2023, Vol. 30 
2. 湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000
2. College of Life Science, Huzhou University, Huzhou 313000, China
大口黑鲈(Micropterus salmoides)又名加州鲈，隶属于鲈形目(Perciformes)，太阳鱼科(Cehtrachidae)，黑鲈属，原产于北美，20世纪70年代从台湾地区引入大陆后于1983年繁殖成功，并开始人工养殖。据统计，2021年我国大口黑鲈年产量已超过70万t[1]，大口黑鲈产业在渔业转型升级和乡村振兴过程中发挥着重要作用。目前，膨化配合饲料已基本取代冰鲜饵料在大口黑鲈人工养殖过程中得到普及。糖类物质是鱼类配合饲料中的重要组成部分，一方面“糖”是最为经济的非含氮供能物质，能够节约成本和减少对养殖水体的污染，另一方面则有助于颗粒饲料的膨化[2]。然而，源于在野外条件下面临的高蛋白低糖的摄食环境，鱼类(尤其是肉食性鱼类)在漫长的进化过程中适应性地形成了“糖不耐受”的体质[3]。作为一种肉食性鱼类，大口黑鲈对于糖的利用能力可能较虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、南方鲇(Silurus meridionalis)和大西洋鲑(Salmo salar)等其他肉食性鱼类更差[4]。Amoah等[5]发现饲料糖添加水平在13%时，大口黑鲈增重率最高。随后有学者指出，大口黑鲈饲料中可消化淀粉水平应控制在10%以内[6]。摄食过多的糖类会导致大口黑鲈出现生长缓慢、死亡率上升、肝脏组织空泡化、引发炎症反应等现象[7-8]。因此，研究养殖鱼类，尤其是肉食性鱼类的糖代谢问题一直以来都是学术界的热点之一。
葡萄糖是饲料中的糖类物质在机体内消化后的主要产物[3]。经消化吸收的葡萄糖，约1%可直接通过尿和鳃排出体外[9]，大多数则由血液运输到各个部位进行多种合成与分解代谢，如糖酵解、糖异生、糖原合成与分解等[10]，众多酶类共同参与从而维持血糖维持在一个特定的范围，即血糖的稳态平衡。己糖激酶(hexokinase, HK)和磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)是糖酵解途径的限速酶，分别起始该代谢途径的两个磷酸化反应步骤，而糖酵解也是所有生物(包括鱼类)分解葡萄糖的唯一途径[11]。哺乳动物研究表明，刺激糖酵解是机体在高糖胁迫下维持糖稳态的有效方式之一[12]。对鱼类的一些研究也发现HK酶活性和pfk的基因表达随着饲料糖水平的上升而增强[13-14]。然而，Su等[15-16]对长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)的研究结果显示，糖酵解途径并不受饲料糖水平的调控。在南方鲇中也有类似的发现[17]，说明饲料糖对糖酵解的调控可能存在种属差异。糖异生是机体利用甘油、乳酸、氨基酸等为底物合成葡萄糖的过程。鱼类拥有高效的葡萄糖内源合成能力，在高糖饲喂条件下，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase, G6P)等糖异生途径关键酶[18]基因的转录仍然活 跃[19-21]。因此，糖异生不受控一直以来被认为是鱼类无法有效地维持血糖稳态的重要原因之一。糖原是葡萄糖在机体内储存的主要形式，与高等脊椎动物一样，鱼类可以将多余的葡萄糖以糖原的形式储存于肝脏和肌肉中[22]。大量研究报道指出，肝糖原的代谢(合成和分解)与血糖水平具有正相关性[23-24]。与肝糖原不同，肌糖原的分解主要取决于肌肉组织对ATP的需求(如快速游动等)，而不受禁食等低血糖状态的影响[22,25]。虽然肌肉组织对于糖原的储存能力(0.4~2 mg/g)远低于肝脏组织 (200 mg/g)，但由于肌肉组织在体重中占有很大比例(>50%)，肌糖原的总体含量可能高于肝糖原[26]。因此，肌糖原动员的“封闭性”也不利用鱼类对糖的利用。此外，在禁食等状态下动用糖原分解供能也具有种属特异性。在欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)、金头鲷(Sparus aurata)、褐鳟(Salmo trutta)等的研究指出，禁食初期，其肝糖原就开始大量分解以维持血糖稳态平衡；相比之下，鲤(Cyprinus carpio)、美洲鳗(Anguilla rostrata)、大西洋鲑等更加偏向于分解脂肪供能[27]。作为糖原分解的限速酶，目前对于糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)的研究还相对较少。
