鲤疱疹病毒II型(cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)，也称金鱼造血器官坏死病毒，最早于1992年由日本学者从金鱼(Carassius auratus)中分离得到^[1]，为有囊膜的线性双链DNA病毒。CyHV-2病毒粒子呈椭圆形，直径170~220 nm，与鲤痘疮病毒(CyHV-1)、锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)同隶属于鱼蛙疱疹病毒科鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)^[2-3]。CyHV-2能够感染鲫(Carassiu sauratus)及其变种如异育银鲫(Carassius auratus)、金鱼及金鱼和鲤的杂交体，且鱼卵、鱼苗、幼鱼、成鱼均易感。CyHV-2常于水温15~25 ℃时发病，在全球多个国家和地区都有流行，致死率高达90%~100%^[4-8]。近年来，我国江苏、北京、广州、武汉等地也暴发了由CyHV-2感染导致的异育银鲫大规模死亡病例，造成了重大经济损失^[9-12]。由CyHV-2感染所引发的鲫造血器官坏死病已成为严重危害我国鲫养殖业健康发展的重要疾病之一。目前，针对CyHV-2仍缺乏有效的疫苗和治疗措施，因此开发安全、高效的保护性疫苗对于预防该病的暴发和流行具有重要意义。

疫苗是预防水生动物疾病发生、保障水产养殖业绿色发展的有效途径。DNA疫苗是新型疫苗的一种，其制备成本低、容易运输和储存，且不存在毒力返强现象，免疫途径也多种多样，具有良好的发展潜力和应用前景^[13]。1996年，Anderson等^[14]首次利用传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的G基因构建了DNA疫苗，将其肌肉注射虹鳟(Oncorhynchus mykiss)后，病毒中和实验和攻毒保护实验均证实该疫苗可以诱导对IHNV的免疫保护。其后，在斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprinus carpio)、大西洋鲑(Salmo salar)等多种鱼类中的研究均表明，外源DNA能在其体内高效表达，并可诱导机体产生特异性的免疫应答^[15]。

DNA疫苗制备的关键步骤是将保护性抗原编码基因及其调控元件构建至真核表达载体上。CyHV-2相关研究中，贡成良等^[16]利用家蚕杆状病毒表达系统，构建了含有CyHV-2 4个ORF区的DNA疫苗BmNPV-FA-D4ORF，注射和口服免疫保护率分别为80.01%和59.3%，但杆状病毒系统基因片段长达100 kb，存在制备复杂、生产成本高、糖基化水平低等缺陷，限制了其在实际生产中的应用。pVAX1是专门设计用于DNA疫苗开发的真核表达载体，其可以在大肠杆菌中进行高拷贝复制，并含有CMV强启动子，能够在真核细胞中实现目的蛋白高水平表达。pVAX1还具有以下特点：(1) 其是FDA批准的可用于人体实验的载体，基因安全性高；(2) 其仅保留真核表达所需的最基本DNA序列，以最大限度减少染色体整合的可能性；(3) 因氨苄青霉素在部分机体中可诱发过敏反应，其采用卡那霉素抗性作为替代筛选基因^[17-18]。因此，pVAX1在基因安全性及制备简便程度上均优于杆状病毒表达系统。然而，目前pVAX1载体在鱼类病毒DNA疫苗开发中尚未见应用报道。

CyHV-2基因组全长290304 bp，共编码约154个开放阅读框(ORFs)^[19]。2020年，高娃等^[20]通过纯化CyHV-2病毒粒子，共鉴定出8种CyHV-2主要免疫原性蛋白，分别为ORF66、ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF72、ORF131和ORF132，其中，ORF66为核衣壳蛋白。病毒衣壳蛋白一般具有较强的免疫原性，在疫苗和免疫学检测方法开发中具有重要的应用价值。近期，张小米等^[21]对ORF66截短蛋白进行了多克隆抗体的制备及互作多肽的筛选，Guo等^[22]制备了针对ORF66的单克隆抗体并对感染细胞和组织进行了检测。然而，目前ORF66分子生物学相关研究仍十分缺乏，其高效DNA疫苗的开发也有待加强。本研究首次将ORF66全长cDNA克隆至真核表达载体pVAX1上，构建了真核重组质粒pVAX- ORF66，并进一步探索了其在GFB细胞中的表达、定位及鲫免疫保护效果。研究结果为CyHV-2 DNA疫苗的开发提供了实验基础。

