2023, Vol. 30 
由于栖息地破坏和过度捕捞利用，中国鲎(Tachypleus tridentatus)已成为濒危海洋动物，其自然资源已濒临枯竭，人工繁育和增殖放流是增加其野外资源的重要途经[1]。我国20世纪80年代曾通过杀鲎取卵方式开展中国鲎的人工繁育工作试验[2-3]，但苗种培育相关报道较少。近年来开始采用模拟野外条件促亲鲎自然产卵方法进行人工繁殖[4-5]，以降低对珍稀亲鲎的伤害，但孵化率和成活率尚不稳定。
在室内有限人工空间条件下，高密度养殖导致鲎卵和幼鲎生活空间极剧缩小，因此容易受到各种细菌、真菌、病毒或寄生虫等病原侵染，再加上漫长的发育周期，更是给予这些病原体可乘之机[6-8]。感染后的受精卵和幼鲎常常发育迟滞，严重则腐烂死亡，尤其在鲎卵发育期间较为常见，是影响受精卵孵化率的主要原因[9]。因此，探究幼鲎发育过程中常见病原及其防治方法具有重要意义。
溴氯海因(1-Bromo-3-chloro-5,5-dimethylhydantoin, BCDMH)作为一种有机活性溴、氯杀菌剂，其杀菌谱广，对多种细菌、芽胞、病毒、真菌等有杀灭作用[10]。其溶解在水中形成游离的Br–和Cl–，形成次溴酸(HBrO)和次氯酸(HC1O)起主要杀菌消毒作用，且对组织刺激性小，适用于皮肤、黏膜消毒[11]。溴氯海因作为已批准的水产养殖业安全兽药，已广泛应用于水产养殖水体、环境或生物体的消毒，治疗和预防细菌性和病毒性疾 病[12-13]，但尚未应用于中国鲎卵和幼体的消毒，其安全浓度和有效浓度未知。
本研究通过模拟野外产卵场条件、强化亲鲎营养促使其自然产卵和受精的方式进行人工繁育，获得受精卵进行人工孵化和鲎苗培育。并对感染病原的受精卵表面病原采用16S rDNA和ITS测序技术进行测序、鉴定和微生物群落组成分析；同时开展不同浓度溴氯海因溶液对中国鲎1龄幼体的急性毒性研究，并根据安全浓度确定适用于鲎卵和幼体的有效消毒浓度，探究其是否能提高幼体成活率，是否适合应用于中国鲎人工养殖过程环境消毒。
1 材料和方法 1.1 中国鲎人工繁育中国鲎为厦门当地执法部门收缴所得，暂养在集美大学水产试验场。亲鲎开始养殖前用淡水或含20 mg/L次氯酸的淡水浸泡3~10 min，然后用海水冲洗头胸甲表面和腹面，杀死并洗脱寄生动物。每只鲎测量形态参数后按雌雄配对放入养殖桶，每个养殖桶放置1对亲鲎。养殖桶规格为上底1.65 m，下底1.53 m，高0.82 m，容量1000 L，底下铺设10 cm底沙，用加热棒将水温控制在28 ℃，养殖用水为经砂滤后的天然海水，pH 8.00±0.43，盐度29.00±0.33，有过滤桶净化养殖桶内水体，再回流到养殖桶中，形成循环水养殖。每日傍晚投喂亲鲎总重3%~5%的新鲜菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)或近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)肉，并间隔1 d加双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)进行营养强化。待亲鲎摄食0.5~1 h后换水并清除残饵和粪便。强化约1~2月后亲鲎开始产卵，收集受精卵转移到孵化篮中进行孵化，孵化水温(30.00±0.5) ℃。每天观察和记录鲎卵孵化情况、病菌感染情况等，将被病菌感染的鲎卵及时挑出并单独培育，用于后续病原鉴定和微生物群落结构分析。鲎卵蜕壳孵出1龄幼体也及时捞出单独培育，部分用于后续溴氯海因毒理和消毒实验。
1.2 感染病原的鲎卵表面微生物鉴定和群落结构分析取不同感染形态的鲎卵50个，混合浸泡于无菌海水中，轻轻震荡摇晃，吸取含洗脱物的无菌海水10 mL，均分置于2管5 mL的冻存管中，–80 ℃冰箱保存。样品由奥维森基因科技有限公司进行DNA提取、PCR扩增和测序。细菌鉴定和群落结构组成分析数据来自16S rDNA基因序列的V3-V4区高通量测序结果，真菌鉴定和群落组成分析数据来自ITS测序结果。测序平台为MiSeq PE300。