综上所述，养殖鱼类对饲料糖的利用既具有复杂性又具有种属差异性。为此，本研究以我国重要的肉食性经济养殖鱼类大口黑鲈为对象，采用RT-PCR技术克隆了参与大口黑鲈糖稳态调节途径关键基因hk、pfk、pepck1、pepck1、g6p、gp1和gp2的全长序列，研究了其在不同组织中的表达丰度，并探讨了这些基因在禁食条件下的分子应答。本研究结果可丰富cDNA基因文库，为进一步深入研究大口黑鲈葡萄糖稳态调控提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 实验鱼准备及样品收集本实验基因克隆用鱼(6尾)购买于当地一个商业市场，体重约为500 g (性别随机)。实验正式开始前，先将实验鱼在自然条件下暂养于500 L塑料桶中，并提供>5.0 mg/L氧气。约6 h后，使用0.01%的2-苯氧基乙醇(Sigma-Aldrich)对实验鱼进行麻醉，随后快速剖取肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、前肠、中肠、后肠、鳃、脂肪(腹腔肠系膜)和心脏组织，用预冷的磷酸盐缓冲液(pH=7.4，碧云天生物科技有限公司)漂洗2遍，于液氮中快速冷冻，最后转移至–80 ℃保存备用。为研究目标基因对禁食的应答，将240尾体重为(49.08±4.39) g的实验鱼(由广东梁氏水产种业有限公司提供，佛山，广东)随机分为4组，每组3个重复，每个重复20尾鱼，饲养于500 L的塑料桶中(自然光照，溶解氧>5.0 mg/L)，每天在8:30, 12:30, 16:30用商业饲料(福建天马饲料有限公司)进行饱食投喂。最后一餐后，先对实验鱼禁食12 h (定为禁食第0 h)再继续进行禁食，并分别在禁食第0、6、12、24小时按照上述方法收集实验鱼的肝脏和肌肉组织(每个桶随机采集4尾鱼)，于液氮中快速冷冻，再转移至–80 ℃保存备用。
1.2 基因克隆根据本研究室前期大口黑鲈的转录组数据库[28]，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST程序，经与其他物种上的同源基因进行比对以及使用DNAstar软件的SeqMan程序进行序列拼接，最终确定目标基因序列。使用Primer 5.0设计特异性引物，进行基因扩增(表1)。
使用商业的RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, China)试剂，根据说明书推荐步骤从肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、前肠、中肠、后肠、鳃、脂肪和心脏组织中提取总RNA。将提取的RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳以确定其完整性，同时使用核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., Shanghai, China)对其进行定量检测。采用商业的反转录试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)进行cDNA的合成。将获得的cDNA样品进行等体积混合，作为PCR扩增的模板。扩增体系包括上游和下游引物(10 μmol/L)各2 μL，无菌超纯水19 μL, Taq PCR反应混合物(天根生化科技有限公司，北京，中国) 25 μL以及cDNA 2 μL (50 ng)。采用降落PCR程序进行扩增(Eppendorf, Hamburg, Germany)，包括94 ℃, 3 min; 94 ℃, 30 s；退火(I), 30 s; 72 ℃，延伸，按照每个循环降1 ℃，共16个循环的速度进行温度的渐降；然后，94 ℃, 30 s；退火(II), 30 s; 72 ℃，延伸；经历18个循环；最终72 ℃延伸10 min。其中，各个基因两次退火的温度以及延伸时间见表1。