M199细胞培养液、胰酶、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素溶液购自GIBCO公司；病毒DNA提取试剂盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR Taq酶、限制性内切酶、DNA Marker、T4-DNA连接酶购自TaKaRa公司；预染蛋白Marker、ProBond Purification System蛋白纯化试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PCR胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、脂质体Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG(H+L)购自Invitrogen公司；细胞核染液DAPI (4ʹ, 6-diamidino-2-phenylindole)购自Roche公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Merck公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(H+L)购自Jackson ImmunoResearch公司；ECL化学发光检测试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。

金鱼脑细胞系(goldfish brain cell, GFB)由连云港海关段宏安研究员惠赠^[23]。细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的M199培养基于25 ℃培养。CyHV-2由本实验室分离和保存。大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS感受态细胞购自TaKaRa公司；原核表达载体pRSET-A和真核表达载体pVAX1购自Invitrogen公司。

利用病毒DNA提取试剂盒抽提CyHV-2感染鲫核酸。根据GenBank中CyHV-2 ORF66基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为50 μL，包括ddH₂O 31.5 μL、5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ plus) 10 μL、上下游引物 (10 μmol/L)各1 μL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL、cDNA模板2 μL。PCR反应条件为98 ℃预变性30 s; 98 ℃变性10 s、58 ℃退火5 s、72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min; 4 ℃保温。

将回收的PCR产物和原核表达质粒pRSET-A分别用Bam HI和Hind III进行双酶切，酶切片段回收后在T4-DNA连接酶作用下于16 ℃连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向序列测定，测序正确的质粒命名为pRSET-ORF66。此外，将ORF66基因PCR扩增后构建至真核表达质粒pVAX1上，菌液PCR筛选阳性克隆，双向测序验证正确后将其命名为pVAX-ORF66。

表1

表1 　本研究所用引物 Tab. 1 　Details of the primers used in this study 引物名称primer 序列(5′—3′) sequence (5′—3′) 酶切位点restriction site pRSET-ORF66F ATTGGATCCATGACCTCCCTCCAGCAAGCTA Bam HI pRSET-ORF66R CCGAAGCTTAATAAATCATGAGATCGTCTAGGTCGTG Hind III pVAX-ORF66F ATTAAGCTTGCCACCATGACCTCCCTCCAGCAAGCTA Hind III pVAX-ORF66R CCGGGATCCTTAATAAATCATGAGATCGTCTAGGTCGTG Bam HI 注：下划线表示限制性内切酶酶切位点。 Note: Underline indicates restriction site.

表1 　本研究所用引物 Tab. 1 　Details of the primers used in this study

将重组质粒pRSET-ORF66转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞，挑取单克隆进行PCR鉴定、保存。将空载体对照菌和ORF66重组表达菌pRSET-ORF66-BL21(DE3)pLysS分别用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达，5000 g离心10 min，收集诱导前(0 h)和诱导后1、3、5 h的菌体。用适量体积PBS重悬，冻融破碎3次后，5000 g离心10 min，分别收集上清和沉淀，并进行SDS- PAGE电泳分析。

收集诱导表达5 h的菌体，超声破碎后采用蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白的纯化，纯化产物置于透析袋(截留分子量14 kD)中4 ℃透析过夜。利用BCA试剂盒测定纯化蛋白浓度，并取30 µg纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测。

采用本实验室建立的抗体制备方法^[24]，其步骤简要如下：将纯化ORF66蛋白皮下多点免疫新西兰白兔，免疫剂量为500 μg/只，加等量完全弗氏佐剂乳化。首次免疫后每隔两周加强免疫1次，共4次，均加等量不完全弗氏佐剂。免疫后颈动脉采血，离心获得抗血清，抗血清经Protein A柱纯化得到多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定制备抗体的效价，将1 µg/mL纯化ORF66重组蛋白作为抗原包被96孔酶标板，将制备抗体倍比稀释至1∶80000作为一抗，每个稀释度设置3个复孔，以HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体作为二抗，显色后用酶标仪测定OD₄₅₀处吸光值(A)。当P/N> 2.1时为阳性，P为A_实验孔–A_空白孔, N为A_阴性孔–A_空白孔。