Miseq测序得到pair-end (PE)双端序列数据，对测得Fastq数据进行质控处理，最终得到优质的Fasta数据，然后进行有效数据统计，将下机数据(Raw PE)在去除barcode和primer并拼接后得到raw tags，经进一步去除嵌合体、短序列后得到优质序列(clean tags)，采用QIIME1(V1.8.0)平台和vsearch软件将clean tags用聚类方式生成OTUs[14]。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，在Silva和Unite等常用的细菌和真菌数据库采用blast或RDP Classifier、uclust consensus taxonomy assigner等方法对OTU代表序列进行比对分析，注释其群落的物种信息。
1.3 幼鲎(1龄)溴氯海因急性毒性实验挑选外观良好、无明显畸变、未被病菌感染的1龄幼鲎约500只，头胸甲宽为(5.69±0.28) mm，湿重为(0.0243±0.0045) g。纯度30%的溴氯海因粉(水产用)，使用前用蒸馏水稀释，配制成各种实验浓度组，现配现用。实验养殖容器为上底直径19.7 cm，下底直径14 cm，高15.5 cm的塑料桶，容量3 L。实验海水为砂滤所得，pH8.00±0.43，盐度29.00±0.33。实验温度为(26.0±0.5) ℃，实验前气石持续充氧，溶氧量≥5.0 mg/L。
急性毒性实验前预实验设置7个溴氯海因浓度梯度200、500、800、1100、1400、1700和2000 mg/L和空白对照组，每个浓度10只1龄幼鲎，观察12、24、36、48、60、72、84和96 h最大耐受浓度和完全死亡浓度。
根据预实验结果，设计静态急性毒性实验。以最大耐受浓度1400 mg/L为上限浓度，其对数值Xk为3.15，下限浓度为200 mg/L，其对数值Xi为2.30, N=6，根据实验组间距公式d=(Xk–Xi)/ (N–1)[15]得出d=0.17。根据等对数间距设置199.53、295.12、436.52、645.65、954.99和1412.54 mg/L共6个梯度(表1)及空白对照组；作用时长为12、24、36、48、60、72、84和96 h。每组10只1龄幼体，3个重复组。每隔12 h观察幼体存活状况，计录死亡个体、幼体活力状况等相关数据。肉眼下不动的幼体可移至显微镜下观察鳃部和附肢是否活动来判断是否死亡。整个实验过程中不换水、不打气、不投饵，死亡个体及时捞出，以避免水质恶化。
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表1 各组溴氯海因的对数浓度和药物量 Tab. 1 Logarithmic concentration and drug quantity of BCDMH in each group |
急性毒性实验结束后，将剩余存活个体(共52只)立即置于无溴氯海因的干净海水中进行恢复实验，恢复实验时长为12、24、36和48 h。观察并记录此期间1龄幼鲎死亡率。
1.5 鲎卵和幼体消毒有效浓度在安全浓度范围内设置10、30、60和90 mg/L 4个梯度和空白对照组，进行溴氯海因对鲎卵孵化和1龄幼鲎培育影响实验。为防止药效减弱，每 3 d更换一次海水并加入重新配置相应浓度溴氯海因溶液。幼鲎组每组20只，3个重复。鲎卵组每组20枚外膜无破损、状况良好的受精卵，直径(3.12±0.25) mm，湿重(0.0051±0.0011) g, 3个重复。实验进行60 d，每天记录鲎卵孵化、1龄幼鲎发育情况、感染个体数和死亡个体数等。
1.6 统计分析采用SPSS 25.0对各实验组数据进行单因素方差分析，验证数据正态性，方差齐性用LSD进行组间多重比较；非齐性则用非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验进行分析。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。在方差齐性下用Probit法求出对应时间的95%置信区间，再通过寇式法计算出对应的溴氯海因半致死浓度(LC50, mg/L)。然后根据得到的LC50利用公式[16] SC=LC(50–96 h)×0.1计算得到安全浓度(SC, mg/L)。用Origin 2021对所得数据进行作图。