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用商业试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国)对目的条带进行纯化，将纯化后的产物连接到pMD™19-T克隆载体(TaKaRa, Dalian, China)上，随后导入感受态细胞DH5α (天根生化科技有限公司，北京，中国)中，挑取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，并使用DNAMAN进行序列拼接。
1.3 序列分析使用在线软件包(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)进行氨基酸序列的翻译，并在NCBI数据库中进行BLAST比对。使用在线软件ExPAsy (https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白分子量、理论等电点和氨基酸含量的预测。使用Clustal X2程序进行氨基酸序列的多重比对分析。采用MEGA7.0对目标基因序列进行比对，使用最大似然法构建进化树，bootstrap值设置为1000。
1.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)使用Primer 5.0设计用于qRT-PCR的特异性引物(表1)。正式实验开始之前，先将cDNA样品进行梯度稀释以检测引物的扩增效率。按照上述方法，提取总RNA，并进行cDNA的合成。利用qRT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)对肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、肠(前肠、中肠和后肠的等量混合物)、鳃、脂肪和心脏组织目标基因的表达丰度以及禁食状态下目标基因的转录进行分析。每个基因表达的检测包括3个重复，采用20 μL反应体系，10 μmol/L的上游和下游引物各0.8 μL，无菌超纯水7.4 μL, 2×Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., Shanghai, China) 10 μL以及cDNA模板1 μL (25 ng)。PCR扩增程序为95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s，特定温度1 min, 72 ℃ 1 min, 40个循环。最后，通过熔解曲线确定产物的单一性。各引物的特定退火温度见表1。同时，引入两个阴性对照(无cDNA和RNA)进行qRT-PCR以确保只有cDNA被成功扩增。本研究选取beta-actin (MH018565.1)作为管家基因对目标基因表达量进行标准化，根据相对定量法[29-30]将结果表示为相对于对照组基因表达量的倍数。
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表1 qRT-PCR引物序列 Tab. 1 Primers used for qRT-PCR |
数据以平均值±标准差($\bar x{\rm{ \pm SD}}$)的形式表示。采用SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)软件进行单因素方差分析，并采用Duncan’s进行多重比较(差异显著：P<0.05)。正式统计分析前，先对数据进行正态性和方差齐性检验。
2 结果与分析 2.1 序列分析本实验共获得7个参与大口黑鲈糖稳态调控相关基因gp1, gp2, pepck1, pepck2, hk, g6p和pfk的完整编码序列(GeneBank登录号：OQ401776~ OQ401782)，全长分别为2637 bp、2529 bp、1908 bp、1875bp、2757 bp、1017 bp和2343 bp，编码878、842、635、624、918、338和780个氨基酸。