SDS-PAGE电泳结束后，利用Bio-Rad蛋白转印系统将蛋白转印至PVDF膜，以制备的多克隆抗体作为一抗(1∶1000稀释), HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)作为二抗(1∶10000稀释)，检测ORF66蛋白的表达，采用ECL化学发光检测试剂显色，拍照保存。

将10⁷ TCID₅₀/mL的CyHV-2感染GFB细胞。此外，将pVAX-ORF66质粒转染GFB细胞，同时转染空载体pVAX1作为阴性对照，转染步骤按照Lipofectamine 2000说明书操作。感染后72 h及转染后36 h，细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min, PBS洗3次后加入0.2% Triton X-100通透15 min, PBS洗3次，4%牛血清白蛋白(BSA) 37 ℃封闭2 h，加入ORF66多克隆抗体(1∶500稀释), 37 ℃孵育2 h, PBS洗3次，加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG(H+L)(1∶1000稀释), 37 ℃孵育1 h, DAPI室温染核10 min，荧光显微镜下观察并拍照。

实验鲫[体重(30±5) g、体长(11±1) cm]购自上海浦东申孙水产养殖有限公司，经镜检寄生虫观察、肝脾肾组织细菌分离、PCR检测CyHV-2、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)全部阴性。养殖水槽为室内循环水养殖系统，水温19~22 ℃，实验前暂养两周使其适应环境，每天早晚定时投喂2次。在实验组鲫背鳍基部注射20 μg/尾pVAX-ORF66 (溶于100 μL PBS, 20条)，同时分别设置注射空载体pVAX1 (20条)和PBS的对照组(40条)。免疫28 d后，取20条PBS注射鲫作为空白组并腹腔注射0.2 mL GFB细胞培养上清。剩余各组鲫进行CyHV-2攻毒，腹腔注射0.2 mL 10⁷ TCID₅₀/mL的病毒液。连续观察42 d，每天记录各组鱼的死亡情况。死亡鱼取鳃、肝、脾和肾组织进行PCR检测，确认为CyHV-2感染，并计算相对免疫保护率(relative percentage survival, RPS), RPS=[1–(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。

PCR结果显示，扩增得到大小约1200 bp的特异性条带(图1)。PCR产物经胶回收、双酶切及纯化后克隆至pRSET-A载体中。重组质粒经Bam HI和Hind III双酶切鉴定和测序验证，表明重组质粒含有目标基因片段(图2)。

分析显示，CyHV-2 ORF66基因ORF区全长1200 bp，编码399个氨基酸，蛋白预测分子量为45.37 kDa。BLAST分析显示，CyHV-2 ORF66蛋白与同属CyHV-1 和CyHV-3 ORF66蛋白具有一定程度的保守性，氨基酸序列同源性分别为47.7%和62.5% (图3)。

重组质粒pRSET-ORF66转化、诱导表达后SDS-PAGE分析显示，在约45 kD处出现清晰的蛋白条带，与ORF66蛋白预期大小相符(图4a)。重组蛋白纯化后进一步免疫新西兰白兔，制备针对ORF66蛋白抗体，其浓度为16.19 mg/mL。用ELISA法对制备的多克隆抗体进行效价测定，结果表明，其效价大于1∶20000。利用制备的多克隆抗体对ORF66重组蛋白进行Western blot检测，结果显示，在PVDF膜上产生了分子量约45 kD的反应条带，表明制备抗体可以特异性识别ORF66重组蛋白(图4b)。

图1

图1 　CyHV-2 ORF66基因的PCR扩增M: DL2000 DNA Marker; 1: ORF66基因. Fig. 1 　PCR amplification of the ORF66 geneM: DL2000 DNA Marker; 1: the ORF66 gene.

图2

图2 　重组质粒pRSET-ORF66的双酶切鉴定M: DL2000 DNA Marker; 1：重组质粒Bam HI和Hind III双酶切产物. Fig. 2 　Double-enzyme digestion identification of the recombinant plasmid pRSET-ORF66M: DL2000 DNA marker; 1: double-enzyme digestion of the recombinant plasmid by Bam HI and Hind III.

