2023, Vol. 30 
表1(Table 1)
2. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004
2. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China
苏丹鱼(Leptobarbus hoevenii)学名何氏细须鲃，属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲃亚科(Barbinae)、细须鲃属(Leptobarbus)，原产于马来西亚、印度尼西亚、老挝、婆罗洲等淡水水域，是马来西亚高端的野生食用河鱼[1]。苏丹鱼体形狭长，体表呈银白色，鳍条略带红色，吻部有两对胡须，常栖息在水底层，嗜跳跃，为杂食性鱼类，适宜的生长水温是15~30 ℃。苏丹鱼肉质细嫩，无鱼腥味，腹内没有黑膜，口感较好，且生长速度较快，体长5 cm的鱼苗养殖4个月可达到每尾0.5 kg，养殖两年可达到每尾1.5~2 kg的成鱼规格。2001年，苏丹鱼首次由浙江省淡水水产研究所引入国内，因其肉质鲜美、适应性强、易于饲养等特点，现已成为国内一个新的养殖品种，养殖效益可观。苏丹鱼具有较高的经济价值和良好的水产养殖前景，但现有养殖群体一直以来未经选育，已出现种质退化现象，因此需要开展苏丹鱼的遗传育种研究。了解物种的遗传学特征是开展种质创新、种质资源保护、品种选育的前提。目前，仅见苏丹鱼形态发育[2]、繁殖性能[3-4]、饲料配比[5-7]、人工养殖[8]和运动生理[9]等方面的相关报道，未见细胞学、分子生物学的遗传特征相关研究。本研究对其染色体核型及线粒体16S rRNA基因进行比对研究分析，旨在为苏丹鱼种质资源开发利用、遗传育种的提供理论参考。
染色体是遗传物质的主要载体，研究染色体核型有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制，对物种分类、遗传育种和种质保护等均有重要作用[10-11]。染色体核型分析技术已广泛应用于水产动物研究中，包括石斑鱼(Epinephelus)[12]、黄带拟鲹(Pseudocaranx dentex)[13]、刀鲚(Coilia nasus)[14]、贝类[15-16]、水生节肢动物[17-18]等。鲃亚科鱼类的系统分类及种属间的亲缘关系历来是学者们感兴趣的研究课题，目前已有对光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)[19]、中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)[20]、大鳞鲃(Luciobarbus capito)[21]等鲃亚科鱼类核型特征的分析研究。前人结果表明，鲃亚科鱼类存在染色体进化类型2n=48、2n=52和2n=96、2n=98。此外，朱新平等[22]于1990年报道何氏细须鲃(Leptobarbus hoevenii)的染色体数目和核型，但鱼类中存在较多的染色体多态现象，因此，仍需进行现有种群的染色体核型进行分析。
线粒体16S rRNA基因序列高度保守、结构简单，其一个基因片段包含了种间乃至科间的进化信息，是常见的DNA条形码基因[23-25]，已被广泛应用于水产动物遗传多样性评估、系统进化和种类鉴定等领域，如鳢科(Channidae)[26]、鰤属(Seriola)[27]、仿石鲈科(Haemulidae)[28]、鲍科(Haliotidae)[29]、长臂虾科(Palaemonidae)[30]等。鲃亚科是鲤科鱼类重要的一个分支，已有学者从其形态[31-32]、细胞学[33]和分子生物学[34-35]等领域分析了鲃亚科部分鱼类的系统进化，研究内容包括鱼类外部形态特征、染色体核型特征以及线粒体基因标记等，但以上研究均未涉及苏丹鱼线粒体16S rRNA基因。本研究以苏丹鱼为实验对象，阐述苏丹鱼的染色体核型特征和系统进化关系，以期为苏丹鱼的遗传学研究与种质资源鉴定、利用和保护等提供基础理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验鱼来源于广西壮族自治区水产科学研究院广西特色淡水鱼综合实验基地，实验鱼全长为15~20 cm，体重达80~150 g，养殖池塘面积约1500 m2，水温为26~28 ℃, pH为7.5~8.5，溶氧5 mg/L以上，氨氮含量为0.2 mg/L，亚硝酸盐含量0.002 mg/L。日投喂量为体重的0.5%，每日投喂2次，投喂时间为上午10:00和下午5:00。随机挑选5尾实验鱼用于下一步实验。
1.2 染色体标本制备参照林义浩[36]PHA体内注射法，制作苏丹鱼头肾组织的染色体标本。