2 结果与分析 2.1 中国鲎人工繁育结果4对亲鲎在营养强化1~2个月后开始产卵，鲎卵埋在底沙中。收集时把亲鲎先转移，然后搅动水体，把鲎卵从沙层中分离开并收集。于2022年7月3日获得第一批约500粒鲎卵，随后每天可收集到100~1000粒鲎卵，持续25 d，共收集到16493粒鲎卵(表2)。随后将这些鲎卵放置到孵化篮中进行孵化。孵化篮为长32.5 cm，宽24 cm，高9 cm的长方形网篮，每只网篮放500粒鲎卵，充分打气，每天换一次水，挑出被病菌感染的鲎卵单独继续培养并计数，孵化天数40~60 d，得到共计约5704只1龄幼体。
本次人工繁育鲎卵的平均受精率为66.25%，平均孵化率为52.25%，平均孵化天数50 d，平均感染病菌率为47.75%，每组亲鲎平均产卵4123.25粒(表2)。
2.2 感染病原的鲎卵和1龄幼鲎形态特征孵化过程中发现感染病原的受精卵和幼体呈红色、黑色或白色3种体色(图1)。红色卵(图1a)一般在孵化前期最早出现，约占所有病菌感染鲎卵的30% (图2)，特征为初始时为红色斑点，然后逐渐扩大至整个鲎卵或者幼体。感染后的鲎卵会逐渐变软，卵膜破裂损伤，卵黄流出，或逐渐发黑腐烂死亡；黑色卵(图1b)一般在孵化中期开始出现，后期数量较多，约占所有病菌感染鲎卵的40% (图2)，特征为表面有菌丝，会附着在其他鲎卵上，菌丝将多个鲎卵连接在一起，最后均发黑腐烂死亡；白色卵(图1c)在孵化前、中和后期均有出现，传染速度最快，约占所有病菌感染鲎卵的30% (图2)，特征为表面形成一层白色黏性膜，这种膜也会把其他卵粘连或覆盖，且有明显异味，最后导致鲎卵腐烂死亡。被这些细菌、真菌感染后的鲎卵无一例外最后都会死亡。幼鲎也同样会受这些细菌、真菌的感染。养殖过程中最为常见的就是红色或粉红色的幼鲎(图1d)，不过比起受精卵时期，幼鲎的抵抗力和免疫能力明显增强，且大部分1龄幼体蜕壳后进入2龄都能有效防御病菌侵染，少部分被病菌侵染后死亡。
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表2 4对亲鲎头胸甲宽、湿重、产卵量、孵化率等参数 Tab. 2 Measurement parameters of prosomal width, wet weigth, total spawning and hatchability from 4 pairs of Tachypleus tridentatus |
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图1 被细菌、真菌等病原体感染的鲎卵(a, b, c)和1龄幼鲎(d) Fig. 1 Tachypleus tridentatus eggs (a, b, c) and 1st instar larvae (d) infected by pathogens such as bacteria and fungi |
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图2 被病原感染的各色鲎卵随着孵化天数出现的比例 Fig. 2 Proportion of Tachypleus tridentatus eggs in different colour infected by pathogens at different incubation days |
对感染鲎卵表面的细菌进行分类，在属的水平上可细分为17种，优势菌(相对丰度>5%)为希瓦氏菌属(Shewanella)、海王星杆菌属(Neptuniibacter)、脱硫杆菌属(Desulfobacter)、寺崎菌属(Terasakiella)和哈拉科杆菌属(Halarcobacter)，相对丰度分别为23.67%、7.21%、6.64%、5.41%和5.16%。