为进一步验证制备抗体的特异性，利用Western blot检测了正常和CyHV-2感染鲫鳃、肝、脾、肾组织匀浆。结果证实，制备的ORF66抗体能与感染鱼组织发生特异性反应，并在PVDF膜上产生相应分子量大小的条带(图5)。

将ORF66基因扩增后(引物见表1)克隆至真核表达载体pVAX1中，构建重组质粒pVAX- ORF66。质粒经PCR (图6a)及Hind III和Bam HI双酶切验证(图6b)，证实含有目标大小的基因片段，测序结果也进一步证实了重组质粒阅读框正确无误。

为研究pVAX-ORF66在真核细胞中的表达情况，首先对CyHV-2感染的GFB细胞进行IFA检测。感染后72 h，利用ORF66蛋白抗体检测发现，CyHV-2感染细胞出现明显的绿色荧光(图7)，而未感染细胞则无明显荧光信号。此外，感染细胞中ORF66蛋白主要分布于细胞质中。本实验也进一步证实，制备的抗体可以特异性识别CyHV-2 ORF66蛋白。

将pVAX-ORF66和空载体pVAX1转染GFB细胞，利用制备的ORF66抗体作为一抗对转染细胞进行Western blot检测。结果表明，ORF66能在转染细胞中大量表达(图8)。进一步，IFA实验表明，ORF66在pVAX-ORF66转染细胞中得到高水平表达，而对照组无表达。此外，与感染细胞中一致，真核重组ORF66蛋白也主要分布于胞质中(图9)。以上结果表明，外源基因ORF66可以在鱼类细胞中正确表达。

图3

图3 　CyHV-2 ORF66与CyHV-1、CyHV-3 ORF66氨基酸序列比对采用ClustaW软件，对CyHV-2 ORF66氨基酸序列进行比对分析，深色为保守氨基酸位点. Fig. 3 　Alignment of the amino acid sequence of CyHV-2 ORF66 with that of CyHV-1 and CyHV-3Multiple alignment of the amino acid sequence of CyHV-2 ORF66 with that of CyHV-1 and CyHV-3 by ClustaW software. Conserved amino acid residues are represented in dark.

图4

图4 　ORF66蛋白原核表达和多克隆抗体的制备a. 重组ORF66蛋白的原核表达；M：蛋白Marker; 1：pRSET-A空载体转化BL21(DE3)pLysS菌株IPTG诱导3 h上清；2–4：pRSET-ORF66转化BL21(DE3)pLysS菌株诱导1、3、5 h上清；5–8：pRSET-ORF66转化BL21(DE3)pLysS菌株诱导0、1、3、5 h沉淀；b. 重组ORF66蛋白的Western blot鉴定. Fig. 4 　Prokaryotic expression and preparation of polyclonal antibody against CyHV-2 ORF66 proteina. SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expressed ORF66 protein, M: protein marker; 1: supernatant of pRSET-A transformed BL21(DE3)pLysS collected at 3 h post IPTG induction; 2–4: supernatant of pRSET-ORF66 transformed BL21(DE3)pLysS collected at 1, 3, h post induction; 5–8: precipitate of pRSET-ORF66 transformed BL21(DE3)pLysS collected at 0, 1, 3, and 5 h post induction; b. Western blot identification of the recombinant ORF66 protein.

实验鲫背鳍注射pVAX-ORF66 DNA疫苗28 d后进行CyHV-2感染实验。攻毒后42 d内，空白组鲫无死亡，各感染组鱼均出现了不同程度的临床症状，包括行动迟缓、鳃出血、腹部膨大，肛门红肿、体表和鳍条基部出血、鳔上有出血点等。实验组死亡鲫与对照组感染鲫临床症状一致，并且内脏组织PCR检测均为CyHV-2阳性。实验组鲫死亡率(8/20)显著低于注射空质粒的对照组(18/20)和注射PBS的空白组(19/20)，相对免疫保护率达55.6% (图10和表2)。本实验表明制备的DNA疫苗具有良好的免疫保护效果，可以作为潜在抗CyHV-2疫苗。

图5

图5 　利用ORF66抗体对CyHV-2感染组织的Western blot鉴定M：蛋白质Marker; 1：正常鲫组织；2：CyHV-2感染组织. Fig. 5 　Western blot identification of CyHV-2 infected Carassiu sauratus tissue with prepared ORF66 antibodyM: protein marker; 1: normal tissue; 2: CyHV-2 infected tissue.