预处理 实验鱼按10 μg/g的剂量胸腔注射植物血球凝集素PHA (Solarbio)，暂养24 h，再次胸腔注射3.5 μg/g剂量的秋水仙素(Solarbio)，暂养3 h，将实验鱼剪掉鳃部及尾部放血20 min，使用的实验用品均提前消毒。
制备头肾细胞悬液 采集实验鱼头肾组织，放置在盛有少量生理盐水的培养皿中，反复扯散、清洗2~3遍。再用剪刀将头肾组织反复剪切约20 min，过滤至10 mL离心管中，用胶头滴管反复吹打均匀，制备细胞悬液备用。
低渗 将制备好的细胞悬液置于离心机(BECKMAN COULTER, Allegra X-30R Centrifuge)中，1000 r/min离心8 min，弃上清；加入8 mL浓度为0.075 mol/L的KCl低渗液，置于预热至37 ℃的水浴锅中低渗处理30 min，随后1000 r/min离心8 min，弃上清。
固定在低渗保留的细胞悬液中，加入8 mL现配的卡诺氏固定液(V甲醇∶V冰醋酸=3∶1)，常温放置30 min，随后1000 r/min离心8 min，弃上清，此过程再重复两次。
制片 采用冷滴片法制作切片，按照快速Giemsa染液试剂盒(Solarbio)说明进行染色，染色时间为10 min，超纯水缓慢冲洗，自然干燥后镜检并拍摄。
1.3 染色体核型分析选取分散良好、形态清晰的染色体中期分裂像在油镜下(上海永亨XSP-2CA)进行观察、拍照。利用Adobe Photoshop 2020软件统计染色体数目，利用Image J软件计算染色体的相对长度和臂比。依据Levan等[37]的方法确定染色体类型划分标准如下：
中部着丝粒染色体(metacentric chromosomes, m)：臂比值1.0~1.7的染色体；
亚中部着丝粒染色体(submetacentric chromosomes, sm)：臂比值1.7~3.0染色体；
亚端部着丝粒染色体(subtelocentric chromosomes, st)：臂比值3.0~7.0的染色体；
端部着丝粒染色体(telocentric chromosomes, t)：臂比值7.0以上的染色体。
染色体的相对长度(%)=(实测染色体长度/全部染色体长度总和)×100%
臂比=长臂长度/短臂长
1.4 线粒体16S rRNA基因的提取、扩增与测序根据DNA提取试剂盒(OMEGA BIO-TEK)说明，提取实验鱼鳍条组织DNA。利用Primer- Premier5软件设计引物。其中，正向引物为16S-F: 5ʹ−GAAAGCGTTAAAGCTCAGAC−3ʹ，反向引物为16S-R: 5ʹ−TTTGACGTGGTTGAAGTT TG−3ʹ。
PCR反应体系共50 μL，包括：模板DNA 3 μL，上下游引物各2 μL, PCR酶25 μL，超纯水18 μL。PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共循环35次；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，运用SeqMan软件对扩增序列进行剪切、拼接。
1.5 系统进化分析从GenBank下载鲃亚科10属13个物种的线粒体16S rRNA基因序列，将下载序列与本研究测定的序列一并利用MEGA X软件进行分析。运用Clustal W方法进行多重序列比对，去除首尾两端的冗余序列，运用Kimura-2-parameter模型计算遗传距离，以斑马鱼(Danio rerio)为外类群，采用最大似然法(maximum likelihood, ML)构建鲃亚科物种系统进化树，采用Bootstrap法分析(1000个循环)检验进化树节点的置信度。
2 结果与分析 2.1 苏丹鱼染色体数目筛选分散良好、形态清晰的染色体中期分裂相100个，统计染色体数目，结果见表1。实验结果表明，染色体数目为50条的分裂相最多，达77个，占比是77%，染色体数目为46、47、48、49的分裂相占比分别为4%、3%、7%、9%，由此确定苏丹鱼二倍体染色体众数为2n=50。
2.2 苏丹鱼染色体核型选取5个形态清晰、分散良好的中期分裂相进行分析(图1、图2)，测量染色体的实际长度，并计算其相对长度和臂比(表2)。实验结果表明，苏丹鱼二倍体染色体组的核型公式为：16m+28sm+ 4st+2t, NF=94。包含中部着丝粒染色体(m) 8条、亚中部着丝粒染色体(sm) 14条、亚端部着丝粒染色体(st) 2条和端部着丝粒染色体(t) 1条。绘制染色体核型模式图(图3)，由图3可知，编号为9、10、11的染色体相对长度较大，分别为5.59±0.30、5.43±0.65、5.02±0.16，核型均为sm型，编号为25的染色体相对长度最小，为2.55±0.03，核型为t型。
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表1 苏丹鱼染色体中期分裂相统计 Tab. 1 Statistical table of the mid chromosome division phase in Leptobarbus hoevenii |