还有一些菌群丰度较低，但也被检测出，其中包括鲁杰氏菌属(Ruegeria)、乳酸杆菌属(Malaciobacter)、海洋螺旋藻属(Oceanospirillum)、Psychroserpens、海杆菌属(Marinobacter)、梭杆菌属(Fusibacter)、噬甲基菌属(Methylophaga)、假嗜杆菌属(Pseudophaeobacter)、拉布伦齐亚属(Labrenzia)、尼奥埃拉属(Nioella)、含水杆菌属(Aquibacter)和维辛格斯属(Vicingus)，相对丰度分别为4.69%、3.66%、3.19%、2.47%、2.46%、2.04%、1.55%、1.47%、1.41%、1.19%、1.06%和1.04%。感染鲎卵表面的真菌共检测到4种，在属水平上占据绝对优势的是肉座菌科(Hypocreaceae)的一属，在NCBI基因库中未能与已知的属匹配，但从上一级可以认定是肉座菌科，相对丰度达到81.81%；其次是曲霉菌属(Aspergillus)，相对丰度为10.48%；其他为枝孢菌属(Cladosporium)和镰刀菌属(Fusarium)，分别为2.71%和1.24%。
2.4 溴氯海因对1龄幼鲎急性毒性实验结果对表1数据用SPSS进行Probit分析，得到了如表3所示的回归方程和LC50, LC50(96h)的值为945.06 mg/L, SC为94.51 mg/L。说明水体中溴氯海因浓度在94.51 mg/L内对中国鲎1龄幼体是安全的。
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表3 溴氯海因对中国鲎1龄幼体的半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC) Tab. 3 LC50 and SC of BCDMH in the 1st instar Tachypleus tridentatus larvae |
溴氯海因不同浓度、不同作用时间组的组间多重比较和方差分析结果见图3。当溴氯海因浓度在295.12 mg/L及以下时，实验时长96 h之内1龄幼鲎的存活率均无显著差异(P>0.05)，即存活率无明显变化，均能存活。当溴氯海因浓度在436.52 mg/L时，实验时长96 h之后各时间点1龄幼鲎存活率与60 h之前的所有时长组存在显著差异(P<0.05)，且该浓度下作用时间达到84 h之后会开始出现1龄幼鲎的显著性死亡。当溴氯海因浓度达到645.65 mg/L时，实验时长72 h之后各时间点1龄幼鲎存活率显著低于(P<0.05) 72 h之前的所有时长组，特别是96 h组与其他组间出现显著差异(P<0.05)，但72~96 h之间差异不显著(P>0.05)。当溴氯海因浓度达到954.99 mg/L时，实验时长36 h之后的1龄幼鲎存活率为83%，与前面实验时长组存在显著差异(P<0.05)。随着作用时间增加，存活率进一步降低，60 h时存活率为70%，之后直到96 h实验结束存活率无显著差异(P>0.05)。当溴氯海因浓度达到1412.54 mg/L时，在各时间点实验组与对照组间均存在显著的差异(P<0.05), 12 h后存活率仅为57%, 24 h后存活率仅为3%，最终全部死亡，说明当溴氯海因浓度达到1412.54 mg/L及以上时，幼鲎快速大量死亡，严重威胁其生命。
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图3 不同溴氯海因浓度对中国鲎1龄幼体存活率的影响同一时间下凡含有一个相同小写字母表示不同浓度组间差异不显著(P>0.05). 同一浓度下凡含有一个相同大写字母表示不同时间组间差异不显著(P>0.05). Fig. 3 Effects of different BCDMH concentrations on survival of 1st instar Tachypleus tridentatus larvaeThe inclusion of the same lowercase letter at the same time indicates that the difference between different concentration groups is not significant (P>0.05). The same concentration contains the same uppercase letter indicates that the difference between different time groups is not significant (P>0.05). |