图6

图6 　真核表达质粒pVAX-ORF66的PCR和双酶切鉴定a. PCR鉴定；M: DL2000 DNA Marker; 1: ORF66基因；b. 双酶切鉴定；M: DL5000 DNA Marker; 1: Hind III和Bam HI双酶切产物. Fig. 6 　Identification of the eukaryotic expression plasmid pVAX-ORF66 by PCR and double-enzyme digestiona. PCR identification; M: DL2000 DNA Marker; 1: the ORF66 gene; b. Double-enzyme digestion identification; M: DL5000 DNA Marker; 1: double-enzyme digestion of the recombinant plasmid by Hind III and Bam HI.

图7

图7 　CyHV-2感染GFB细胞中ORF66蛋白的间接免疫荧光检测CyHV-2感染GFB细胞72 h后，细胞经4%多聚甲醛固定和0.2% Triton X-100通透处理后，利用ORF66蛋白抗体作为一抗，Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG(H+L)作为二抗(绿色), DAPI染核后(蓝色)置于倒置荧光显微镜下观察. Fig. 7 　IFA detection of CyHV-2 infected GFB cells with prepared antibody against ORF66At 72 h post CyHV-2 infection, GFB cells were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.2% Triton X-100. Cells were then immunostained using the antibody against ORF66 followed by Alexa Fluor 488 labeled goat anti-rabbit IgG (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Cells were observed under an inverted fluorescence microscope.

图8

图8 　pVAX-ORF66转染GFB细胞中ORF66蛋白的Western blot检测M：蛋白质Marker; 1：空载体pVAX1转染36 h后细胞裂解液；2：重组质粒pVAX-ORF66转染36 h后细胞裂解液. Fig. 8 　Western blot detection of the ORF66 protein in pVAX-ORF66 transfected GFB cellsM: protein Marker; 1: lysate of pVAX1 transfected cells collected at 36 hpt; 2: lysate of pVAX-ORF66 transfected cells collected at 36 hpt.

图9

图9 　pVAX-ORF66转染GFB细胞中ORF66蛋白的间接免疫荧光检测pVAX-ORF66转染GFB细胞36 h后，细胞经4%多聚甲醛固定和0.2% Triton X-100通透处理后，利用ORF66蛋白抗体作为一抗，Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG(H+L)作为二抗(绿色), DAPI染核后(蓝色)置于倒置荧光显微镜下观察. Fig. 9 　IFA detection of the ORF66 protein in pVAX-ORF66 transfected GFB cellsAt 36 h post pVAX-ORF66 transfection, GFB cells were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.2% Triton X-100. Cells were then immunostained using the antibody against ORF66 followed by Alexa Fluor 488-labeled goat anti-rabbit IgG (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Cells were observed under an inverted fluorescence microscope.

图10

图10 　CyHV-2攻毒后免疫鲫的存活率实验鲫背鳍肌肉注射20 µg pVAX-ORF66质粒(溶于100 µL PBS)、20 µg pVAX1质粒(溶于100 µL PBS)或100 µL PBS (每组20条). 免疫28 d后，腹腔注射0.2 mL 107 TCID50/mL的CyHV-2细胞培养上清，连续观察42 d，每天记录各组鱼的死亡情况并绘制存活率曲线. Fig. 10 　Survival curve of immunized Carassius auratus post challenge with CyHV-2Carassiu sauratus were intra-muscular injected with 20 µg pVAX-ORF66, pVAX1 plasmid (dissolved in 100 µL PBS) or 100 µL PBS (n=20 for each group). At 28 days post injection, fish were challenged by intra-peritoneal injection of 0.2 mL CyHV-2 cell culture supernatant (107 TCID50/mL). Mortality was monitored daily for 42 days, and the result was expressed as Kaplan-Meier survival curve.

表2

表2 　CyHV-2攻毒后免疫鲫的免疫保护率 Tab. 2 　Relative protection rate of immunized Carassius auratus post challenge with CyHV-2 组别group 鱼总 数/尾fish number 死亡 数/尾death number 死亡 率/% death rate 存活 率/% survival rate 免疫 保护率/% RPS P pVAX-ORF66 20 8 40 60 55.6 <0.05 pVAX对照组 PVAX control group 20 18 90 10 / PBS对照组PBS control group 20 19 95 5 /

表2 　CyHV-2攻毒后免疫鲫的免疫保护率 Tab. 2 　Relative protection rate of immunized Carassius auratus post challenge with CyHV-2