利用ExPAsy软件预测，GP1蛋白分子量为100.63 kD，理论等电点为6.28，富含亮氨酸(9.5%); GP2蛋白分子量为97.18 kD，理论等电点为6.61，富含亮氨酸(8.6%); PEPCK1蛋白分子量为69.40 kD，理论等电点为8.71，富含甘氨酸(9.6%); PEPCK2蛋白分子量为69.19 kD，理论等电点为6.07，富含甘氨酸(8.5%); HK蛋白分子量为102.64 kD，理论等电点为5.93，富含亮氨酸(9.9%); G6P蛋白分子量为37.91 kD，理论等电点为9.21，富含亮氨酸(11.8%); PFK蛋白分子量为84.92 kD，理论等电点为6.82，富含甘氨酸(9.9%)。经过BLAST比对分析发现，这些基因编码的氨基酸序列与其他哺乳动物和硬骨鱼类同源序列具有很高的相似性(表2)。
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表2 大口黑鲈gp1、gp2、pepck1、pepck2、hk、g6p和pfk基因编码的氨基酸序列与其他物种同源氨基酸序列相似性 Tab. 2 Amino acid sequence identity of gp1, gp2, pepck1, pepck2, hk, g6p, and pfk between l Micropterus salmoides and other species % |
为进一步探究目标基因与其他物种同源基因的进化关系，于NCBI数据库收集来自其他脊椎动物的氨基酸序列构建系统进化树。结果显示，大口黑鲈的gp2首先和斑马鱼(Danio rerio)聚为一支，置信值为64%，然后与大西洋鲑聚为一支，之后再与大口黑鲈gp1形成一个大的分支(图1a)；总体而言，鱼类和其他脊椎动物的pepck分别聚成一支。其中，大口黑鲈的pepck1和pepck2分别以100%和98%的置信值与同属鲈形目的花鲈(Lateolabrax japonicus)和鳜(Sinipera chuatsi)聚成一支(图1b)；对于hk，大口黑鲈和虹鳟形成一支，置信值为63%，再与斑马鱼和斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)形成一个较大的分支(图1c)；与pepck1类似，大口黑鲈的g6p与同属鲈形目的花鲈聚在一起，随后依次与牙鲆(Paralichthys olivaceus)、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和虹鳟形成一个区别于其他哺乳动物的较大分支(图1d)；而大口黑鲈的pfk则与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的pfk以100%的置信值聚成一支，再和团头鲂(Megalobrama amblycephala)与斑马鱼pfk形成一个较大的分支(图1e)。
2.3 组织表达分析采用qRT-PCR方法对大口黑鲈肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、肠、鳃、脂肪和心脏组织中gp1、gp2、pepck1、pepck2、hk、g6p和pfk的基因表达水平进行检测。如图2所示，基因层面上，这些基因总体上广泛表达于各个组织，但不同基因仍表现出特定的组织表达特性。其中，参与糖原分解的gp1和gp2基因均在肌肉组织表达量最高。此外，gp1在除脾脏外的多个组织均有较为丰富的分布，尤其是在肝脏中的表达，仅次于肌肉组织。相较而言，gp2则主要集中分布于心脏、肝脏和鳃等少数几个组织中，在其余组织的分布则相对较少；对于糖异生途径限速酶基因，肝脏pepck1, pepck2和g6p的表达显著高于其余组织。除此之外，pepck1依次在肠、鳃、心脏和肌肉呈现较高的mRNA水平，pepck2则依次在脑、脂肪、肌肉、心脏和肾脏分布相对丰富，g6p基因依次在肌肉、脂肪、肠的转录水平更高。参与糖酵解的hk和pfk基因，hk在肝脏、肌肉和心脏的表达量最高，而在脑、脾脏和脂肪分布最少；与之类似，pfk的转录水平也在肝脏和心脏最高，在鳃和肠的转录水平次之，而在其余组织的mRNA水平最低。组织层面的热图显示，这些基因主要集中在肝脏和肌肉组织进行高表达，而在脑、脾、肾的表达量则相对较低。