1龄幼鲎在溴氯海因急性毒性实验结束后，剩余个体立即放入无溴氯海因的干净海水中进行恢复实验。结果表明，在恢复过程中幼鲎的死亡率会随着急性毒性实验阶段溴氯海因浓度和恢复时间而发生显著性变化(图4)。436.52 mg/L及低于该浓度的实验组，恢复期间(48 h)各时间点幼鲎存活率无明显差异(P>0.05)，且死亡率都较低，说明使用436.52 mg/L及以下浓度的溴氯海因溶液消毒1龄幼鲎是安全的。
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图4 溴氯海因作用后中国鲎1龄幼体恢复实验同一时间下凡含有一个相同小写字母表示不同浓度组间差异不显著(P>0.05). 同一浓度下凡含有一个相同大写字母表示不同时间组间差异不显著(P>0.05). Fig. 4 Recovery experiment of 1st instar Tachypleus tridentatus larvae after BCDMH treatmentThe same lowercase letter indicates that the difference between different concentration groups is not significant at the same time (P>0.05). The same uppercase letter indicates that the difference between different time groups at the same concentration is not significant (P>0.05). |
溴氯海因初始浓度为645.65 mg/L和954.99 mg/L的实验组随着恢复时间的增加，幼鲎的存活率逐渐降低。645.65 mg/L实验组，恢复36 h后幼鲎的存活率显著地降低(P<0.05), 48 h后进一步显著降低(P<0.05); 954.99 mg/L实验组，恢复36 h后幼鲎的存活率(33%)显著地降低(P<0.05), 48 h后存活率不变(33%)。
2.6 安全浓度范围内不同溴氯海因浓度对鲎卵孵化和1龄幼鲎培育效果在安全浓度范围内设置10、30、60和90 mg/L这4个梯度和对照组，进行溴氯海因对鲎卵孵化和1龄幼鲎培育效果实验。鲎卵孵化结果如图5所示，得到的感染率与死亡率数据一致，说明感染病菌的鲎卵最终死亡，不能孵化。30 mg/L及以上浓度组间鲎卵孵化率、感染率和死亡率无显著差异(P>0.05)，说明30、60和90 mg/L溴氯海因浓度之间对鲎卵的孵化效果相近，在感染率和死亡率的控制也相近，差异不大。30 mg/L及以上浓度组的孵化率显著高于0~10 mg/L浓度组(P<0.05)，说明在30~90 mg/L溴氯海因浓度孵化效果比0~10 mg/L浓度更好，而30 mg/L及以上浓度组的感染率和死亡率均显著低于0~10 mg/L浓度组(P<0.05)，可见30~90 mg/L溴氯海因浓度对鲎卵孵化效果更好，更能有效防止鲎卵感染病菌死亡，从而提高孵化率。
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图5 不同浓度的溴氯海因对鲎卵孵化效果同一参数下凡有相同小写字母表示两者之间差异不显著(P>0.05). Fig. 5 Effects of different concentrations of BCDMH on horseshoe crab egg hatchingThe same lowercase letter indicates that the difference between different concentration groups at the same time is not significant (P>0.05). |