鲫为我国主要大宗淡水养殖品种之一，随着大规模、集约化水产养殖业的不断发展，其病害问题日益突出。其中，CyHV-2引起的鲫造血器官坏死病因其高致病性、高死亡率严重制约了鲫养殖业的发展^[8]。免疫接种是预防水生动物疾病发生、保障水产养殖业健康发展的有效途径。因此，研制安全有效的CyHV-2保护性疫苗对于该病的防控具有重要意义^[25]。前期，廖红等^[26]和周勇 等^[27]分别制备了CyHV-2 ORF5和ORF25截短蛋白的亚单位疫苗，免疫保护率分别为35%和47%。王维玲^[28]和潘晓艺等^[29]制备了CyHV-2灭活疫苗，免疫保护率分别为73.1%和100%。灭活疫苗和亚单位疫苗存在接种剂量大、免疫持续时间较短、需多次接种并且需要加入佐剂增强免疫等，限制了其在鱼用疫苗中的应用。鱼用DNA疫苗常用的质粒载体有pcDNA3.1(+)、pEGFP-N1及杆状病毒表达载体pFastBacDual等^[16,30-31]。pVAX1载体是FDA推荐的唯一可以应用于人体实验的真核载体质粒，且其仅保留真核表达所需的最基本DNA序列，基因安全性高并且操作简便。本研究首次将CyHV-2衣壳蛋白ORF66编码基因克隆至pVAX1上，构建了重组表达载体pVAX-ORF66。转染GFB细胞后，利用制备的抗体进行IFA和Western blot检测，均证实ORF66蛋白可以在GFB细胞中大量表达。攻毒实验进一步表明，pVAX-ORF66免疫鲫可以获得较高的免疫保护率(55.6%)。此外，感染后21 d (注射后49 d)，实验鲫肌肉组织中仍可以PCR检出载体序列，而实验水体和鱼体排泄物中均未检出(数据未展示)，提示该疫苗可以提供较长时间的免疫保护且对环境相对安全。因此，本研究开发的CyHV-2 DNA疫苗具有制备工艺简单、成本低廉、质量可控、安全有效等优势，具备良好的大规模免疫预防推广应用价值。

病毒的早期诊断是切断其传播的有效途径，近年来，针对CyHV-2已开发出多种分子生物学检测方法，包括普通PCR、双重PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR和环介导等温扩增(LAMP) 等^[32-34]。然而，传统免疫学检测方法操作简便、特异性强、可同时处理大量样本，且不依赖于昂贵仪器设备，在鱼类病原诊断实践中具备重要价值。孔善云等^[35]和Kong等^[36]利用ORF72蛋白抗体，建立了针对CyHV-2的免疫学诊断方法。徐晔等^[37]、周勇等^[38]、Wu等^[39]利用ORF90、ORF4、ORF25重组蛋白抗体，建立了ELISA和IFA检测方法。本研究中，笔者对ORF66蛋白进行了原核表达并制备了其特异性抗体，抗体效价达1∶20000以上，Western blot和IFA等实验均提示其可用于CyHV-2的免疫学检测。因此，本研究制备的ORF66抗体有助于CyHV-2检测技术的多样化发展，为该病的早期诊断提供了有力的技术支撑。

研究表明，鲫感染CyHV-2后3 d，即可在鳍中检测到ORF66蛋白。感染后5 d，在鳃、鳍、脾和肾组织中也可检出，其中肾组织中表达水平最高^[22]。CyHV-2主要易感器官为鳃、鳍、脾和肾^[8,22]，提示ORF66蛋白组织表达模式与其易感器官高度一致。因此，ORF66在CyHV-2复制循环过程中起到重要作用。然而，ORF66作用分子机制研究目前仍处于起步阶段，仅张小米等^[21]采用噬菌体表面展示技术发现多肽Nʹ-LHLHQNRMSLSR-Cʹ与ORF66截短体(232~335 aa区域)有较强的亲和力，氨基酸序列比对显示该多肽可能来源于BLT1、GTF3C2或SKT。本研究中，笔者发现ORF66蛋白主要定位于细胞质中。进一步分析发现，前述3个蛋白仅SKT位于细胞质中，故推测其为ORF66的互作蛋白。因此，本研究制备的ORF66特异性抗体也为ORF66蛋白功能的解析提供了前期基础。

总之，本研究开发了一种制备简单、成本低廉的CyHV-2 DNA疫苗，为鲫造血器官坏死病的防控提供了一种潜在的预防措施。