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图1 大口黑鲈和其他脊椎动物gp1 (a)、gp2 (a)、pepck1 (b)、pecpk2 (b)、hk (c)、g6p (d)和pfk (e)的系统进化树(最大似然法)节点处数字表示1000次自举检验置信度， Fig. 1 Phylogenetic tree of gp1 (a), gp2 (a), pepck1 (b), pecpk2 (b), hk (c), g6p (d), pfk (e) from Micropterus salmoides and other vertebrate species using the Maximum Likelihood methodValues at branch-points represent percentage frequencies for tree topology after 1000 iterations. |
利用qRT-PCR检测实验大口黑鲈肝脏和肌肉组织gp1、gp2、pepck1、pepck2、hk、g6p和pfk基因在禁食0、6、12和24 h后mRNA水平的变化。如图3所示，对于肝脏中的两个gp亚型基因，gp1随着禁食时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，在禁食第6小时表达量最高，第24小时表达量最低。与之不同，gp2的转录随着禁食时间的延长持续增强，第12和24小时的表达明显高于0 h。对于肝脏pepck，两个亚型表现出不同的变化趋势。pepck1的基因表达不受营养状态的显著调节，而pepck2的最低表达量出现在禁食第0 h。肝脏hk基因的变化与gp1一致，其mRNA水平分别在第6和24小时最高和最低。与pepck2一样，禁食0 h时g6p的mRNA水平显著低于其他组。pfk的表达随着禁食时间延长出现先升高后降低的趋势，在禁食第6小时出现表达峰值，直到第24小时恢复到0 h的转录水平。
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图2 Gp1、gp2、pepck1、pepeck2、hk、g6p和pfk基因在大口黑鲈不同组织中的表达丰度1：肝；2：肌肉；3：脑；4：脾；5：肾；6：肠；7：鳃；8：脂肪；9：心脏. 鳃为对照组，不同字母表示该基因表达丰度在不同组织间差异显著(P<0.05). Fig. 2 Expression abundance of gp1, gp2, pepck1, pepeck2, hk, g6p and pfk genes in different tissues of Micropterus salmoides1: liver; 2: muscle; 3: brain; 4: spleen; 5: kidney; 6: intestine; 7: gill; 8: lipid; 9: heart. Gill was defined as the control group. Different letters indicate significant differences between the expression abundance in different tissues (P<0.05). |
肌肉中，gp两个亚型的基因表达均表现出上升的趋势。其中，每个采样时间点gp1的表达均显著高于前一时间点。除0和6 h之间无显著差异外，gp2也表现出相同于gp1的表达变化模式。总体上，pepck两个亚型也呈现出类似的变化趋势，即随着禁食时间延长，表达量逐渐上升。禁食12和24 h后，pepck1的表达显著高于其余两组，而0 h时最低。禁食24 h时pepck2出现表达峰值。为应对禁食，参与糖酵解的基因hk和pfk表现出先上升后下降的相同变化模式，分别在第6和0小时表达量最高和最低。而g6p的转录则随着禁食时间延长而逐渐增强，并在第24小时达到峰值。