溴氯海因消毒对1龄幼体培育影响结果表明(图6)，实验组和对照组相比，蜕壳率无显著差异(P>0.05)，说明溴氯海因浓度对1龄幼鲎蜕壳发育几乎无影响。30 mg/L及以上浓度组在1龄和2龄幼体病原感染率和死亡率之间均无显著差异(P>0.05)，说明30、60和90 mg/L溴氯海因浓度对1龄和2龄幼体控制感染率和死亡率的效果相近，都能起到良好的防治效果。10 mg/L浓度组与对照组在1龄幼体和2龄死亡率上有显著差异(P<0.05)，而在感染率上没有显著差异(P>0.05)，说明在低浓度下(10 mg/L)溴氯海因对幼体防治病菌感染效果较差，小部分幼鲎感染病菌后可以存活。30 mg/L及以上浓度组除蜕壳率外其他参数都显著低于对照组(P<0.05)，说明当溴氯海因浓度30~90 mg/L时能够显著降低病菌感染，降低死亡率。
2.7 中国鲎1龄幼鲎中毒行为反应将1龄幼鲎投放到含有溴氯海因溶液(浓度> 199.53 mg/L)的海水中，观察发现部分幼鲎会表现较为兴奋，并进行仰泳，随后活力下降沉底，随着药物浓度(>436.52 mg/L)和实验时长(>36 h)的增加，幼鲎的书鳃能肉眼观察到有灰白色富集(图7)，此时幼鲎活动减少，显微镜下观察到书鳃鼓动频率变弱，书鳃有灰白色富集的幼鲎随时间(>72 h)增长，其附肢会弯曲收缩呈“抱拢”状态，最后死亡。
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图6 不同浓度的溴氯海因对幼鲎培育的消毒效果同一参数下凡有相同小写字母表示两者之间差异不显著(P>0.05). Fig. 6 Disinfection effect of BCDMH in horseshoe crab larvae cultivatingThe inclusion of the same lowercase letter at the same time indicates that the difference between different concentration groups is not significant (P>0.05). |
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图7 病原感染幼鲎(a)和正常个体(b)的书鳃 Fig. 7 The book gills of larvae infected by pathogens (a) and normal individuals (b) |
本次人工育苗收集到鲎卵16493粒，平均受精率66.25%，平均孵化率52.25%，平均感染率47.75%，共计得到5704只1龄幼体。相较于以往的繁育实验(同一批亲鲎，平均产卵量2320粒)，本次收获的鲎卵较多(平均每对亲鲎产卵4123粒)，原因在于合理的营养强化。研究表明，中国鲎偏好摄食双壳类和多毛类[9,17]，平时投喂的饵料种类一般为菲律宾蛤仔和近江牡蛎[18]，当繁殖期开始时增加营养。厦门地区中国鲎的繁殖期一般在4―8月[4]，此阶段选择富含高蛋白的双齿围沙蚕与菲律宾蛤仔、牡蛎肉混合投喂，提供更加丰富的营养，在本研究中也得到了印证。中国鲎有昼伏夜出的习性，在夜晚和凌晨活动比较活跃[19-20]，投喂时间在傍晚或晚上较好，此时亲鲎较为活跃，能够及时摄食新鲜饵料，防止饵料泡水太久鲜味降低甚至腐败变质。投饵时要注意将饵料均匀撒落，保证每只鲎均能摄食到一定量的饵料。投饵量视亲鲎摄食量而定，一般为亲鲎总重的3%~5%[19]，投喂0.5~1 h后未摄食的饵料和粪便要及时捞出清理，因为鲎粪便氨氮含量较高，残饵容易腐烂污染水质，长期留存会危害亲鲎健康。待亲鲎摄食完毕后全部换水，防止水质变差。可见，足够的营养是亲鲎产卵的关键[18]，特别是在繁殖期要注意合理的营养强化。
本次实验得到的鲎卵受精率和孵化率都较低，可能与所用的鲎活力较差有关，也可能与养殖环境有关。梁广耀[3]用2 m×1.75 m×1 m的水泥池和15 cm厚的底沙下自然受精的方式获得的鲎卵平均受精率为80%，认为产卵池的大小和底沙的厚度也会影响受精率，较薄的沙层包裹性差，雌鲎产的卵不能完全埋在沙中，有一部分会分散在沙面上，影响了受精率。这与本次试验养殖环境相似，本次养殖采用的是养殖桶，上底1.65 m，下底1.52 m，高0.82 m，规格较小，沙层厚度仅10 cm，造成了自然受精过程中有很多鲎卵分散在沙层表面，可能无法充分受精。研究表明人工授精得到的鲎卵受精卵更高[2,21]，但需要剖开雌鲎取出卵子，会造成雌鲎的死亡，从保护鲎资源的角度建议采用自然受精，不适宜采用解剖的方法。