07-0821-10-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 苏丹鱼染色体中期分裂相 Fig. 1 Metaphase division phase of Leptobarbus hoevenii |
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图2 苏丹鱼染色体核型图 Fig. 2 Chromosome karyotype of Leptobarbus hoevenii |
07-0821-10-F003.jpg "点击查看原图") |
图3 苏丹鱼染色体核型模式图 Fig. 3 Chromosome karyotype pattern diagram in Leptobarbus hoevenii |
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表2 苏丹鱼染色体相对长度及臂比 Tab. 2 Relative length and arm ratio of metaphase chromosome of Leptobarbus hoevenii |
经过PCR扩增和序列测定，获得苏丹鱼线粒体16S rRNA基因片段592 bp，碱基A、T、G、C含量分别为37.5%、19.6%、18.6%、24.3%, A+T的含量(57.1%)高于G+C的含量(42.9%)。从GenBank下载13种鲃亚科鱼类线粒体16S rRNA基因序列，将下载序列与测序序列的碱基组成列于表3。由表3可知，14种鲃亚科鱼类线粒体16S rRNA基因片段中A、T、G、C的平均含量分别为35.9%、19.6%、19.2%、25.3%, A+T含量均大于G+C含量，其中，光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)的A+T含量最大，达57.5%，苏丹鱼的A+T含量排第二。
2.4 鲃亚科种间遗传距离分析基于Kimura-2-parameter模型，计算鲃亚科鱼类线粒体16S rRNA基因序列的种间遗传距离列于表4。14种鲃亚科鱼类的种间遗传距离为0.016~ 0.134，平均遗传距离达0.074。苏丹鱼与其余鲃亚科鱼类的种间遗传距离为0.090~0.134，平均遗传距离为0.110。苏丹鱼与粗须白甲鱼(Onychostoma barbata)种间遗传距离最大(0.134)，与泰国短吻鱼(Sikukia stejnegeri)的种间遗传距离最小(0.090)。
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表3 14种鲃亚科鱼类16S rRNA基因序列的碱基组成 Tab. 3 Base composition of 16S rRNA gene sequences of 14 species in Barbidae |
运用最大似然法(maximum likelihood, ML)，基于General Time Reversible模型构建鲃亚科11属14种鱼类的系统进化树，结果如图4所示。进化树由2大分支构成，其中，白甲鱼属(Onychostoma)、裂峡鲃属(Hampala)、结鱼属(Tor)、亮鲃属(Luciobarbus)、倒刺鲃属(Spinibarbus)构成CladeⅠ分支；短吻鱼属(Sikukia)、长臀鲃属(Mystacoleucus)、方扣鲃属(Cosmochilus)、吻孔鲃属(Poropuntius)构成CladeⅡ分支；苏丹鱼和墨脱四须鲃(Barbodes hexagonlepis)位于进化树的根部，不与其他物种聚类。
3 讨论 3.1 苏丹鱼染色体标本制备选择适宜的材料是获得良好染色体标本的前提，本研究以分裂增殖旺盛的头肾组织细胞为材料，利用PHA-秋水仙素体内注射法获得了大量较清晰的苏丹鱼染色体中期分裂相。经过反复摸索，确立了制备染色体中期分裂相的最佳剂量和时间，PHA和秋水仙素的最佳处理剂量分别为10 µg/g、3.5 µg/g，作用时间分别为24 h、3 h。测量及制图软件能有效提高实验的效率和准确性，实验数据与传统的人工测量相比更可靠[21]。本研究运用Image J软件及Photoshop软件测量染色体的体臂长度，并绘制染色体核型图，获得苏丹鱼二倍体的染色体数目为2n=50，核型公式为：16m+28sm+4st+2t, NF=94。然而，据朱新平等[22]于1990年报道，何氏细鲃鱼染色体核型为16m+ 30sm+2st+2t, NF=96，与本研究结果存在差异，推测是使用了不同的地理隔离种群制作染色体切片、运用软件测量及制图等原因所致。