3 讨论本研究分离获得了7个参与大口黑鲈糖原分解、糖异生、糖酵解相关过程的限速酶基因。利用氨基酸序列进行多重比对，发现这些基因与其他脊椎动物同源基因具有很高的相似性。其中，与硬骨鱼类的相似性(49.30%~95.99%)高于与哺乳动物的相似性(48.44%~84.64%)，这与进化树分析结果一致，显示出与鱼类的亲缘关系更近。值得注意的是，相较于其余6个基因，g6p除了与同属鲈形目的石斑鱼具有较高的相似性(86.35%)之外，与其他脊椎动物的相似性相对较低(48%~ 61%)。宫官等[31]对西伯利亚鲟(Acipenser baerii) g6p氨基酸序列进行同源比对时发现，其与翘嘴红鲌(Chanodichthys erythropterus)和花鲈相似性较高，分别为72.7%和71.8%。然而，与真鲷(Pagrus major)和欧洲鲈的相似性却较低，分别为55.3%和56.9%，甚至低于与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)等哺乳动物的相似性。为此，本研究小组针对同属鲈形目的花鲈和鳜g6p氨基酸序列也进行了比对，发现花鲈的g6p除与同属鲈形目的石斑鱼相似性(91.09%)较高外，与其余脊椎动物的相似性在50%~62%之间。而鳜的g6p与人、小鼠、斑马鱼等的相似性也相对较低(45%~ 62%)(附图)。以上结果说明g6p基因序列在种间的差异较大，进而可能导致功能的多样性，值得后续进一步研究。
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图3 禁食处理对大口黑鲈gp1、gp2、hk、pfk、pepck1、pepeck2和g6p基因表达的影响0 h为对照组，不同字母表示不同时间不同基因表达差异显著(P<0.05). Fig. 3 Effect of fasting on gene expression of gp1, gp2, hk, pfk, pepck1, pepck2 and g6p in Micropterus salmoidesThe group 0 h was defined as the control group. Different letters indicate significant differences between gene expression of different genes at different time period (P<0.05). |
源于至今2.3~4亿年前硬骨鱼类的全基因组加倍现象[32]，鱼类可能较哺乳动物拥有更多的基因亚型，该现象在大西洋鲑[33]、虹鳟[34]等鱼类都得到了证实。本研究也分别分离鉴定了gp和pepck基因的两个亚型，这可能是鱼类基因组加倍现象造成的。而在莫桑比克罗非鱼 (Oreochromis mossambicus)中，研究人员已成功鉴定了4个gp亚型的存在[35]。
利用qRT-PCR技术检测目标基因的组织表达分布，总体结果显示参与糖异生(pepck1, pepck2和g6p)和糖酵解的基因主要集中在肝脏组织进行高表达，这可能与肝脏是物质中间代谢“枢纽”密切相关[36]。而涉及糖原分解的限速酶基因gp1和gp2则在肌肉组织的表达量最高。肌肉作为机体体重中的最大占比组织，其糖原含量可能高于肝糖原[26]。在低血糖状态下，肌糖原的大量分解可能是机体维持血糖稳态的主要对策之一，从而导致gp1和gp2在肌肉组织的表达量最高，这与本研究禁食处理后发现肌肉gp1和gp2基因的表达持续上调的结果相符。具体而言，不同基因在同一组织内的分布差异较大，而同一基因在不同组织间的表达丰度也不一致，显示出分布的独特性。例如，肌肉组织中，gp1、g6p等的表达相对较高，而pfk的mRNA水平却相对较低；hk基因除在肝脏、肌肉和心脏组织表达较为丰富外，在其余组织的表达量均较低。早在1980年，Knox等[37]在硬头鳟(Salmo gairdneri)、大西洋鳕(Gadus morhua)和欧洲鲽(Pleuronectes platessa)的研究中已指出，hk、pfk、pecpk等糖代谢相关基因的表达具有物种和组织特异性。李淑云等[38]发现卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)的pepck主要在肝脏和肾脏组织高表达，而在肠道和心脏表达量较低；而云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmoratus)的pepck主要在肝脏表达，在肌肉和脑等组织的表达较低[39]。类似地，中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)的hk主要分布在性腺[40]，而牡蛎(Crassostrea angulata)的hk几乎不在性腺表达[41]。基因在组织和物种间的差异表达暗示了功能上的差异。在小鼠中，敲除pepck基因会导致其出现明显的低血糖症而死亡[42-43]；然而，抑制hk的表达则会降低细胞对葡萄糖的酵解[44]。即使同一基因，在不同物种间的功能也不一样。杨莹[45]研究发现，在高糖日粮饲喂条件下，瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的pepck基因会受到显著抑制；然而，虹鳟的pepck基因却不受日粮糖水平的影响[46]。大口黑鲈基因在组织和物种间分布的独有特性暗示了其特有的功能特性，更多针对性的深入研究需要进一步开展。