本次实验中也出现较高的病菌感染率，可能与亲鲎活力较差和本次实验采用的循环系统水交换不够有关。传统方法采用较厚的底沙容易造成缺氧，不利于亲鲎埋栖和受精卵孵化，双层水体养殖系统能够加强上、下流水交换，既增加了溶解氧也达到了清洗底沙的效果[22]。后续实验将改进养殖桶的构造以取得更好的养殖效果。人工育苗应当注意养殖空间和底沙厚度的问题，改变传统养殖系统，加大上、下层流水交换，并选用一些安全的消毒剂定期对海水和养殖系统进行消毒、清洁，从而达到更好的繁育效果。
3.2 中国鲎常见病原微生物感染病症和防治方法中国鲎属于节肢动物，外被坚硬的几丁质外壳，通常病原不容易侵染。在受精卵和幼体阶段，由于外壳通透性较强，且活动力较弱，容易滋生各种病原，在中国鲎人工繁育过程中，受精卵低孵化率和低幼体成活率常与此有关。本实验在鲎卵孵化和1龄幼体培育过程中均出现了被细菌、真菌等病原感染后的群体，尤其是鲎卵平均感染率达到47.75%，而且被感染的鲎卵死亡率达到100%。这与感染后的鲎卵和1龄幼体形态特征与Faizul等[6]的研究相似，主要有体色变红、变白和变黑3种形态。孵化过程中最先出现的是红色卵，占被病菌感染的鲎卵比例为30%；其次是白色卵，其传播速度最快，占被病菌感染的鲎卵比例为30%；黑色卵最多，一般在孵化中、后期出现，占比为40%。不同颜色的鲎卵比例不等，早期孵化过程中红色和白色的卵占比更高。Faizul等[6]在圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)和巨鲎(T. gigas)室内繁育过程中，发现受精卵和幼体容易感染有害细菌和真菌，通过微生物鉴定认为主要有腐败希瓦氏菌(S. putrefaciens)、粪肠球菌(Enteroccus faecalis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)和曲霉(Aspergillus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青曲霉(Peniclillium sp.)和胶质瘤杆菌(Gliocladium sp.)，其中感染最多的是腐败希瓦氏菌和黑霉菌。本研究对感染病原的鲎卵进行细菌和真菌生物组成分析得出细菌类病原主要有希瓦氏菌属、海王星杆菌属、脱硫杆菌属、寺崎菌属和哈拉科杆菌属，真菌类主要有肉座菌科和曲霉菌属，同Faizul等[6]的研究相似，均存在希瓦氏菌和曲霉。
研究表明，希瓦氏菌属于非发酵菌群，是一种条件致病菌，在许多水产动物如牙鲆(Paralichthys olivaceus)[23]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[24]、鲢(Hypophthalmichthys Molitrix)[25]、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)[26]等鱼类疾病中都有报道。而水产动物希瓦氏菌的感染防治研究较少，主要是一些抗生素的药敏实验，研究表明氯霉素对希瓦氏菌的消毒效果较好[26]。肉座菌科常见于腐烂的植物和肥料[27]中，是一种分布较为广泛的真菌。Kawaroe等[28]报道了一种从海水中发现的肉座菌科的真菌可以产生琼脂酶，能分解大型海藻，目前暂无有关其引起水生动物病症的报道。曲霉菌是引起多种物质霉腐的主要微生物之一，多见于家禽类疾病的致病源，在水生动物[29]中也有相关报道，对人体健康有害，防治措施有物理防治，如紫外灯照射[29]等；药物防治，如用2.5%福尔马林消毒[30]等。
