁵N含量大幅度增加，随着时间的推移才逐渐排出体外，后期呈现明显的下降趋势，表明¹⁵N被牙鲆逐渐排出体外，进入水体转移到人工湿地系统内，被湿地系统各处理单元吸附，最终鱼体中¹⁵N值降至最低。而鱼粪中δ¹⁵N值的变化趋势表现为一直处于较低状态，这可能是由于前期鱼体大量摄入同位素导致排出体外的同位素含量较少，因鱼体内的δ¹⁵N值变化缓慢，鱼粪中的δ¹⁵N值亦变化缓慢；后期牙鲆以可溶物的形式将同位素大量排出体外，粪便中¹⁵N含量亦大幅减少，最终鱼粪中δ¹⁵N值仅为5.63‰。在后续的研究中，可进行更长实验周期的模拟处理，探究并验证在更长时间尺度下鱼体中的¹⁵N值是否继续降低。

笔者将两个时期的人工湿地系统各组分脱氮贡献进行对比，发现在海水人工湿地构建初期，基质、植物和微生物对脱氮的贡献分别为44.70%, 21.90%和18.11%，基质的吸附作用在湿地系统脱氮中占主导作用，植物和微生物对脱氮的贡献较少，总计约占基质贡献率的50%；但随着时间的延长，海水人工湿地平稳运行进入成熟期，基质和植物的脱氮效果逐渐饱和，此时微生物经历生长繁殖后，数量及活性均得到显著的增强，它对氮元素的去除作用在海水人工湿地系统脱氮中的作用远大于植物的吸收量和基质的吸附量。微生物的脱氮包含了微生物同化和微生物反应两方面，微生物通过同化作用将污染物中利用氮素用于代谢或合成自身物质；微生物的氮去除反应主要包括氨化作用，硝化作用，反硝化作用，厌氧氨氧化作用等，人工湿地系统除氮主要依靠反硝化作用，将${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$转化为N₂从系统中去除。本实验中微生物可通过硝化反硝化作用除去海水养殖尾水中的氮污染物，反应速率较快，浓度和去除率变化显著，导致其脱氮作用占比越来越高，最终在海水人工湿地脱氮贡献中占主导途径。微生物对${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$的去除贡献率达60.77%，超过人工湿地脱氮总量的50%，成为人工湿地${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$去除的主要贡献者，这与Matheon等^[37]研究的表面流人工湿地中微生物成为后期脱氮的主要贡献者研究一致，但相比Fleuir的研究，微生物的贡献率稍低一些，可能是因为不同类型的人工湿地中微生物群落丰富度及多样性不同从而影响脱氮效率。成熟期植物吸收对该海水人工湿地系统${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$去除的贡献率为8.70%，不足10%，与之前Maltais-Landry等^[38]、Rocha等^[39]和Coban等^[40]的研究结果相符，植物贡献率对人工湿地脱氮的贡献均不超过20%，表明人工湿地系统后期植物吸收氮素功能趋于饱和，不再是主要贡献者。但本实验尚不具备对N₂的收集和同位素测定条件，无法精确定量微生物反硝化作用在微生物氮去除中的贡献和占比，这将是今后研究的重点方向。而水体中尚未去除的${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$为1.09%，这相比吴俊泽^[41]利用氮稳定同位素技术研究海水人工湿地系统脱氮的尚未去除率较低，表明本实验构建的人工湿地系统及同位素使用方法在一定程度上有所提升，可能本实验运行时间较长，导致水体中氮的未去除率极低。此外，鱼体吸收的氮含量为15.18%，但因目前尚无外加氮同位素条件下鱼体吸收量的研究，无法进行对比分析，本研究也为氮同位素示踪技术应用于追踪各组分单元吸收氮量弥补研究空白，今后可继续进行深入研究。

本研究利用氮稳定同位素技术研究了氮在人工湿地的迁移转化过程，并结合质量平衡法定量不同脱氮途径对人工湿地系统脱氮的贡献。该复合垂直流人工湿地对尾水氮元素去除具有较好的效果，经循环运行，出水口${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$浓度显著降低，21 d后去除率可高达(92.81±1.21)%。植物中¹⁵N绝对丰度平均值及氮含量远高于各基质层水平，单位质量吸收氮素的能力最强。人工湿地构建初期脱氮主要依靠基质的吸附作用，基质吸附和植物吸收对脱氮的贡献大于微生物作用的贡献；系统运行后期微生物成为人工湿地脱氮的主要贡献者，超过人工湿地脱氮总量的50%，植物对人工湿地脱氮的贡献不足10%，基质对人工湿地脱氮的贡献又低于植物对脱氮的贡献。其中，微生物的脱氮反应主要包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用和厌氧氨氧化作用，人工湿地主要依靠微生物的反硝化作用脱氮，将${\rm{NO}}_3^ - {\rm{ - N}}$转化为N₂从系统中去除，但本实验尚不具备收集N₂以及测定同位素的条件，尚缺少验证反硝化作用在微生物脱氮过程中贡献和占比的理论依据，这也将是今后深入研究的重点。