肝脏是机体中间物质代谢的中心[36]，而肌肉则是养殖鱼类机体中最大的部位，因此，肝脏和肌肉组织是反映养殖鱼类糖稳态调节的重要组织。糖原是碳水化合物在机体的主要储存形式，且主要以肝糖原和肌糖原的形式存在[22]。Molayemraftar等[47]对银鲷(Sparidentex hasta)进行禁食后发现，鱼体在食物匮乏情况下会分解糖原以维持血糖稳态。在南方鲇的研究中也发现，饥饿条件下，肝糖原和肌糖原含量会显著下降[48]。然而，在诸如鳕、鲤等多种鱼的研究也发现，在饥饿期间，脂肪“储备”会优先于糖原被动用[22]。本研究中，肌肉组织中编码糖原分解的gp1和gp2基因以及肝脏gp2基因的转录随着禁食而出现快速显著的增强，表明大口黑鲈在禁食条件下可能偏向于优先动用糖原进行分解供能。值得注意的是，肝脏组织gp1的表达随着禁食时间的延长出现先升后降的趋势，表明大口黑鲈gp1和 gp2基因出现了功能上的分化，但具体的差异还需进一步研究，类似的研究结果在罗非鱼上也有报道[35]。糖异生是机体利用甘油、乳酸等非糖物质合成葡萄糖的过程。研究人员在鲤中发现，随着禁食时间延长，鱼体PEPCK的酶活性和基因表达均显著提高[49]。卵形鲳鲹中也同样发现，饥饿状态下PEPCK的酶活性和基因表达较饲喂状态均有所提高[50]。而本研究结果也显示，肝脏和肌肉组织中糖异生途径相关限速酶基因pepck和g6p的转录随饥饿时间延长而增强。然而，肝脏pepck1亚型却出现了不同的表达模式，即并不受营养状态的调节。据报道，pepck存在线粒体型和胞质型两种亚型。其中，胞质型受到激素、日粮等的调节，而线粒体型几乎是构成式的，不受调节[51]。目前，两种亚型在鱼上均已被成功克隆[50,52]。因此，推测本研究中克隆获得的pepck1有可能是线粒体型，这与进化树分析结果中大口黑鲈pepck1和花鲈的线粒体型pepck聚为一支的结果相对应。此外，肌肉组织pepck两个亚型均对禁食处理在基因表达层面出现了相似的分子反应。而肝脏中pepck1并不和pepck2一样受到调节，表明肌肉和肝脏组织中pepck两个亚型对糖异生的贡献率并不相同，这与研究人员在鸡(Gallus gallus domesticus)中的发现类似。该研究指出，在鸡肝脏中，几乎所有的PEPCK活性均归功于线粒体型pepck，而肾脏中胞质型和线粒体型PEPCK的活性相当[53]。在禁食和运动期间，糖异生和糖原分解是机体补充血糖的主要方式[54]。其中，糖原分解可以为糖酵解提供葡萄糖[22]。在禁食初期，随着糖原分解的增强，机体利用从糖原分解中获取的葡萄糖进行氧化磷酸化(即糖酵解)，导致在短期禁食(6 h)内肌肉和肝脏中糖酵解相关限速酶基因hk和pfk mRNA水平达到峰值。然而，随着禁食时间的持续，糖原储存逐渐耗尽，糖异生占据主导地位，导致糖酵解的“原料减少”，因而在禁食6 h后hk和pfk的转录逐渐下降。
综上所述，本研究分离鉴定了7个(gp1、gp2、pepck1、pepck2、hk、g6p、pfk)参与大口黑鲈糖稳态调控分子的完整编码序列。进化树分析结果表明这些基因与其他物种的同源物具有较高的相似性；组织表达谱结果显示这些基因在各个组织中均有不同程度的表达丰度，但总体集中在肝脏和肌肉组织中，而同一组织中不同基因以及同一基因在不同组织中的特定表达模式也反映出这些基因不同的生理功能以及功能的组织特异性；通过检测禁食对这些基因mRNA水平的影响发现，大口黑鲈会在禁食过程中同时通过糖原分解和糖异生作用维持血糖稳定。在短期禁食内，大口黑鲈仍以葡萄糖为原料进行糖酵解供能。然而，随着禁食的持续、糖原储存逐渐消耗，糖酵解减弱，鱼体可能通过其他方式(如脂肪分解等)进行能量供应。
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