细菌、真菌感染病使得鲎卵和幼体发育过程出现较高死亡率，治疗方法也仍处在研究阶段。Shinn等[31]发现美洲鲎(Limulus polyphemus)幼体鳃部一种与掌状聚缩虫(Zoothamnium duplicatum)形态相似的原生动物，对幼体进行了淡水浴、次氯酸钠浴、福尔马林浴等一系列消毒处理，认为淡水浴1 h (含10 mg/L氯)能够有效提高幼鲎存活率，抑制表面原生生物的生长。廖永岩等[32-35]采用高锰酸钾、二氧化氯、敌百虫、氯氟氰菊酯等消毒液对中国鲎1龄幼体开展急性毒性实验研究，得出了相关消毒液的安全浓度。然而高锰酸钾属于易爆管制药品，敌百虫和氯氟氰菊酯需要凭借执业兽医处方才能购买使用，而且上述消毒液仅有对1龄幼鲎的半致死浓度和安全浓度，实际用于养殖的有效浓度尚未明确。因此需要寻找一种安全有效的消毒方法，用于杀灭鲎卵或幼体体表常见病原，以提高鲎人工繁殖生产过程中鲎卵孵化率和幼鲎存活率。
3.3 溴氯海因对鲎卵孵化效果和1龄幼鲎病菌防治的可行性溴氯海因是一种安全有效的广谱杀菌剂，已广泛应用于水产养殖过程中各环节的环境和生物体消毒[36-38]，其常用于预防水产动物细菌性或真菌性疾病，可以治疗由弧菌、真菌等病原微生物引起的出血、烂鳃、腐皮、肠炎等[36]。有学者研究了溴氯海因对水体中真菌孢子的消毒效果，发现其能够有效杀灭黑曲霉和黑青霉(P. polonicum)[39]，而曲霉菌正是感染鲎卵的主要病原之一。本研究表明，溴氯海因对中国鲎1龄幼体作用72 h、84 h和96 h半致死浓度分别为1032.78 mg/L、984.00 mg/L和945.06 mg/L，远高于溴氯海因对水产养殖甲壳类物种作用的半致死浓度[40-41]，例如罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) 24 h 的LC50为2.97~5.52 mg/L, 48 h的LC50为2.76~ 5.31 mg/L[40]。说明中国鲎1龄幼体对溴氯海因不敏感，该药剂比较安全。中国鲎对其他消毒剂耐受性也比较高，如廖永岩等[32]研究了高锰酸钾对中国鲎1龄幼体的急性毒性实验，得到96 h的半致死浓度为377.973 mg/L，而梁华芳等[42]研究了高锰酸钾对中国龙虾(Panulirus stimpsoni)的24、48、72和96 h的LC50分别是4.49、4.44、4.39和4.22 mg/L。鲍虞园等[43]研究了Hg2+对中国鲎幼体的急性毒性效应及安全浓度，发现Hg2+对中国鲎幼体的毒性类型为急性II。可见中国鲎1龄幼体具有较强耐受特性，其具体机制有待进一步研究。
浓度过高的药物处理会对幼鲎造成危害。幼鲎会因为吸收过多的溴氯海因而导致书鳃上有灰白色物质富集，与西杂鲟(♂Acipenser baerii× ♀Acipenser schrenckii)幼鱼[44]溴氯海因中毒后鱼体发白相似。本研究结果表明，溴氯海因浓度在436.52 mg/L及以下时，幼鲎均能存活，与对照组无显著差异。溴氯海因浓度高于436.52 mg/L时幼鲎存活率受到影响。在后续恢复过程中，当溴氯海因浓度高于645.65 mg/L时，幼鲎中毒不可逆，死亡率高。本研究通过实验确定了溴氯海因对中国鲎1龄幼体的安全浓度为94.51 mg/L，在安全浓度范围内可以用于鲎卵孵化、幼鲎的培育等养殖环节。
安全浓度下溴氯海因对鲎卵和1龄幼鲎的实际消毒效果研究表明，在溴氯海因浓度为30~ 90 mg/L时，鲎卵孵化率显著提高，鲎卵和1龄幼鲎的死亡率(感染率)相较于对照组和低浓度组 (10 mg/L)显著下降。因此确定30~90 mg/L的溴氯海因浓度为中国鲎卵和幼体消毒的安全有效消毒浓度。从安全用药和防止滥用角度，建议溴氯海因在鲎卵孵化阶段的使用浓度为30~60 mg/L，具体浓度可视鲎卵的感染情况而定，感染情况不严重时，可使用较低浓度消毒。孵化期间每两天消毒一次，浓度30 mg/L；出现感染个体时及时挑出并换水，然后每天消毒换水，溴氯海因浓度提高到60 mg/L。此外，在实际生产中，不同环境条件下渔药的毒性有所差异，用药时长和动物的体质差异等因素也可导致使用效果与预期不符[45]，因此在养殖过程中，应密切观察鲎卵和幼鲎的状态，根据具体情况合理调整溴氯海因浓度，合理用药。而且，消毒剂的混用是处理多种细菌、真菌感染病症比较有效的措施[46]，后续将结合各种消毒方式如淡水浴等，进一步研究不同消毒剂如高锰酸钾、聚维酮碘等常用水产消毒剂与溴氯海因混用对中国鲎鲎卵孵化和幼体培育的效果。
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