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表4 14种鲃亚科鱼类16S rRNA序列种间遗传距离 Tab. 4 Interspecific genetic distances of 16S rRNA sequences of 14 species in Barbidae |
07-0821-10-F004.jpg "点击查看原图") |
图4 基于线粒体16S rRNA序列构建的鲃亚科部分鱼类ML系统进化树 Fig.4 Phylogenetic tree (ML) of several species in the subfamily Barbinae based on mitochondrial 16S rRNA sequences |
硬骨鱼类的染色体基数为24或25，经历了染色体加倍事件后，形成2n=48和2n=50两种主要核型，再经倍体化、基因重组、罗伯逊易位等形成现今的多种核型，鲤科鱼类最原始的核型是2n=50，核型2n=100可能由多倍体演化而来，2n=48和2n=52的类型则通过罗伯逊易位演化而来，鲃亚科鱼类的原始核型被认为是2n=50[37-38]。本研究结果显示，苏丹鱼染色体数目为2n=50，具有鲃亚科的原始核型特征。未发现苏丹鱼存在明显的异形性染色体。苏丹鱼和部分鲃亚科鱼类的染色体数目和核型公式列于表5。由表可知，鲃亚科鱼类的染色体有2n=50和2n=100两种类型，说明鲃亚科鱼类的演化主要分为两种方式，一是通过多倍体化(2n=100、2n=96)，增加染色体数目和体臂数，提高适应环境变化和演化的能力；二是通过基因和染色体重组，减少端部(t)和亚端部(st)着丝粒染色体数量，相应增加中部(m)和亚中部(sm)着丝粒染色体数量，从而增加染色体臂数(NF)，增加适应环境变化和演化的能力。李树深[39]将特定的分类种群下，端部(t)和亚端部(st)着丝粒染色体较多的类群称为原始类群，其染色体结构在演化过程中变化不大，与原始核型较为相似；中部(m)和亚中部(sm)着丝粒染色体较多的类群称为特化类群，在演化过程中染色体产生了较大程度的变化。本研究结果表明，苏丹鱼中部(m)和亚中部(sm)着丝粒染色体数量较多，属于鲃亚科中的特化类群。小岛吉雄[40]依据真骨鱼类的系统演化关系，将真骨鱼类分为低位、中位、高位3种演化类群，端部着丝粒染色体(t)较多、体臂数较少的类群处于系统演化的高位，反之则处于低位。本研究结果表明苏丹鱼染色体核型为2n=16m+28sm+4st+2t，中部(m)和亚中部(sm)着丝粒染色体数量较多，属于典型的低位类群。
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表5 几种鲃亚科鱼类染色体核型的比较 Tab. 5 Comparison of karyotypes of several species in the subfamily Barbidae |
综上所述，苏丹鱼在真骨鱼类的系统演化中属于低位类群，在鲃亚科中属特化类群。
3.3 苏丹鱼16S rRNA基因系统进化分析线粒体16S rRNA基因是非编码蛋白质基因，由于其大部分区域发生的变异为中性突变，进化速度大于细胞核，因此，常被用于鱼类系统进化研究。目前，已有鲹科(Carangidae)[46]、鲳亚目(Stromateoidei)[47]、鲤形目(Cypriniformes)[48]、南极鱼科(Notothenioidei)[49]等鱼类线粒体16S rRNA基因系统进化分析的相关报道。利用进化速率稳定、结构存在差异的线粒体基因构建进化树，可直观地反映不同物种的系统发育关系。本研究获得线粒体16S rRNA基因片段592 bp, A、T、G、C含量分别为37.5%、19.6%、18.6%、24.3%, A+T的含量(57.1%)高于G+C含量(42.9%)，具有明显的AT偏好性。14种鲃亚科鱼类的16S rRNA基因片段中存在39个变异位点，保守位点占比93.17%，表明16S rRNA基因片段保守性较高，可应用于鲃亚科系统进化分析。
形态学研究发现鲃亚科的演化途径为四须鲃→二须鲃→无须鲃，再演化至其他分支，其中，四须鲃属是鲃亚科较早分化的种群[31]。对鲃亚科11属14种鱼类进行遗传距离分析及系统进化分析，结果表明：苏丹鱼和墨脱四须鲃位于系统进化树的基部，不与其他物种聚类；结合遗传距离分析，苏丹鱼、墨脱四须鲃与其余物种的种间遗传距离分别为0.090~0.134、0.079~0.130，大于平均种间遗传距离0.074。因此，本研究结果支持形态学上四须鲃属最先分化的观点。同时，系统进化树结果显示本研究的实验对象苏丹鱼与四须鲃属的亲缘关系较近，同样属于较早分化的类群，与形态学上两者均具有四条胡须的特征相符合。
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